Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lentiviral medieret levering af shRNA'er til hESC'er og NPC'er ved hjælp af billig kationisk polymer polyethylenimin (PEI)

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63953
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

Summary

Ved hjælp af den billige kationiske polymer polyethylenimin (PEI) producerede vi lentivirale partikler til stabil ekspression af shRNA'er i H9 humane embryonale stamceller (hESC'er) og forbigående transducerede H9-afledte neurale stamceller (NPC'er) ved høj effektivitet.

Abstract

Den nuværende protokol beskriver brugen af lentivirale partikler til levering af korte hårnåle RNA'er (shRNA'er) til både humane embryonale stamceller (hESC'er) såvel som neurale stamceller (NPC'er) afledt af hESC'er med høj effektivitet. Lentivirale partikler blev genereret ved co-transfektering af HEK293T-celler ved anvendelse af indgangsvektorer (bærende shRNA'er) sammen med emballageplasmider (pAX og pMD2.G) ved anvendelse af den billige kationiske polymerpolyhypetin (PEI). Virale partikler blev koncentreret ved hjælp af ultracentrifugering, hvilket resulterede i gennemsnitlige titere over 5 x 107. Både hESC'er og NPC'er kan inficeres ved høje effektivitetsgevinster ved anvendelse af disse lentivirale partikler, som det fremgår af puromycinudvælgelse og stabil ekspression i hESC'er samt forbigående GFP-ekspression i NPC'er. Desuden viste western blot-analyse en signifikant reduktion i ekspressionen af gener målrettet af shRNA'er. Derudover bevarede cellerne deres pluripotens såvel som differentieringspotentiale, som det fremgår af deres efterfølgende differentiering i forskellige slægter af CNS. Den nuværende protokol omhandler levering af shRNA'er; Den samme fremgangsmåde kan imidlertid anvendes til ektopisk ekspression af cDNA'er til overekspressionsundersøgelser.

Introduction

Humane embryonale stamceller (hESC'er) afledt af blastocystens indre cellemasse er pluripotente og kan differentieres i forskellige celletyper afhængigt af eksterne faktorer under in vitro-betingelser 1,2. For fuldt ud at udnytte potentialet i hESC'er er det bydende nødvendigt at have hurtige og pålidelige genleveringsmetoder til disse celler. Konventionelt kan de anvendte teknikker groft klassificeres i to typer: ikke-miljømæssige og virale genleveringssystemer 3,4. De mere hyppigt anvendte ikke-miljømæssige genleveringssystemer er fedtsugning, elektroporation og nukleofsektion. Ikke-miljømæssige leveringssystemer er fordelagtige på grund af færre indsættelsesmutationer og et generelt fald i immunogenicitet 5,6. Disse metoder resulterer imidlertid i lav transfektionseffektivitet og en kort varighed af forbigående genekspression, hvilket er en væsentlig begrænsning for langtidsdifferentieringsundersøgelser7. Elektroporation resulterer i bedre transfektionseffektivitet sammenlignet med fedtsugning; det resulterer dog i mere end 50% celledød 8,9,10. Ved hjælp af nukleofsektion kan celleoverlevelses- og transfektionseffektiviteten forbedres ved at kombinere fedtsugning og elektroporation, men tilgangen har brug for cellespecifikke buffere og specialudstyr og bliver således ret dyr for opskalerede applikationer11,12.

I modsætning hertil har virale vektorer vist forbedrede transfektionseffektiviteter såvel som generelt lav cytotoksicitet efter transduktion. Derudover udtrykkes de leverede gener stabilt og gør derfor denne metode ideel til langtidsstudier13. Blandt de mest almindeligt anvendte virale vektorer til genlevering til hESC'er er lentivirale vektorer (LVS), som kan give mere end 80% transduktionseffektivitet ved hjælp af virale partikler med høj titer14,15. Fedtsugning og CaPO 4-udfældning er blandt de mest almindeligt anvendte metoder til forbigående transfektion af HEK293T-celler eller dets derivater med genoverførselsvektorer sammen med emballageplasmider for at give lentivirale partikler16. Selvom fedtsugning resulterer i god transfektionseffektivitet og lav cytotoksicitet, hæmmes teknikken af dens omkostninger, og opskalering for at få høje titer lentivirale partikler ville være meget dyrt. CaPO 4-udfældning resulterer i relativt lignende transfektionseffektiviteter som dem, der opnås ved hjælp af fedtsugning. Selvom det er omkostningseffektivt, resulterer CaPO 4-udfældning i betydelig celledød efter transfektioner, hvilket gør det vanskeligt at standardisere og undgå batch-til-batch-variationer17. I dette scenarie er udvikling af en metode, der giver høj transfektionseffektivitet, lav cytotoksicitet og omkostningseffektivitet afgørende for produktionen af høje titer lentivirale partikler, der skal anvendes i hESC'er.

Polyethylenimin (PEI) er en kationisk polymer, der kan transfektere HEK293T-celler ved høj effektivitet uden meget cytotoksicitet og har en ubetydelig omkostning sammenlignet med fedtsugningsbaserede metoder18. I denne situation kan PEI anvendes til opskalerede anvendelser af høj titer LVS-produktion gennem koncentrationen af lentivirale partikler fra kultursupernatanter ved hjælp af forskellige teknikker. Den præsenterede artikel beskriver brugen af PEI til at transfektere HEK293T-celler og lentiviral vektorkoncentration ved anvendelse af ultracentrifugering gennem en saccharosepude. Ved hjælp af denne metode opnår vi regelmæssigt titere langt over 5 x 107 IE / ml med lave batch-til-batch-variationer. Metoden er enkel, ligetil og omkostningseffektiv til opskalerede applikationer til genlevering til hESC'er og hESC-afledte celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transfektion af HEK293T-celler ved hjælp af enten PEI- eller Lipofectamine 3000-reagens

  1. Dyrkning HEK293T celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin ved 37 ° C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2 , indtil de er 90% sammenløb før såning til transfektion. Brug et relativt lavt antal celler til produktion af høj titervirus (ideelt set mindre end P30).
  2. Frø 4 x 106 celler i 10 ml komplet vækstmedium i en 100 mm vævskulturplade og vokse natten over i en befugtet vævskulturinkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2.
  3. For hver transfektion fortyndes plasmid-DNA (1 mg/ml lagre) i 1 ml serumfrie DMEM-medier i 1,5 ml centrifugerør under anvendelse af følgende forhold mellem indgangs- og emballageplasmider:
    Indgangsvektor = 10 μg
    psPAX2,0 = 7,5 μg
    pMD2.G = 5 μg
  4. Vortex i 10 s og drej røret ved 10.000 x g i 30 s ved stuetemperatur for at samle.
  5. Der tilsættes 70 μL (1 mg/ml stamopløsning) PEI til røret, og hvirvel og spin kort som beskrevet ovenfor for at opsamle. Volumenet af PEI, der anvendes, er baseret på et 1: 3-forhold mellem total DNA (μg) :P EI (μg).
  6. Til lipofectaminbaseret transfektion fortyndes ovennævnte vektorer i 500 μL serumfrie DMEM-medier indeholdende 45 μL reagens P, der leveres i sættet, og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter.
  7. 70 μL reagens L, der leveres i sættet, fortyndes ved hjælp af 500 μL serumfrit DMEM-medie, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
  8. Kombiner indholdet af begge rør og inkuber rørene ved stuetemperatur i 20 minutter for at tillade kompleks dannelse.
  9. Dråbevis tilsættes 1 ml DNA /PEI eller 1 ml DNA / lipofectaminkomplekser til pladen indeholdende celler og inkuberes i 6 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2.
  10. Efter 6 timer skiftes til friske komplette vækstmedier (10 ml) og cellerne returneres tilbage til den befugtede inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2.

2. LVS-indsamling og ultracentrifugering

  1. Efter 2 dages transfektion opsamles det virusholdige medie og overlejres cellerne igen med 10 ml friske komplette vækstmedier.
  2. Efter 3 dages transfektion skal du indsamle det virusholdige medie og kombinere det med det virusholdige medie, der er indsamlet på 2-dages tidspunktet.
  3. Centrifuger den virale supernatant ved 2.000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pelletere celleaffald.
  4. Supernatanten filtreres ved hjælp af et 0,45 μm porestørrelse lavt proteinbindingsfilter (enten PES eller SFCA) og opbevares ved 4 °C, indtil det er klar til ultracentrifugering. Det filtrerede supernatant indeholdende lentivirale partikler kan opbevares ved 4 °C i 5 dage uden et signifikant tab i virale titere.
  5. Steriliser de ultracentrifuge rør, der holder kopper ved at vaske dem med 70% ethanol i 10 minutter, lufttørre, lukke og holde ved 4 ° C.
  6. Der tilsættes 36 ml filtreret medie indeholdende lentivirale partikler til et sterilt ultracentrifugerør.
  7. 5 ml steril stripette fyldes med 4 ml steril 20% saccharoseopløsning (fremstillet i PBS), og den hældes helt ned i bunden af det ultracentrifugerør (UC), der indeholder LVS. Det er vigtigt, at saccharoseopløsningen ikke blandes med mediet og danner en gradient i bunden af røret.
  8. Balancer alle ultracentrifugerørene ved hjælp af serumfrie DMEM-medier, læg dem i de kolde ultracentrifugerør, der holder kopper, og luk lågene.
  9. Rørene drejes ved 125.000 x g i 2 timer ved 4 °C.
  10. Efter spin kasseres supernatanten forsigtigt ved at invertere indholdet af røret i en beholder indeholdende blegemiddel uden at forstyrre pelleten. Marker pelleten, hvis den er synlig.
  11. Anbring ultracentrifugerøret i et 50 ml sterilt rør, og tilsæt 200 μL steril DPBS nøjagtigt øverst på pelleten. Opbevares uforstyrret ved 4 °C natten over.
  12. Den følgende dag blandes forsigtigt ved at pipettere op og ned 40x.
  13. Drej kortvarigt ved 13.000 x g i en bordpladecentrifuge for at pelletere eventuelt affald.
  14. Supernatanten overføres til et nyt rør, og viruspræparatet aliquots som 20 μL alikvoter. Opbevares ved −80 °C.
  15. 5 μL af præparatet afsættes til virale titermålinger.

3. LVS-titermåling for pLKO.1-baserede vektorer

  1. Bestem titeren af lentivirale partikler ved hjælp af en qPCR efter producentens anbefalinger.
  2. For en standardkurve skal der fremstilles fem 10 gange serielle fortyndinger af Standard Control DNA (tilvejebragt i sættet) ved at fortynde 5 μL DNA til 45 μL nukleasefri H2Oi hvert trin. Brug fortyndinger på 1:100 til 1:100.000 til at generere en standardkurve.
  3. Opsæt reaktioner på is i dubletter på følgende måde:
    2x qPCR master mix 10 μL
    Primer blanding 2 μL
    Prøve eller standard DNA 2 μL
    Nukleasefri H2O6μL
  4. Udfør qPCR ved hjælp af de cykelforhold, der er nævnt i manualen til sættet i i alt 35 cyklusser.
  5. Plot cyklustærskelværdier (Ct) på Y-aksen vs. virustitre på X-aksen.
  6. Generer en logaritmisk regression ved hjælp af fire standardkontrol-DNA-fortyndinger (1: 100 til 1: 100,000) for at bestemme den ukendte virusprøvetitre ved hjælp af en trendlinjeligning.

4. LVS-titermåling for pll3.7-baserede vektorer

  1. Frø 1 x 105 HEK293T celler i hver brønd af en P12-brøndplade i 1 ml komplet vækstmedie 24 timer før infektioner.
  2. Mediet suppleres med 8 μg/ml polybren og tilsættes 1 ml i hvert sterilt 1,5 ml rør.
  3. Fortynd de virale partikler ved anvendelse af 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL og 0,1 μL koncentrerede lentivirale partikler i hvert af de 1 ml polybrenholdige medier.
  4. Mediet fra HEK293T-celler erstattes med mediet, der indeholder angivne mængder lentivirale partikler sammen med 8 μg/ml polybren, og der inkuberes i 24 timer ved 37 °C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5 % CO2 og 21 %O2.
  5. Den næste dag skal du skifte til friske medier og fortsætte kulturen i 72 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2.
  6. Efter 72 timer vaskes cellerne med PBS, prøves ved 37 °C i henhold til producentens protokol, og der resuspenderes i 1 ml PBS.
  7. Udfør FACS-cellesortering ved hjælp af en cellesorterer efter producentens anbefalinger. Indstil porten til 0% GFP-positive celler ved hjælp af ikke-inficerede HEK293T-celler, og tæl 50.000 hændelser for hver prøve for at bestemme procentdelen af positive celler for hver viral fortynding.
  8. Brug kun de volumener af lentivirale partikler, der giver % GFP-positive celler i området 2% -20% til at beregne titeren af lentivirale partikler.

5. Infektion af hESC'er og stabil udvælgelse

  1. Cellerne vaskes med 2 ml PBS, der vokser i hver brønd i en 6-brønds cellekultur multiwell plade.
  2. Løsrive cellerne fra cellekulturpladen ved hjælp af 1 ml 1x celledissociationsreagens ved inkubation ved 37 ° C i 5 minutter.
  3. Cellerne opsamles i DMEM/F12-medier, og centrifuger ved 1.500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at opsamle cellepillen.
  4. Aspirere, resuspend cellerne i 1 ml, og tæl ved hjælp af et hæmocytometer.
  5. Lav en cellesuspension med 2 x 105 celler /ml komplet vækstmedie indeholdende mTeSR1 suppleret med 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), penicillin / streptomycin (P / S) og 10 μM ROCK Inhibitor (RI).
  6. Frø 1 x 105 celler på 50x fortyndet komplet kældermembranmatrixbelagte P24-brøndplader i 500 μL komplet vækstmedie og kultur cellerne ved 37 ° C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2.
  7. Den følgende dag inficeres hESC'er ved en multiplikation af infektion (MOI) på 10 med 8 μg / ml polybrene og inkuberes ved 37 ° C i 8 timer.
  8. Efter 8 timer erstattes det virusholdige medie med friske vækstmedier (-RI) og kulturen fortsættes, indtil cellerne er 90% sammenflydende.
  9. Start puromycin selektion (0,8 μg / ml), når cellerne når 90% sammenløb, hvilket normalt er 48-72 timer efter infektion.
  10. Når udvælgelsen er afsluttet (normalt 4-6 dage), opdeles de stabile celler (1:4) og cellerne udvides til kryopræservering og yderligere analyse.

6. Transduktion af H9-afledte neurale stamceller (NPC'er)

BEMÆRK: NPC'er blev afledt af H9-celler ved anvendelse af en dual-Smad-hæmningsprotokol, som beskrevet tidligere19.

  1. Kort fortalt behandles H9-celler med celledissociationsreagens ved 37 ° C i 5 minutter for at generere enkeltceller og resuspend i komplette vækstmedier indeholdende mTeSR1 suppleret med 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), penicillin / streptomycin (P / S) og 10 μM ROCK Inhibitor (RI). Frø på 1:50 fortyndede Matrigel-belagte 6-brønds cellekulturskåle med en tæthed på 60.000 celler / cm2 (dag 0).
  2. Initier differentiering, når cellerne når 95% -100% sammenløb ved at skifte til 100% KSR-medier indeholdende LDN193189 (200 nM) og SB431542 (10 μM) (dag1).
  3. På dag 2 skal du skifte medie igen med 100% KSR suppleret med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) og XAV939 (5 μM).
  4. På differentieringens dag 4 skal du skifte til en blanding af KSR-medium (75%) og N2-medium (25%) med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) og XAV939 (5 μM).
  5. Fra dag 6 til dag 12 skal du gradvist skifte mediet til 100% N2 suppleret med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) og XAV939 (5 μM) ved at øge N2-mediet 25% hver dag og skifte medie efter hver 2. dag.
  6. Kulturdag 12 NPC'er i N2:B27 medier suppleret med 20 ng/ml bFGF.
  7. Frø 2 x 105 celler i hver brønd af en 1:50 fortyndet komplet kældermembranmatrixbelagt P6-plade i 2 ml NPC-kulturmedier og inkuberes for at tillade cellerne at fastgøre.
  8. Den næste dag inficeres cellerne med lentivirale partikler ved en MOI 6 i nærværelse af 8 μg / ml polybren.
  9. Efter 8 timer udskiftes det virusholdige medie med friske NPC-vækstmedier.
  10. Den næste dag skal du gentage infektionerne og ændre medierne kl. 8.
  11. Opbevar cellerne i kultur i 72 timer før høst til yderligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter genoverførsel er det uundgåeligt nødvendigt med høj levedygtighed af hESC'er. På trods af indsatsen og optimeringen af protokoller for at reducere celledød efter elektroporation af hESC'er observeres der stadig mere end 50% celledød efter elektroporation af disse celler sammen med lav transfektionseffektivitet20. Lentiviral medieret genoverførsel resulterer ikke kun i høj effektivitet af genoverførsel, men viser også høje niveauer af cellelevedygtighed efter transduktion. Resultaterne nedenfor præsenterer to tilgange: den ene bruger GFP som reporter og forbigående ekspression i hESC-afledte NPC'er og den anden bruger puromycin til stabil udvælgelse af hESC'er til langsigtede differentieringseksperimenter.

I det første sæt eksperimenter blev lentivirale partikler produceret ved co-transfektering af shRNA'er, der bærer pll3.7-vektoren med GFP som reporter sammen med anden generations lentivirale emballageplasmider psPAX2.0 og pMD2.G. Lentivirale partikler blev opsamlet efter 48 timer og 72 timer efter transfektion og koncentreret ved hjælp af ultracentrifugering. Figur 1A viser det rigelige GFP-udtryk i HEK293T-celler efter 72 timers transfektion. Ekspressionen af virale proteiner resulterede også i syncytia-dannelse af HEK293T-celler, hvor enkeltceller smeltes sammen, som vist med pile i figur 1A. Titerne blev bestemt ved hjælp af FACS-analyse. Vi sammenlignede også de lentivirale titere ved hjælp af billige PEI- og Lipofectamine 3000-reagens og fandt ingen signifikant forskel mellem de to med hensyn til virale titere (figur 2A). Dernæst blev H9 hESC-afledte NPC'er inficeret to gange med disse GFP-holdige lentivirale partikler ved en MOI på 6 og høstet til analyse efter 72 h. Figur 1B viser markant ekspression af GFP i NPC'er efter infektion. Som diskuteret ovenfor er det for langsigtede differentieringseksperimenter bydende nødvendigt at have hESC'er, der stabilt udtrykker shRNA'er. I et forsøg på at skabe stabile cellelinjer, der udtrykker shRNA for forskellige gener, brugte vi plKO.1-baserede vektorer og klonede shRNA'er i henhold til producentens anbefalinger. Dernæst blev lentivirale partikler produceret som beskrevet ovenfor, og titere blev bestemt ved anvendelse af et kommercielt lentiviralt titermålesæt ved hjælp af qPCR-baserede metoder (figur 2B). hESC'er blev inficeret med lentivirale partikler ved en MOI på 10 og udvalgt ved hjælp af puromycinvalg. Figur 3 viser resultaterne af stabil udvælgelse af hESC'er efter transduktion. Efter 5 dages selektion med 0,8 μg/ml puromycin viste lentivirale transinficerede celler mere end 80% cellelevedygtighed sammenlignet med ikke-transducerede celler, hvor ingen celler overlevede behandlingen. Efter udvælgelsen blev de stabilt transducerede H9-celler yderligere udvidet, kryopræserveret og analyseret ved hjælp af western blot til analyse for effektiv gen knockdown.

I vores laboratorium har vi skabt flere stabile cellelinjer af H9 hESC'er, der udtrykker shRNA'er for forskellige gener ved hjælp af ovenstående tilgang. Her har vi præsenteret resultaterne af en af dem, som er L-2-hydroxyglutarat dehydrogenase (L2HGDH) genet ved hjælp af western blot analyse. Rigelig ekspression af L2HGDH observeres i celler transduceret med tom vektor rygrad. Der observeres imidlertid ingen ekspression af L2HGDH i celler transduceret med en vektorbærende shRNA'er for L2HGDH, hvilket viser effekten af den stabile generation af en H9 hESC-cellelinje med reduceret ekspression af L2HGDH, som kan anvendes til yderligere differentieringsundersøgelser (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Ekspression af GFP i HEK293T-celler og viralinficerede NPC'er. (A) shRNA'er blev klonet til en pll3.7-vektor med GFP som reporter og co-transficeret med emballageplasmider i HEK293T-celler ved hjælp af PEI. Det høje GFP-udtryk viser effektiv transfektionseffektivitet efter 72 timers transfektion. Pile indikerer syncytiadannelse i HEK293T-cellerne, hvor grupper af individuelle HEK293T-celler er smeltet sammen på grund af ekspressionen af virale proteiner. (B) H9-afledte NPC'er blev inficeret to gange ved en MOI på 6 med lentivirale partikler indeholdende GFP som indberetter, og GFP-ekspression blev observeret 72 timer efter infektion. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: LVS-titermålinger. (A) Virale titere til pll3.7-baserede vektorer blev målt ved hjælp af FACS-analyse ved at kvantificere % GFP-positive celler for de virale fortyndinger, der gav 2% -20% GFP-positive celler. (B) Virale titere til pLKO.1-baserede vektorer blev bestemt ved anvendelse af et kommercielt qPCR lentivirustitresæt efter producentens anbefalinger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Etablering af stabile shRNA-ekspressive H9 hESC-linjer. shRNA'er blev klonet til pLKO.1-baserede lentivirale vektorer, der bærer puromycin-selektionsgenet. H9 hESC'er blev inficeret med lentivirale partikler ved en MOI på 10 og udvalgt ved anvendelse af puromycin. Ved anvendelse af 0,8 μg/ml puromycin i 5 dage blev 100% af de ikke-inficerede celler dræbt, mens de fleste af cellerne overlevede behandlingen i den virusinficerede gruppe. Disse celler blev udvidet uden klonal selektion til kryopræservering og yderligere analyse. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: En repræsentativ western blot-analyse for stabil knockdown af L2HGDH-genet i H9 hESC'er. Samlede cellelysater fra negative kontrolceller (H9, puro uncut) samt celler, der stabilt udtrykker shRNA'er mod L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) blev udsat for western blot ved anvendelse af anti-L2HGDH-antistoffet. Som vist i figuren blev der ikke observeret noget udtryk for L2HGDH i H9 hESC'er, der stabilt udtrykker shRNA'er for L2HGDH. Et ikke-specifikt bånd blev observeret lige over det specifikke bånd svarende til den korrekte molekylvægt på 46-48 kDa (angivet med en trekant) for L2HGDH-antistoffet. Anti-GAPDH blev brugt som belastningskontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til genetisk at modificere stamceller til undersøgelse eller kliniske formål er begrænset både af teknologi og den grundlæggende forståelse af hESC'ernes biologi. Teknikker, der har vist et betydeligt potentiale i mus-ESC'er, såsom fedtsugning og elektroporation, er ikke særlig effektive for hESC'er, som er notorisk vanskelige for genlevering ved konventionelle metoder20. Dette begreb har ikke kun ført til optimering af eksisterende teknikker, men også til udvikling af nye metoder til øget transfektionseffektivitet i hESC'er. Fokus for disse nye udviklinger har været effektiv og stabil genlevering til hESC'er, samtidig med at der opretholdes minimal effekt på hESC'ernes vækst, pluripotens og differentieringspotentiale over længere perioder. Blandt de forskellige nye udviklinger, der opfylder disse strenge kriterier, er lentiviral medieret genoverførsel til hESC'er21,22. Til fremstilling af lentivirale partikler, der udtrykker et bestemt gen, klones det ønskede gen i en af overførselsvektorerne og transficeret i HEK293T-celler sammen med emballageplasmider for at høste en cellekultur supernatant indeholdende lentivirale partikler. For at blive brugt i hESC'er er det vigtigt at koncentrere disse virale partikler ved hjælp af forskellige teknikker til at give høje titere af vira i det mindste i området 1 x 107-1 x 108 IE / ml. Generelt er store mængder LVS koncentreret fra 200x-500x det oprindelige volumen for at opnå disse titere. Dette betyder, at brug af en yderst omkostningseffektiv metode uden at gå på kompromis med transfektionseffektiviteten i HEK293T-celler er en forudsætning for, at disse metoder rutinemæssigt kan anvendes i laboratoriet. Den nuværende metode beskriver brugen af den kationiske polymer PEI som en omkostningseffektiv metode til fremstilling af store mængder LVS med en transfektionseffektivitet svarende til fedtsugningsbaserede metoder, der betragtes som guldstandard. Ved hjælp af den præsenterede metode kan vi få gennemsnitlige LVS-titere langt over 5 x 107 IE / ml efter en koncentrationsfaktor på 200x det oprindelige volumen. Ved hjælp af disse LVS-partikler har vi været i stand til at etablere flere stabile cellelinjer af H9 hESC'er, der udtrykker shRNA'er for flere gener ved at inficere cellerne ved høje MOU'er. Metoden, der præsenteres her, omgår brugen af kedelige og tidskrævende metoder til klonal selektion og ekspansion, mens den stadig får knockdown-effektivitet tæt på 100%, som det fremgår af et af de repræsentative western blot-resultater for L2HGDH-gen knockdown i figur 4. Følgende er nogle af anbefalingerne til en vellykket tilgang.

Brug af et lavt passageantal HEK293T-celler er påkrævet (ideelt under 30) til høje virale titere. Sammenløbet af HEK293T-celler er en anden vigtig faktor i denne henseende. HEK293T-celler skal være mindst 80% sammenløbende før transfektion, da celle-cellekontakt i høj grad reducerer cytotoksiciteten og forbedrer virusproduktionen. De anvendte vektorer skal fremstilles ved hjælp af endotoksinfri plasmidisoleringssæt efterfulgt af ethanoludfældning og rekonstitueres i en koncentration på mindst 1 mg/ml inden anvendelse til transfektion. Der kan være batch-til-batch variationer af PEI-opløsninger fremstillet på forskellige datoer. Derfor skal hvert parti PEI-opløsning først testes for ydeevne ved hjælp af GFP-vektorer, og opløsningen skal opbevares ved -20 °C i alikvoter til engangsbrug for at undgå gentagne fryse-optøningscyklusser. For høje titere anbefales indsamling af LVS supernatant efter 72 h transfektion af HEK293T-celler kun, forudsat at cellerne er sunde og fastgjort. Filtrering af den LVS-holdige supernatant øger opløseligheden af LVS efter ultracentrifugering kraftigt. Det anbefales ikke at opbevare LVS-supernatanten ved 4 °C i mere end 5 dage, da det vil resultere i en betydelig reduktion af virustitre. Saccharosegradient under ultracentrifugering er nødvendig for optimale titere. Temperaturerne skal holdes tæt på 4 °C under alle trin i ultracentrifugering. Overnight inkubation af koncentrerede LVS partikler i DPBS er nødvendig for fuldstændig resuspension. Centrifugering efter resuspension af LVS fjerner cellulært affald (hvis nogen), da det kan forårsage cytotoksicitet, når det anvendes på målceller. Efter infektion af H9-celler er det vigtigt at erstatte det virusholdige medie med friske vækstmedier efter 8 timer, da langvarig inkubation med virussen ville resultere i signifikant celledød af H9 hESC'erne. Puromycinvalget bør kun startes, når sammenløbet er mere end 80%.

Metoden beskrevet ovenfor blev oprindeligt tilpasset til ekspression af shRNA'er. En lignende tilgang kunne anvendes til ektopisk ekspression af cDA'er, der skal klones til ekspressionsvektorer. En væsentlig begrænsning af lentiviral medieret genlevering er imidlertid størrelsesbegrænsningen. Efterhånden som størrelsen øges, er emballagen af lentivirale vektorer ikke optimal, hvilket resulterer i reducerede virale titere23. Fremtidig forskning bør rettes mod at optimere protokollen for at overvinde disse begrænsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra De Forenede Arabiske Emiraters Universitet (UAEU), bevilling # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) og # 12R010 (UAEU-AUA-tilskud). Vi takker professor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) for at hjælpe os med at redigere manuskriptet til stil og grammatik.

Alle data er tilgængelige efter anmodning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Invitrogen 31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes Beckman Coulter C14292
Accutase Stem Cell Technologies 7920
bFGF Recombinant human Invitrogen PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V Invitrogen 15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234
Cyclopamine Stem Cell Technologies 72074
DMEM media Invitrogen 11995073
DMEM Nutrient mix F12  Invitrogen 11320033
DPBS w/o: Ca and Mg PAN Biotech P04-36500
Fetal bovie serum Invitrogen 10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody CST 2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution GE healthcare SH30238.01
L Glutamine, 100X  Invitrogen 2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody Proteintech 15707-1-AP
L2HGDH shRNA Macrogen Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit Thermo Fisher L3000001
mTesR1 complete media Stem Cell Technologies 85850
Neurobasal medium 1X CTS Invitrogen A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x PAN Biotech P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x PAN Biotech P07-07200
Penicillin streptomycin SOL Invitrogen 15140122
pLKO.1 TRC vector Addgene 10878
pLL3.7 vector  Addgene 11795
pMD2.G Addgene 12259
Polybrene infection reagent Sigma TR1003- G
Polyethylenimine, branched Sigma 408727
psPAX2.0 Addgene 12260
Purmorphamine Tocris 4551/10
Puromycin Invitrogen A1113802
ROCK inhibitor Y-27632
dihydrochloride 		 Tocris 1254
SB 431542 Tocris 1614/10
Trypsin .05% EDTA  Invitrogen 25300062
XAV 939 Tocris 3748/10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
  4. Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
  5. Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
  6. Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
  7. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  8. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
  9. Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
  10. Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
  12. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
  13. Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
  14. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  15. Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
  16. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
  17. Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
  18. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  19. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
  20. Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
  21. Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
  22. Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
  23. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).

Tags

Biologi udgave 183 lentivirus shRNA hESC'er NPC'er polyethylenimin HEK293T-celler
Lentiviral medieret levering af shRNA'er til hESC'er og NPC'er ved hjælp af billig kationisk polymer polyethylenimin (PEI)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sheikh, M. A., Ansari, S. A.… More

Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI). J. Vis. Exp. (183), e63953, doi:10.3791/63953 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter