Summary
AlPcS2a介导的发色团辅助激光灭活（CALI）是研究活细胞中细胞内囊泡（IVs）时空损伤的强大工具。
Abstract
细胞内囊泡（IV）是通过囊泡内吞作用形成细胞质而形成的。IV形成通过IV膜的透化以及内体和溶酶体的形成参与激活各种信号通路。一种称为发色团辅助激光灭活（CALI）的方法用于研究IV的形成和控制IV调节的材料。CALI是一种基于成像的光动力方法，用于研究膜透化诱导的信号通路。该方法允许对所选细胞器进行时空操作以在细胞中透化。CALI方法已被应用于通过内体和溶酶体的透化来观察和监测特定分子。已知IV的膜破裂会选择性地募集聚糖结合蛋白，例如半乳糖凝集素-3。在这里，该协议描述了AlPcS2a 诱导IV破裂和使用半乳糖凝集素-3作为标记受损溶酶体的标记物，这对于研究IV膜破裂的下游效应及其在各种情况下的下游效应是有用的。
Introduction
内体是一种细胞内囊泡（IV），通过内吞作用形成，然后成熟为溶酶体。各种细胞内信号通路参与IV的形成;此外，不同的内在和外在刺激会损害静脉注射（例如，病原体在感染期间可以从边界膜逸出并进入细胞质1）。这通常伴有内吞囊泡破裂2。因此，靶向和破坏IV的技术可用于相关研究3。
光动力疗法（PDT）是一种光依赖性疗法，通过杀死肿瘤或病原体来对抗疾病4。在PDT中，靶细胞用无毒发色团标记，称为光敏剂，可以通过光照明局部激活5，6。光敏剂从光中吸收能量并转化为激发的单重态，导致长寿命的激发三重态。三重态的光敏剂可以在氧气存在下发生电子或能量转移并形成活性氧（ROS），并且可以在空间上破坏照明区域内的标记细胞7。结果因光的力量而异8.通过控制光敏剂的浓度和光照明强度，可以在不进行细胞裂解的情况下选择性地灭活目标生物分子，称为发色团辅助光灭活（CALI）9。随着可以选择性标记各种亚细胞靶标的光敏剂的重大发展，CALI 已成为控制光介导的生物分子灭活的有价值的工具，用于小生物分子（如核苷酸和蛋白质）以及细胞器（如线粒体和内溶酶体3，10，11，12，13）。
与CALI相比，化学或物理方法也用于损害膜，例如细菌毒素14，15 和Leu-Leu-OMe16 治疗溶酶体损伤。然而，这些方法显示细胞内IV的大量损伤。在CALI中使用强大的光敏剂（即氯化酞菁二磺酸Al（III）（AlPcS2a））;AlPcS2a通过内吞作用靶向溶酶体，用于在受控区域17中破裂内体或溶酶体。AlPcS2a 是一种细胞膜不可渗透的酞菁基发色团，与质膜上的脂质结合，通过内吞作用内化，最终通过内吞途径积聚在溶酶体内18。它吸收近红外光谱区域内的光并产生单线态氧，这是由激发的AlPcS2a18产生的主要ROS。单线态氧衰变迅速限制了其在细胞中微小区域（约10-20nm）内的扩散和反应距离19。通过调整AlPcS2a 孵育和光照的持续时间，允许对亚细胞区域内IV的损伤进行时空控制。因此，CALI成为检查静脉损伤后果以及静脉注射形成和调节的有力工具。
在这项研究中，解决了使用AlPcS 2a 作为光敏剂的CALI的特定方案。该方案可应用于各种类型的IV，包括内体和溶酶体，并用于检查膜破裂后的后续反应。表达溶酶体破裂后显示的荧光团缀合半乳糖凝集素-316，20 的HeLa细胞用于证明该方案。
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Protocol
1. AlPcS2a 原液制备
- 将 10 mg AlPcS2a 溶解在 400 μL 的 0.1 M NaOH 中。为了提高溶解度，将溶液加热到50°C并涡旋。
- 将溶液与 4 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 混合。然后，用0.22μm过滤器过滤溶液以除去不溶性沉淀物。
- 通过紫外-可见分光光度计测量溶液的浓度。AlPcS2a在672 nm处的消光系数为4 x 104 cm-1 M-1。用PBS稀释AlPcS2a溶液，制成1 mM溶液。制作1mL等分试样并储存在-20°C。
2. 转染
注意：Gal3-GFP用作溶酶体破裂活细胞成像的指标。
- 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 DMEM 中维持 HeLa 细胞培养。用PBS洗涤细胞后，胰蛋白酶消化细胞，然后将细胞重悬于补充有10%FBS的DMEM中。
注意：该方法适用于大多数附着的细胞系，包括HeLa和A549细胞系。原则上，尽管不测试悬浮细胞，但可以使用它们进行CALI测定。 - 在 25 μL 还原血清培养基中稀释 300 ng Gal3-GFP 质粒，然后加入 0.6 μL P3000 试剂。轻轻混合。在 25 μL 还原血清培养基中稀释 0.45 μL 脂质胺 3000 试剂。轻轻混合。
- 在室温下孵育5分钟。混合稀释的DNA和稀释的脂质胺3000，然后在室温下孵育10分钟。
- 混合 DNA-脂质胺混合物、3 x 105 悬浮 HeLa 细胞和 200 μL DMEM+10% FBS，然后将细胞接种在 35 mm 玻璃纽扣培养皿的中心玻璃区域。
3. AlPcS2a染色
- 为了允许细胞附着，将细胞在37°C下在提供 5%CO2的培养箱中孵育至少4小时。
- 在补充有10%FBS的DMEM中稀释AlPcS 2a，制成1μM AlPcS2a溶液。在37°C水浴中预热含AlPcS2a的培养基。用含AlPcS2a的培养基替换培养基。
- 将细胞在37°C下在提供5%CO2 的培养箱中孵育过夜（16-18小时）。
- 第二天，用PBS洗涤细胞两次以去除细胞外AlPcS2a。用新鲜培养基替换培养基，然后在37°C下孵育4小时，以使沿内吞途径的残留染料积聚成溶酶体。
注意：要染色内体，在含有10%FBS的DMEM中的1μM AlPcS2a 中在37°C孵育细胞15分钟。 接下来，用PBS洗涤细胞两次，并在成像前在预热的培养基中孵育它们。
图1.表示AlPcS2a选择性IV损伤的示意图。 该图显示了选择性IV损伤的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图2.用AlPcS2a进行溶酶体染色。 用 1 μM AlPcS2a 在 HeLa 细胞中标记过夜的溶酶体用 50 nM 绿色荧光染料阳性染色。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
4. 样品成像和光照
注意：可以在培养皿中单个细胞或所有AlPcS2a标记细胞的亚细胞区域内进行IV损伤。整个培养皿的批量照明允许对这种损伤进行定量研究，包括生化研究。
- 通过破坏单个细胞内的溶酶体来操纵单细胞，如下所述。
- 将培养皿放在共聚焦显微镜的载物台上。将 488 nm 和 561 nm 激光器分别用于激发 GFP 和 AlPcS2a。
- 在选择被选中要损坏的 AlPcS2a 标记囊泡上圈出 5 x 5 μm2 感兴趣区域 （ROI）。
- 脉冲用 0.21 mW 的 633 nm 激光照射 ROI 70 次重复。监测Gal3点的形成作为溶酶体膜透化的指标。
- 如下所述破坏培养皿中的所有标记细胞。
- 将培养皿放在平台上。用 660 nm 的准直 LED 灯照亮培养皿（近红外光是 AlPcS2a 激发光谱的理想基础）。
- 将培养皿放在显微镜上并监测步骤4.1.3中提到的膜透化指示剂。
- 使用以下指标评估静脉注射的损伤。
- 内体或溶酶体的内容物糖基化程度最高，在静脉破裂时暴露于细胞质中。使用胞质聚糖结合半乳糖凝集素（包括半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-8 和半乳糖凝集素-9）快速标记这些细胞16，20。
- 伤口的大小可以通过膜不透性染料的释放来确定，如21中所述。
- 内体和溶酶体之间的区别在于它们的管腔pH值。溶酶体破裂会扰乱管腔 pH 值，这可以通过使用 pH 敏感染料（例如 FITC-葡聚糖3）进行测量。
图3.AlPcS2a介导的CALI诱导TagRFP-半乳糖凝集素-3（Gal3）局部募集到照明区域内的溶酶体中。 将TagRFP-半乳糖凝集素-3表达的HeLa细胞中的溶酶体用1μM AlPcS2a染色过夜，然后在黄色方块内用近红外光（633nm）聚焦照明。AlPcS2a 信号在黄色方块内被光漂白，伴随着TagRFP-半乳糖凝集素-3点的形成。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
图中显示了AlPcS2a诱导的IV损伤，包括内体和溶酶体（图1）。
市售标记物可用于确定AlPcS2a 染色条件。例如，AlPcS2a 点和绿色荧光染料22 共定位（图2）。
荧光团标记的半乳糖凝集素-3可用作监测IV损伤的指示剂（图3）。此外，还可以跟踪Gal3点的位置以检测下游信号通路，包括溶酶体修复和溶酶体3，23。Gal3从细胞质到受损IV的快速积累将显着增加Gal3的强度，如果调整图像的对比度以显示胞质Gal3，这将使Gal3点的强度饱和。事实上，图像还显示胞质Gal3略有减少。
总之，这些结果表明，基于AlPcS2a的CALI能够在ROI内控制局部溶酶体破裂，使其余溶酶体保持完整。
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Discussion
AlPcS2a 与质膜结合，然后通过内吞作用内化并最终积聚在溶酶体中。因此，AlPcS 2a 可以通过调整孵育持续时间定位在亚细胞区室中。这种方法的局限性在于，只有 IV 亚群可以通过内吞作用被 AlPcS2a 标记，因为还有许多其他 IV 膜源，例如 ER 和高尔基体装置。此外，将AlPcS 2a 选择性标记到早期或晚期内体中具有挑战性，然而，荧光标记物可用于在亚细胞成像期间区分早期形成的内体和晚期形成的内体。CALI诱导的IV损伤可以用多种染料3，24诱导。
损伤强度可以通过光的功率和照明持续时间来控制。更高强度的损伤可能导致细胞萎缩或坏死。在这里，已经显示了IV损伤的几个指标，可用于确定实验条件。此外，这些指示剂还可以作为受损IV的标志物，并提供有关其随时间推移的亚细胞分布的信息。
临床上，AlPcS2a 旨在通过光化学内化（PCI）以位点和时间特异性的方式改善治疗剂的递送25。然而，不可避免的副作用，例如细胞凋亡或分化，也可能伴随PCI治疗26。由于这种影响可能是诱导溶酶体损伤的结果，因此所提供的测定为临床前使用提供了潜在的工具。
在这项研究中，AlPcS2a介导的CALI协议描述了损伤大小（局部和部分内体或溶酶体）的选择性控制。科学家可以监测它们的亚细胞行为，而其余的IV保持完整，可以被视为对照。这种方法已在多项研究中得到应用。例如，受损溶酶体用泛素和微管相关蛋白轻链3（LC3）顺序标记，并进行自噬清除3。此外，半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-8标记在受损的内体上由细胞表面聚糖27控制。由于AlPcS2a已在体内用于PCI，因此AlPcS2a介导的CALI也可以在体内使用。该协议为使用AlPcS2a介导的CALI研究细胞生物学提供了强大的工具。这些研究支持AlPcS2a介导的CALI是细胞生物学研究的强大工具。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者希望感谢中央研究院炎症核心设施IBMS的研究支持。核心设施由中央研究院核心设施和创新仪器项目（AS-CFII-111-213）资助。作者感谢中央研究院生物医学科学研究所（IBMS）的通用设备核心设施协助图像采集。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
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