Summary
AlPcS2a 매개 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)는 살아있는 세포에서 세포내 소포(IV)의 시공간 손상을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.
Abstract
세포내 소포(IV)는 소포가 세포질로 세포내로 세포내이입되는 것을 통해 형성됩니다. IV 형성은 IV 막의 투과화와 엔도솜 및 리소좀의 형성을 통해 다양한 신호 경로를 활성화하는 데 관여합니다. 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)라는 방법이 IV 형성과 IV 조절을 제어하는 재료를 연구하는 데 적용됩니다. CALI는 막 투과화에 의해 유도된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 이미징 기반 광역학 방법론입니다. 이 방법을 사용하면 선택된 세포 기관의 시공간 조작이 세포에서 투과될 수 있습니다. CALI 방법은 엔도솜과 리소좀의 투과를 통해 특정 분자를 관찰하고 모니터링하는 데 적용되었습니다. IV의 막 파열은 갈렉틴-3과 같은 글리칸 결합 단백질을 선택적으로 모집하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서 프로토콜은 AlPcS2a 에 의한 IV 파열 유도와 손상된 리소좀을 표지하기 위한 마커로 갈렉틴-3의 사용을 설명하며, 이는 IV 막 파열의 다운스트림 효과와 다양한 상황에서 다운스트림 효과를 연구하는 데 유용합니다.
Introduction
세포내 소포(IV)의 일종인 엔도솜은 엔도사이토시스에 의해 형성되고 리소좀으로 성숙합니다. 다양한 세포 내 신호 경로가 IV의 형성에 관여합니다. 또한, 상이한 내인성 및 외인성 자극이 IV를 손상시킬 수 있습니다(예: 병원체는 감염 중에 경계막에서 빠져나와 세포질1로 들어갈 수 있음). 이것은 일반적으로 endocytotic vesicle의 파열을 동반합니다2. 따라서 IV를 표적화하고 손상시키는 기술은 관련 연구에서 사용될 수 있다3.
광역학 치료(Photodynamic therapy, PDT)는 종양이나 병원체를 죽임으로써 질병을 퇴치하기 위한 빛 의존 요법이다4. PDT에서, 표적 세포는 광감작제라고 불리는 비독성 발색단으로 표지되며, 이는 광 조명 5,6에 의해 국소적으로 활성화될 수 있다. 감광제는 빛에서 에너지를 흡수하여 여기된 일중항 상태로 변환되어 수명이 긴 여기된 삼중항 상태로 이어집니다. 삼중항 상태의 광감작제는 전자 또는 에너지 전달을 겪을 수 있고, 산소의 존재 하에서 반응성 산소종(ROS)을 형성할 수 있으며, 조명 영역(7) 내에서 표지된 세포를 공간적으로 파괴할 수 있다. 결과는 빛의 힘에 따라 달라진다8. 감광제의 농도와 조명 강도를 제어함으로써 표적 생체 분자를 세포 용해 없이 선택적으로 비활성화할 수 있으며, 이를 발색단 보조 광 비활성화(CALI)라고 합니다9. 다양한 세포 내 표적을 선택적으로 표지할 수 있는 광감작제가 크게 개발됨에 따라 CALI는 미토콘드리아및 엔도-리소좀과 같은 세포 기관뿐만 아니라 뉴클레오티드 및 단백질과 같은 작은 생체 분자에 대한 생체 분자의 빛 매개 불활성화를 제어하는 귀중한 도구가 되었습니다 3,10,11,12,13.
CALI와 비교하여 화학적 또는 물리적 방법은 박테리아 독소 14,15 및 리소좀 손상에 대한 Leu-Leu-OMe16 치료와 같은 막을 손상시키는 데에도 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 세포 내에서 IV의 대량 손상을 표시합니다. 강력한 감광제(즉, Al(III) 프탈로시아닌 클로라이드 디설폰산(AlPcS2a))가 CALI에 사용됩니다. 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 리소좀을 표적으로 하는AlPcS2a는 제어 영역(17)에서 엔도솜 또는 리소좀을 파열시키는 데 사용된다. AlPcS2a는 세포막 불투과성 프탈로시아닌 기반 발색단으로 원형질막의 지질에 결합하고 엔도사이토시스를 통해 내재화되어 결국 내세포 경로18을 통해 리소좀 내에 축적됩니다. 근적외선 스펙트럼 영역 내에서 빛을 흡수하고 여기된 AlPcS2a18에 의해 생성되는 주요 ROS인 일중항 산소를 생성합니다. 일중항 산소 붕괴는 세포의 작은 영역(약 10-20nm) 내에서 확산 및 반응 거리를 빠르게 제한합니다19. AlPcS2a 배양 기간 및 광 조명을 조정함으로써 세포 내 영역 내에서 IV의 손상에 대한 시공간 제어가 허용됩니다. 따라서 CALI는 IV 손상의 결과와 IV의 형성 및 조절을 조사하는 강력한 도구가 됩니다.
본 연구에서는 AlPcS2a를 광감작제로 사용하는 CALI의 특정 프로토콜을 다룬다. 이 프로토콜은 엔도솜 및 리소좀을 포함한 다양한 유형의 IV에 적용할 수 있으며 막 파열 후 후속 반응을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 리소좀 파열 후 밝혀진 형광단 접합 갈렉틴-316,20을 발현하는 HeLa 세포는 이 프로토콜을 입증하는 데 사용됩니다.
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Protocol
1. AlPcS2a 재고 준비
- 10mg의 AlPcS2a 를 400μL의 0.1M NaOH에 녹입니다. 용해도를 향상시키기 위해, 용액을 50°C에서 가열하고 와동시킨다.
- 용액을 4mL의 인산염 완충 식염수(PBS)와 혼합합니다. 그 후, 용액을 0.22 μm 필터로 여과하여 불용성 침전물을 제거하였다.
- UV-Vis 분광광도계를 통해 용액의 농도를 측정합니다. 672 nm에서 AlPcS2a의 흡광 계수는 4 x 104 cm-1 M-1입니다. AlPcS2a 용액을 PBS로 희석하여 1 mM 용액을 만든다. 1 mL 분취량을 만들고 -20 °C에서 보관한다.
2. 형질주입
참고: Gal3-GFP는 리소좀 파열의 생세포 이미징을 위한 지표로 적용됩니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM에서 HeLa 세포 배양을 유지합니다. 세포를 PBS로 세척한 후, 세포를 트립신화한 다음, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 세포를 재현탁한다.
참고: 이 방법은 HeLa 및 A549 세포주를 포함한 대부분의 부착된 세포주에 적용할 수 있습니다. 원칙적으로, 현탁 세포를 테스트하지 않았음에도 불구하고 CALI 분석을 수행할 수 있었습니다. - 300ng의 Gal3-GFP 플라스미드를 25μL의 환원된 혈청 배지에 희석한 다음 0.6μL의 P3000 시약을 추가합니다. 부드럽게 섞는다. 0.45 μL의 Lipofectamine 3000 시약을 25 μL의 환원된 혈청 배지에 희석합니다. 부드럽게 섞는다.
- 실온에서 5분 동안 배양합니다. 희석된 DNA와 희석된 리포펙타민 3000을 혼합한 후 실온에서 10분간 배양한다.
- DNA-리포펙타민 혼합물, 3 x 105 부유 HeLa 세포 및 200 μL의 DMEM + 10 % FBS를 혼합 한 다음 35 mm 유리 버튼 접시의 중앙 유리 영역에 세포를 시드합니다.
3. AlPcS2a 염색
- 세포 부착을 허용하기 위해, 세포를 적어도 4시간 동안 5%CO2가 공급된 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.
- 10% FBS가 보충된 DMEM에 AlPcS 2a를 희석하여 1μM AlPcS2a 용액을 만듭니다. AlPcS2a 함유 배지를 37°C 수조에서 예비-가온한다. 배양 배지를 AlPcS2a 함유 배지로 교체합니다.
- 세포를 5%CO2 가 공급된 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안(16-18시간) 인큐베이션한다.
- 다음날, 세포를 PBS로 2회 세척하여 세포외 AlPcS2a를 제거하였다. 배지를 새로운 배지로 교체한 다음 37°C에서 4시간 동안 배양하여 내세포 경로를 따라 잔류 염료가 리소좀으로 축적되도록 합니다.
참고: 엔도솜을 염색하기 위해 37°C에서 15분 동안 10% FBS가 포함된 DMEM에서 1μM AlPcS2a 로 세포를 배양합니다. 다음으로, PBS로 세포를 두 번 세척하고 이미징 전에 예열 된 배지에서 배양합니다.
그림 1. AlPcS2a를 사용한 선택적 IV 손상을 나타내는 개략도. 그림은 선택적 IV 손상의 개략도를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. AlPcS2a를 사용한 리소좀 염색. HeLa 세포에서 1μM AlPcS2a 로 밤새 표지된 리소좀은 50nM 녹색 형광 염료로 양성으로 염색됩니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 샘플 이미징 및 조명
참고: 배양 접시에서 단일 세포 또는 모든 AlPcS2a 표지된 세포의 세포 내 영역 내에서 IV 손상을 수행할 수 있습니다. 전체 배양 접시의 벌크 조명은 생화학 적 연구를 포함하여 이러한 손상에 대한 정량적 연구를 가능하게합니다.
- 아래에 설명된 대로 단일 세포 내의 리소좀을 손상시켜 단일 세포를 조작합니다.
- 배양 접시를 컨포칼 현미경의 무대에 놓습니다. GFP 및 AlPcS2a를 자극하기 위해 각각 488nm 및 561nm 레이저를 사용합니다.
- 손상되도록 선택된 AlPcS2a-표지된 소포에 5 x 5μm2 관심 영역(ROI)을 동그라미로 그립니다.
- 펄스는 70회 반복 동안 0.21mW의 633nm 레이저로 ROI를 비춥니다. 리소좀 막 투과화의 지표로서 Gal3 반점의 형성을 모니터링합니다.
- 아래에 설명된 대로 배양 접시에 있는 모든 표지된 세포를 손상시킵니다.
- 문화 접시를 플랫폼에 놓습니다. 660nm의 시준된 LED 조명으로 접시를 비춥니다(근적외선은 AlPcS2a의 여기 스펙트럼에 이상적인 기반입니다).
- 배양 접시를 현미경에 놓고 4.1.3단계에서 언급한 대로 막 투과화 지표를 모니터링합니다.
- 다음 지표를 사용하여 IV의 부상을 평가합니다.
- 엔도솜 또는 리소좀의 함량은 가장 높은 글리코실화되어 IV 파열 시 세포질에 노출됩니다. 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-8 및 갈렉틴-9를 포함한 세포질 글리칸 결합 갈렉틴을 사용하여 이들을 신속하게 표지합니다16,20.
- 상처의 크기는도 21에 기재된 바와 같이 막 불투과성 염료의 방출에 의해 결정될 수 있다.
- 엔도솜과 리소좀의 차이점은 내강 pH 값입니다. 리소좀 파열은 내강 pH를 교란시키며, 이는 FITC-덱스트란3과 같은 pH 민감성 염료를 사용하여 측정할 수 있습니다.
그림 3. AlPcS2a 매개 CALI는 조명 영역 내의 리소좀에 대한 TagRFP-갈렉틴-3(Gal3)의 국소 모집을 유도합니다. TagRFP-갈렉틴-3 발현 HeLa 세포의 리소좀을 1μM AlPcS2a로 밤새 염색한 후 노란색 사각형 내에 근적외선(633nm)으로 조명을 집중시켰습니다. 노란색 사각형 내의 AlPcS2a 신호는 TagRFP-galectin-3 puncta의 형성과 함께 광표백됩니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
엔도솜과 리소좀을 포함한 IV의 AlPcS2a 유발 손상을 나타내는 개략도가 표시되었습니다(그림 1).
시판되는 마커는AlPcS2a 염색 조건을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, AlPcS2a 반점 및 녹색 형광 염료22 colocalization (그림 2).
형광단 표지된 갈렉틴-3은 IV 손상을 모니터링하기 위한 지표로 적용할 수 있습니다(그림 3). 또한, Gal3 반점의 위치는 리소좀 복구 및 lysophagy 3,23을 포함한 다운스트림 신호 전달 경로를 분석하기 위해 추적될 수도 있습니다. 세포질에서 손상된 IV로 Gal3의 빠른 축적은 Gal3의 강도를 크게 증가시켜 이미지의 대비가 세포질 Gal3을 나타내도록 조정되면 Gal3 반점의 강도를 포화시킵니다. 사실, 이미지는 또한 세포질 Gal3의 약간의 감소를 보여주었습니다.
요약하면, 이러한 결과는 AlPcS2a 기반 CALI가 ROI 내에서 국소 리소좀 파열을 제어하고 나머지 리소좀은 그대로 유지할 수 있음을 나타냅니다.
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Discussion
AlPcS2a는 원형질막에 결합한 다음 엔도사이토시스에 의해 내재화되어 결국 리소좀에 축적됩니다. 따라서 AlPcS2a는 배양 기간을 조정하여 세포하 구획에 국한시킬 수 있습니다. 이 방법론의 한계는 ER 및 골지체와 같은 IV의 다른 막 공급원이 많기 때문에 엔도사이토시스를 통해 IV의 하위 집단만 AlPcS2a에 의해 표지될 수 있다는 것입니다. 또한, AlPcS2a를 초기 또는 후기 엔도솜에 선택적으로 표지하는 것은 어려울 수 있지만, 형광 마커를 사용하여 세포 내 이미징 중에 초기 형성된 엔도솜과 후기 형성된 엔도솜을 구별할 수 있습니다. CALI-유도된 IV 손상은 다양한 염료 3,24로 유도될 수 있다.
손상의 강도는 빛의 힘과 조명 지속 시간에 의해 제어될 수 있습니다. 손상 강도가 높을수록 세포 수축 또는 괴사을(를) 유발할 수 있음. 여기에서 실험 조건을 결정하는 데 사용할 수 있는 IV 손상의 몇 가지 지표가 표시되었습니다. 또한 이러한 지표는 손상된 IV에 대한 마커 역할을 할 수 있으며 시간 경과에 따른 세포 내 분포에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.
임상적으로 AlPcS2a 는 광화학적 내재화(PCI)25를 통해 부위 및 시간별 방식으로 치료제의 전달을 개선하도록 설계되었습니다. 그러나, 세포 아폽토시스 또는 분화와 같은 피할 수 없는 부작용이 PCI 치료도 동반될 수 있다(26). 이러한 효과는 리소좀 손상 유도의 결과일 수 있기 때문에 제공된 분석은 전임상 사용을 위한 잠재적인 도구를 제시합니다.
이 연구에서 AlPcS2a 매개 CALI 프로토콜은 손상 크기(국소 및 엔도솜 또는 리소좀의 일부)의 선택적 제어를 설명합니다. 과학자들은 세포 내 행동을 모니터링 할 수 있지만 나머지 IV는 손상되지 않고 대조군으로 취급 될 수 있습니다. 이 방법론은 여러 연구에 적용되었습니다. 예를 들어, 손상된 리소좀은 유비퀴틴 및 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)으로 순차적으로 표지되고 자가포식 청소율3을 거칩니다. 또한, 손상된 엔도솜에 대한 갈렉틴-3 및 갈렉틴-8 표지는 세포 표면 글리칸27에 의해 제어됩니다. AlPcS2a는 PCI를 위해 in vivo로 사용되었기 때문에AlPcS2a 매개 CALI도 in vivo로 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 AlPcS2a 매개 CALI를 사용하여 세포 생물학을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 연구는 AlPcS2a 매개 CALI가 세포 생물학 연구를 위한 강력한 도구임을 뒷받침합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 연구 지원을 위해 Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS에 감사드립니다. 핵심 시설은 Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213)의 자금 지원을 받습니다. 저자는 이미지 획득을 지원해 준 IBMS(Institute of Biomedical Sciences), AS(Academia Sinica)의 Common Equipment Core Facility에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
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