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Immunology and Infection

इंट्रासेल्युलर पुटिका टूटना के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक फोटोडायनामिक दृष्टिकोण

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/63962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Inflammation Core Facility, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

Summary

एएलपीसीएस2 ए-मध्यस्थता क्रोमोफोर-असिस्टेड लेजर निष्क्रियता (सीएएलआई) जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं (आईवीएस) के स्थानिक क्षति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Abstract

इंट्रासेल्युलर वेसिकल्स (आईवी) साइटोप्लाज्म में पुटिकाओं के एंडोसाइटोसिस के माध्यम से बनते हैं। IV गठन IV झिल्ली के परमेबिलाइजेशन और एंडोसोम और लाइसोसोम के गठन के माध्यम से विभिन्न संकेत मार्गों को सक्रिय करने में शामिल है। आईवी के गठन और आईवी विनियमन को नियंत्रित करने में सामग्री का अध्ययन करने के लिए क्रोमोफोर-असिस्टेड लेजर निष्क्रियता (सीएएलआई) नामक एक विधि लागू की जाती है। सीएएलआई एक इमेजिंग-आधारित फोटोडायनामिक पद्धति है जो झिल्ली परमेबिलाइजेशन द्वारा प्रेरित सिग्नलिंग मार्ग का अध्ययन करती है। विधि चयनित ऑर्गेनेल के स्थानिक हेरफेर को एक सेल में प्रतिरक्षित करने की अनुमति देती है। कैली विधि को एंडोसोम और लाइसोसोम के परमेबिलाइजेशन के माध्यम से विशिष्ट अणुओं का निरीक्षण और निगरानी करने के लिए लागू किया गया है। आईवीएस के झिल्ली टूटने को चुनिंदा ग्लाइकन-बाइंडिंग प्रोटीन, जैसे गैलेक्टिन -3 की भर्ती के लिए जाना जाता है। यहां, प्रोटोकॉल एएलपीएस2 ए द्वारा आईवी टूटने के प्रेरण और बिगड़ा हुआ लाइसोसोम लेबल करने के लिए मार्कर के रूप में गैलेक्टिन -3 के उपयोग का वर्णन करता है, जो आईवी झिल्ली टूटने के डाउनस्ट्रीम प्रभावों और विभिन्न स्थितियों में उनके डाउनस्ट्रीम प्रभावों का अध्ययन करने में उपयोगी है।

Introduction

एंडोसोम, एक प्रकार का इंट्रासेल्युलर पुटिका (IV), एंडोसाइटोसिस द्वारा बनता है और फिर लाइसोसोम में परिपक्व होता है। आईवीएस के गठन में विभिन्न इंट्रासेल्युलर सिग्नल मार्ग शामिल हैं; इसके अतिरिक्त, विभिन्न आंतरिक और बाह्य उत्तेजनाएं आईवीएस को नुकसान पहुंचा सकती हैं (उदाहरण के लिए, रोगजनक संक्रमण के दौरान बंधे हुए झिल्ली से बच सकते हैं और साइटोप्लाज्म1 में प्रवेश कर सकते हैं)। यह आमतौर पर एंडोसाइटिकपुटिकाओं के टूटने के साथ होता है। इसलिए, आईवी को लक्षित करने और नुकसान पहुंचाने की तकनीकों का उपयोग संबंधित अध्ययनों में किया जा सकताहै।

फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) ट्यूमर या रोगजनकों को मारकर बीमारियों का मुकाबलाकरने के लिए एक प्रकाश-निर्भर चिकित्सा है। पीडीटी में, लक्षित कोशिकाओं को गैर विषैले क्रोमोफोर के साथ लेबल किया जाता है, जिसे फोटोसेंसिटाइज़र कहा जाता है, जिसे स्थानीय रूप से प्रकाश रोशनी 5,6 द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। फोटोसेंसिटाइज़र प्रकाश से ऊर्जा को अवशोषित करते हैं और एक उत्तेजित एकल अवस्था में बदल जाते हैं, जिससे लंबे समय तक उत्तेजित ट्रिपल अवस्था होती है। ट्रिपल अवस्था के फोटोसेंसिटाइज़र इलेक्ट्रॉन या ऊर्जा हस्तांतरण से गुजर सकते हैं और ऑक्सीजन की उपस्थिति में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का निर्माण कर सकते हैं, और रोशनी क्षेत्र7 के भीतर लेबल कोशिकाओं को स्थानिक रूप से नष्ट कर सकते हैं। परिणाम प्रकाश8 की शक्ति के आधार पर भिन्न होता है। फोटोसेंसिटाइज़र की एकाग्रता और प्रकाश रोशनी की तीव्रता को नियंत्रित करके, लक्षित बायोमोलेक्यूल्स को सेल लाइसिस के बिना चुनिंदा रूप से निष्क्रिय किया जा सकता है, जिसे क्रोमोफोर-असिस्टेड लाइट निष्क्रियता (सीएएलआई) 9 कहा जाता है। फोटोसेंसिटाइज़र के महत्वपूर्ण विकास के साथ जो चुनिंदा रूप से विभिन्न उपकोशिकीय लक्ष्यों को लेबल कर सकते हैं, सीएएलआई छोटे बायोमोलेक्यूल्स जैसे न्यूक्लियोटाइड ्स और प्रोटीन, साथ ही माइटोकॉन्ड्रिया और एंडो-लाइसोसोम जैसे ऑर्गेनेल 3,10,11,12,13 के लिए बायोमोलेक्यूल्स की प्रकाश-मध्यस्थता निष्क्रियता को नियंत्रित करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गया है।

कैली की तुलना में, रासायनिक या भौतिक तरीकों का उपयोग झिल्ली को खराब करने के लिए भी किया जाता है, जैसे कि बैक्टीरियल टॉक्सिन 14,15 और लाइसोसोमल क्षति के लिए ल्यू-ल्यू-ओएमई16 उपचार। हालांकि, ये विधियां कोशिकाओं के भीतर आईवीएस की थोक हानि प्रदर्शित करती हैं। मजबूत फोटोसेंसिटाइज़र (यानी, अल (III) फ्थालोसाइनिन क्लोराइड डाइसल्फोनिक एसिड (एएलपीसीएस2 ए)) सीएएलआई में उपयोग किया जाता है; एएलपीएस2 ए, एंडोसाइटोसिस के माध्यम से लाइसोसोम को लक्षित करते हुए, एक नियंत्रित क्षेत्र17 में एंडोसोम या लाइसोसोम को तोड़ने के लिए उपयोग किया जाता है। एएलपीसीएस2 ए एक कोशिका झिल्ली-अभेद्य फ्थालोसाइनिन-आधारित क्रोमोफोर है जो प्लाज्मा झिल्ली पर लिपिड को बांधता है और एंडोसाइटोसिस के माध्यम से आंतरिक होता है और अंततः एंडोसाइटिक मार्ग18 के माध्यम से लाइसोसोम के भीतर जमा होता है। यह एक निकट-अवरक्त वर्णक्रमीय क्षेत्र के भीतर प्रकाश को अवशोषित करता है और एकल ऑक्सीजन उत्पन्न करता है, जो उत्तेजित एएलपीएस2 ए 18 द्वारा उत्पन्न एक प्रमुख आरओएस है। सिंगलेट ऑक्सीजन क्षय तेजी से कोशिकाओं में एक छोटे से क्षेत्र (लगभग 10-20 एनएम) के भीतर इसके प्रसार और प्रतिक्रिया दूरी को सीमित करता है। एएलपीएस2 ए इनक्यूबेशन और प्रकाश रोशनी की अवधि को समायोजित करके, एक उपकोशिकीय क्षेत्र के भीतर आईवीएस की क्षति के स्थानिक नियंत्रण की अनुमति है। इसलिए सीएएलआई आईवी क्षति के परिणामों की जांच करने और आईवीएस के गठन और विनियमन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन जाता है।

इस अध्ययन में, एक फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में AlPCS2a का उपयोग करके CALI के एक विशिष्ट प्रोटोकॉल को संबोधित किया गया है। इस प्रोटोकॉल को एंडोसोम और लाइसोसोम सहित विभिन्न प्रकार के आईवीएस पर लागू किया जा सकता है, और झिल्ली टूटने के बाद अनुवर्ती प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। लाइसोसोम टूटने के बाद फ्लोरोफोरे-संयुग्मित गैलेक्टिन -316,20 को व्यक्त करने वाली हेला कोशिकाओं का उपयोग इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है।

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Protocol

1. एएलपीसीएस2 ए स्टॉक तैयारी

  1. 10 मिलीग्राम AlPCS2a को 0.1 M NaOH के 400 μL में घोलें। घुलनशीलता में सुधार करने के लिए, घोल को 50 डिग्री सेल्सियस और भंवर पर गर्म करें।
  2. घोल को 4 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ मिलाएं। फिर, अघुलनशील अवक्षेप को हटाने के लिए 0.22 μm फ़िल्टर के साथ घोल को फ़िल्टर करें।
  3. यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से समाधान की एकाग्रता को मापें। 672 एनएम पर एएलपीसीएस2 ए का विलोपन गुणांक 4 x 104 सेमी -1 एम -1 है। 1 एमएम समाधान बनाने के लिए पीबीएस के साथ एएलपीएस2 ए समाधान को पतला करें। 1 एमएल एलिकोट बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. अभिकर्मक

नोट: गैल 3-जीएफपी लाइसोसोमल टूटने के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक संकेतक के रूप में लागू होता है।

  1. डीएमईएम में हेला सेल कल्चर को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक बनाए रखें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें, फिर डीएमईएम में कोशिकाओं को 10% एफबीएस के साथ पूरक करें।
    नोट: विधि हेला और ए 549 सेल लाइनों सहित अधिकांश संलग्न सेल लाइनों के लिए लागू है। सिद्धांत रूप में, निलंबन कोशिकाओं का परीक्षण नहीं करने के बावजूद, सीएएलआई परख उनके साथ किया जा सकता है।
  2. कम सीरम माध्यम के 25 μL में Gal3-GFP प्लास्मिड के 300 ng को पतला करें, और फिर P3000 अभिकर्मक के 0.6 μL जोड़ें। धीरे से मिलाएं। कम सीरम माध्यम के 25 μL में लिपोफेक्टामाइन 3000 अभिकर्मक के 0.45 μL पतला करें। धीरे से मिलाएं।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पतला डीएनए और पतला लिपोफेक्टामाइन 3000 मिलाएं, और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. डीएनए-लिपोफेक्टामाइन मिश्रण, 3 x 105 निलंबित हेला कोशिकाओं, और डीएमईएम + 10% एफबीएस के 200 μL को मिलाएं, और फिर 35 मिमी ग्लास बटन डिश के केंद्रीय ग्लास क्षेत्र पर कोशिकाओं को बीज दें।

3. एएलपीसीएस 2 ए धुंधला

  1. सेल अटैचमेंट की अनुमति देने के लिए, कम से कम 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ आपूर्ति किए गए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. डीएमईएम में एएलपीसीएस2 ए को पतला करें और 10% एफबीएस के साथ पूरक 1 μM AlPCS2a समाधान बनाने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एएलपीएस2 ए युक्त माध्यम को पूर्व-गर्म करें। संस्कृति माध्यम को AlPCS2a-युक्त माध्यम से बदलें।
  3. रात भर (16-18 घंटे) 5% सीओ2 के साथ आपूर्ति किए गए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन, बाह्य AlPCS2a को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। माध्यम को ताजा माध्यम से बदलें, और फिर 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि एंडोसाइटिक मार्ग के साथ अवशिष्ट डाई को लाइसोसोम में जमा होने की अनुमति मिल सके।
    नोट: एंडोसोम को दागने के लिए, डीएमईएम में 1 μM AlPCS2a में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10% एफबीएस होता है। इसके बाद, पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं और इमेजिंग से पहले उन्हें पूर्व-गर्म माध्यम में इनक्यूबेट करें।

Figure 1
चित्र 1. एक योजनाबद्ध आंकड़ा जो AlPCS2a के साथ चयनात्मक IV क्षति का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़ा चयनात्मक IV क्षति के योजनाबद्धता को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. AlPCS2a के साथ लाइसोसोमल धुंधलापन। हेला कोशिकाओं में 1 μM AlPCS2a के साथ रात भर लेबल किए गए लाइसोसोम सकारात्मक रूप से 50 एनएम हरे फ्लोरोसेंट डाई से दागदार होते हैं। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. नमूना इमेजिंग और प्रकाश रोशनी

नोट: एक एकल कोशिका के उपकोशिकीय क्षेत्र के भीतर IV क्षति या एक संस्कृति डिश में सभी AlPCS 2a-लेबल कोशिकाओं का प्रदर्शन किया जा सकता है। पूरे कल्चर डिश की थोक रोशनी जैव रासायनिक अध्ययन सहित इस क्षति के मात्रात्मक अध्ययन की अनुमति देती है।

  1. एक एकल कोशिका के भीतर लाइसोसोम को नुकसान पहुंचाकर एकल कोशिकाओं में हेरफेर करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. संस्कृति पकवान को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें। रोमांचक जीएफपी और एएलपीसीएस 2 ए के लिए क्रमशः 488 एनएम और 561 एनएम लेजर का उपयोग करें।
    2. AlPCS 2a-लेबल पुटिकाओं पर 5 x 5 μm2 रुचि क्षेत्र (ROI) को सर्कल करें जिन्हें क्षतिग्रस्त होने के लिए चुना गया है।
    3. पल्स 70 दोहराव के लिए 0.21 मेगावाट के 633 एनएम लेजर के साथ आरओआई को रोशन करता है। लाइसोसोमल झिल्ली परमेबिलाइजेशन के संकेतक के रूप में गैल 3 पंक्टा के गठन की निगरानी करें।
  2. नीचे वर्णित संस्कृति डिश में सभी लेबल कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाते हैं।
    1. संस्कृति पकवान को एक मंच पर रखें। डिश को 660 एनएम कोलिमेटेड एलईडी लाइट के साथ रोशन करें (निकट-अवरक्त प्रकाश एएलपीसीएस 2 ए के उत्तेजना स्पेक्ट्रम पर आदर्श आधार है)।
    2. माइक्रोस्कोप पर कल्चर डिश रखें और चरण 4.1.3 में उल्लिखित झिल्ली परमेबिलाइजेशन के संकेतकों की निगरानी करें।
  3. निम्नलिखित संकेतकों का उपयोग करके आईवीएस की चोट का आकलन करें।
    1. एंडोसोम या लाइसोसोम की सामग्री सबसे अधिक ग्लाइकोसिलेटेड होती है, जो आईवी टूटने पर साइटोसोल के संपर्क में आती है। गैलेक्टिन -1, गैलेक्टिन -3, गैलेक्टिन -8 और गैलेक्टिन -916,20 सहित साइटोसोलिक ग्लाइकन-बाइंडिंग गैलेक्टिन का उपयोग करके इन्हें तेजी से लेबल करें।
    2. घाव का आकार झिल्ली-अभेद्य डाई की रिहाई से निर्धारित किया जा सकता है जैसा कि21 में वर्णित है।
    3. एंडोसोम और लाइसोसोम के बीच का अंतर उनके ल्यूमिनल पीएच मान हैं। लाइसोसोमल टूटना ल्यूमिनल पीएच को परेशान करता है, जिसे पीएच-संवेदनशील डाई का उपयोग करके मापा जा सकता है, जैसे कि एफआईटीसी-डेक्सट्रान3।

Figure 3
चित्र 3. एएलपीसीएस2 ए-मध्यस्थता सीएएलआई रोशनी क्षेत्र के भीतर लाइसोसोम के लिए टैगआरएफपी-गैलेक्टिन -3 (गैल 3) की स्थानीय भर्ती को प्रेरित करता है। टैगआरएफपी-गैलेक्टिन-3-व्यक्त हेला कोशिकाओं में लाइसोसोम को रात भर 1 μM AlPCS2a के साथ दाग दिया गया था, इसके बाद पीले वर्ग के भीतर निकट-अवरक्त प्रकाश (633 एनएम) के साथ रोशनी पर ध्यान केंद्रित किया गया था। पीले वर्ग के भीतर एएलपीएस2 ए सिग्नल को फोटोब्लीच किया जाता है, साथ ही टैगआरएफपी-गैलेक्टिन -3 पंक्टा का गठन होता है। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

एंडोसोम और लाइसोसोम सहित IV के AlPCS2a-प्रेरित क्षति का प्रतिनिधित्व करने वाला एक योजनाबद्ध आंकड़ा दिखाया गया है (चित्रा 1)।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मार्करों का उपयोग AlPCS2a धुंधला स्थितियों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, AlPCS 2a puncta और ग्रीन फ्लोरोसेंट डाई22 कोलोकलाइजेशन (चित्रा 2)।

फ्लोरोफोर-लेबल गैलेक्टिन -3 को IV क्षति की निगरानी के लिए एक संकेतक के रूप में लागू किया जा सकता है (चित्रा 3)। इसके अलावा, गैल 3 पंक्टा के स्थान को डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्ग को मापने के लिए भी ट्रैक किया जा सकता है, जिसमें लाइसोसोम मरम्मत और लाइसोफैगी 3,23 शामिल हैं। साइटोसोल से क्षतिग्रस्त IV तक गैल 3 के तेजी से संचय से गैल 3 की तीव्रता में काफी वृद्धि होगी, जो गैल 3 पुंटा की तीव्रता को संतृप्त कर देगा यदि छवियों के विपरीत को साइटोसोलिक गैल 3 दिखाने के लिए समायोजित किया जाता है। वास्तव में, छवियों ने साइटोसोलिक गैल 3 में थोड़ी कमी भी दिखाई।

सारांश में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एएलपीसीएस2 ए-आधारित सीएएलआई आरओआई के भीतर स्थानीय लाइसोसोमल टूटने को नियंत्रित करने में सक्षम है, जिससे बाकी लाइसोसोम बरकरार हैं।

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Discussion

एएलपीएस2 ए प्लाज्मा झिल्ली को बांधता है, फिर एंडोसाइटोसिस द्वारा आंतरिक होता है और अंततः लाइसोसोम में जमा होता है। इस प्रकार इनक्यूबेशन अवधि को समायोजित करके एएलपीएस2 ए को उपकोशिकीय डिब्बों में स्थानीयकृत किया जा सकता है। इस पद्धति की एक सीमा यह है कि आईवीएस की केवल एक उप-आबादी को एंडोसाइटोसिस के माध्यम से एएलपीएस2 ए द्वारा लेबल किया जा सकता है क्योंकि आईवीएस के कई अन्य झिल्ली स्रोत हैं, जैसे ईआर और गोल्गी तंत्र। इसके अलावा, प्रारंभिक या देर से एंडोसोम में एएलपीएस2 ए का चयनात्मक लेबलिंग चुनौतीपूर्ण होगा, हालांकि, फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग उपकोशिकीय इमेजिंग के दौरान देर से गठित एंडोसोम से शुरुआती गठित एंडोसोम को अलग करने के लिए किया जा सकता है। सीएएलआई-प्रेरित IV क्षति को विभिन्न प्रकार के रंगों 3,24 के साथ प्रेरित किया जासकता है।

क्षति की तीव्रता को प्रकाश की शक्ति और रोशनी की अवधि द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। क्षति की उच्च तीव्रता के परिणामस्वरूप कोशिका सिकुड़ या परिगलन हो सकता है। यहां, IV क्षति के कई संकेतक दिखाए गए हैं, जिनका उपयोग प्रयोगात्मक स्थितियों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ये संकेतक क्षतिग्रस्त-आईवी के लिए मार्कर के रूप में भी काम कर सकते हैं और समय के साथ उनके उपकोशिकीय वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

नैदानिक रूप से, AlPCS2a को फोटोकैमिकल आंतरिककरण (PCI)25 के माध्यम से साइट और समय-विशिष्ट तरीके से चिकित्सीय एजेंटों के वितरण में सुधार करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, अपरिहार्य दुष्प्रभाव, जैसे सेल एपोप्टोसिस या भेदभाव, पीसीआई उपचार26 के साथ भी हो सकते हैं। चूंकि इस तरह के प्रभाव लाइसोसोमल क्षति के प्रेरण का परिणाम हो सकते हैं, इसलिए प्रदान किए गए परख प्रीक्लिनिकल उपयोग के लिए एक संभावित उपकरण प्रस्तुत करते हैं।

इस अध्ययन में, एएलपीसीएस2 ए-मध्यस्थता सीएएलआई प्रोटोकॉल क्षति आकार (स्थानीय और एंडोसोम या लाइसोसोम का हिस्सा) के चयनात्मक नियंत्रण का वर्णन करते हैं। वैज्ञानिक उनके उपकोशिकीय व्यवहार की निगरानी कर सकते हैं, जबकि बाकी आईवी बरकरार रहते हैं और उन्हें नियंत्रण के रूप में माना जा सकता है। इस पद्धति को कई अध्ययनों में लागू किया गया है। उदाहरण के लिए, क्षतिग्रस्त लाइसोसोम को यूबिकिटिन और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन लाइट चेन 3 (एलसी 3) के साथ क्रमिक रूप से लेबल किया जाता है, और ऑटोफैजिक क्लीयरेंस 3 से गुजरनापड़ता है। इसके अलावा, क्षतिग्रस्त एंडोसोम पर गैलेक्टिन -3 और गैलेक्टिन -8 लेबलिंग को सेल सतह ग्लाइकन27 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। चूंकि पीसीआई के लिए विवो में एएलपीएस 2 ए का उपयोग किया गया है, इसलिए वीवो में एएलपीसीएस2 ए-मध्यस्थता सीएएलआई का भी उपयोग किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल AlPCS 2a-मध्यस्थ CAL का उपयोग करके सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है। ये अध्ययन समर्थन करते हैं कि एएलपीसीएस2 ए-मध्यस्थता सीएएलआई सेल जीव विज्ञान अध्ययन के लिए एक मजबूत उपकरण है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक अनुसंधान समर्थन के लिए अकादमिक सिनिका इन्फ्लेमेशन कोर सुविधा, आईबीएमएस को धन्यवाद देना चाहते हैं। कोर सुविधा को अकादमिक सिनिका कोर सुविधा और अभिनव उपकरण परियोजना (एएस-सीएफआई-111-213) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। लेखक छवि अधिग्रहण में सहायता के लिए इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल साइंसेज (आईबीएमएस), एकेडेमिया सिनिका (एएस) के सामान्य उपकरण कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) Frontier Scientific P40632
Culture dish ibidi 812128-200
Culture Medium DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM Gibco 11965092
FBS Thermo Fisher Scientific A4736301
Gal3-GFP plasmid addgene
Lipofectamine 3000 kit Thermo Fisher Scientific L3000008
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526 green fluorescent dye
Multiwall plate perkinelmer PK-6005550
NaOH Thermo Fisher Scientific Q15895
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 31985070
Penicillin-streptomycin Gibco 15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line ATCC CCL-2 The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter Merck SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm) Thorlabs M660L3-C1 and DC2100 Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy Carl Zeiss LSM 780 An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific
Red LED light Tholabs M660L4-C1

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 193
इंट्रासेल्युलर पुटिका टूटना के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक फोटोडायनामिक दृष्टिकोण
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Hung, Y. H., Wang, H. J., Wang, J.… More

Hung, Y. H., Wang, H. J., Wang, J. S., Hsu, C. H., Chen, H. Y. A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture. J. Vis. Exp. (193), e63962, doi:10.3791/63962 (2023).

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