Summary
L’inactivation laser assistée par chromophore (CALI) médiée par AlPcS2a est un outil puissant pour étudier les dommages spatio-temporels des vésicules intracellulaires (IV) dans les cellules vivantes.
Abstract
Les vésicules intracellulaires (IV) sont formées par endocytose des vésicules dans le cytoplasme. La formation IV est impliquée dans l’activation de diverses voies de signal par perméabilisation des membranes IV et la formation d’endosomes et de lysosomes. Une méthode appelée inactivation laser assistée par chromophore (CALI) est appliquée pour étudier la formation des IV et les matériaux dans le contrôle de la régulation IV. CALI est une méthodologie photodynamique basée sur l’imagerie pour étudier la voie de signalisation induite par la perméabilisation membranaire. La méthode permet de perméabiliser la manipulation spatio-temporelle de l’organite sélectionné dans une cellule. La méthode CALI a été appliquée pour observer et surveiller des molécules spécifiques par perméabilisation d’endosomes et de lysosomes. La rupture membranaire des IV est connue pour recruter sélectivement des protéines liant les glycanes, telles que la galectine-3. Ici, le protocole décrit l’induction de la rupture IV par AlPcS2a et l’utilisation de la galectine-3 comme marqueur pour marquer les lysosomes altérés, ce qui est utile pour étudier les effets en aval de la rupture de la membrane IV et leurs effets en aval dans diverses situations.
Introduction
Les endosomes, un type de vésicule intracellulaire (IV), sont formés par endocytose et mûrissent ensuite en lysosomes. Diverses voies de signal intracellulaires sont impliquées dans la formation des IV; De plus, différents stimuli intrinsèques et extrinsèques peuvent endommager les IV (p. ex., les agents pathogènes peuvent s’échapper de la membrane limitée pendant l’infection et entrer dans le cytoplasme1). Cela s’accompagne généralement de la rupture des vésicules endocytotiques2. Par conséquent, les techniques de ciblage et d’endommagement des IV peuvent être utilisées dans des études connexes3.
La thérapie photodynamique (PDT) est une thérapie dépendante de la lumière pour lutter contre les maladies en tuant les tumeurs ou les agents pathogènes4. Dans la PDT, les cellules ciblées sont marquées avec des chromophores non toxiques, appelés photosensibilisants, qui peuvent être activés localement par l’éclairage lumineux 5,6. Les photosensibilisateurs absorbent l’énergie de la lumière et se transforment en un état singulet excité, conduisant à l’état triplet excité à longue durée de vie. Les photosensibilisateurs de l’état triplet peuvent subir un transfert d’électrons ou d’énergie et former des espèces réactives de l’oxygène (ROS) en présence d’oxygène, et peuvent détruire spatialement les cellules marquées dans la région d’illumination7. La conséquence varie en fonction de la puissance de la lumière8. En contrôlant la concentration de photosensibilisateurs et l’intensité de l’éclairage lumineux, les biomolécules ciblées peuvent être sélectivement inactivées sans lyse cellulaire, appelée inactivation de la lumière assistée par chromophore (CALI)9. Avec le développement significatif de photosensibilisateurs capables de marquer sélectivement diverses cibles subcellulaires, CALI est devenu un outil précieux pour contrôler l’inactivation médiée par la lumière des biomolécules pour les petites biomolécules telles que les nucléotides et les protéines, ainsi que les organites tels que les mitochondries et les endo-lysosomes 3,10,11,12,13.
Par rapport à CALI, des méthodes chimiques ou physiques sont également utilisées pour altérer les membranes, telles que la toxine bactérienne 14,15 et le traitement Leu-Leu-OMe16 pour les lésions lysosomales. Cependant, ces méthodes présentent une altération massive des IV dans les cellules. Des photosensibilisateurs robustes (c.-à-d. l’acide disulfonique de chlorure de phtalocyanine Al(III) (AlPcS2a)) sont utilisés dans le CALI; AlPcS2a, ciblant les lysosomes par endocytose, est utilisé pour rompre des endosomes ou des lysosomes dans une région contrôlée17. AlPcS2a est un chromophore à base de phtalocyanine imperméable à la membrane cellulaire qui se lie aux lipides sur la membrane plasmique et est internalisé par endocytose et finit par s’accumuler dans le lysosome par la voie endocytaire18. Il absorbe la lumière dans une région spectrale proche infrarouge et génère de l’oxygène singulet, un ROS majeur généré par AlPcS2a18 excité. La désintégration de l’oxygène singulet limite rapidement sa diffusion et sa distance de réaction dans une minuscule région dans les cellules (environ 10-20 nm)19. En ajustant la durée d’incubation d’AlPcS2a et l’éclairage lumineux, le contrôle spatio-temporel des dommages des IV dans une zone subcellulaire est autorisé. CALI devient donc un outil puissant pour examiner les conséquences des dommages intraveineux, ainsi que la formation et la régulation des intraveineuses.
Dans cette étude, un protocole spécifique de CALI utilisant AlPcS2a comme photosensibilisateur est abordé. Ce protocole peut être appliqué à divers types d’intraveineuses, y compris les endosomes et les lysosomes, et utilisé pour examiner les réponses de suivi après la rupture de la membrane. Des cellules HeLa exprimant la galectine-3 conjuguée fluorophore-316,20 révélée après rupture du lysosome sont utilisées pour démontrer ce protocole.
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Protocol
1. Préparation du stock AlPcS2a
- Dissoudre 10 mg d’AlPcS2a dans 400 μL de NaOH 0,1 M. Pour améliorer la solubilité, chauffer la solution à 50 °C et vortex.
- Mélanger la solution avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ensuite, filtrer la solution avec un filtre de 0,22 μm pour éliminer les précipités insolubles.
- Mesurer la concentration de la solution à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Le coefficient d’extinction de AlPcS2a à 672 nm est de 4 x 104 cm-1 M-1. Diluer la solution AlPcS2a avec du PBS pour obtenir une solution de 1 mM. Préparer 1 mL d’aliquotes et conserver à -20 °C.
2. Transfection
NOTE: Gal3-GFP est appliqué comme indicateur pour l’imagerie de cellules vivantes de la rupture lysosomale.
- Maintenir la culture cellulaire HeLa dans du DMEM complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Après avoir lavé les cellules avec du PBS, trypsiniser les cellules, puis remettre en suspension les cellules dans du DMEM complété par 10% de FBS.
REMARQUE: La méthode est applicable à la plupart des lignées cellulaires attachées, y compris les lignées cellulaires HeLa et A549. En principe, bien qu’ils n’aient pas testé de cellules en suspension, des tests CALI pourraient être effectués avec celles-ci. - Diluer 300 ng de plasmide Gal3-GFP dans 25 μL de milieu sérique réduit, puis ajouter 0,6 μL de réactif P3000. Mélanger délicatement. Diluer 0,45 μL de réactif Lipofectamine 3000 dans 25 μL de milieu sérique réduit. Mélanger délicatement.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante. Mélanger l’ADN dilué et la lipofectamine 3000 diluée, puis incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Mélanger le mélange ADN-lipofectamine, 3 x 105 cellules HeLa en suspension et 200 μL de DMEM + 10% FBS, puis ensemencer les cellules sur la région vitrée centrale d’un plat bouton en verre de 35 mm.
3. Coloration AlPcS2a
- Pour permettre la fixation des cellules, incuber les cellules à 37 °C dans l’incubateur alimenté avec 5% de CO2 pendant au moins 4 h.
- Diluer AlPcS 2a dans du DMEM complété avec 10% de FBS pour obtenir une solution d’AlPcS2a de 1 μM. Préchauffer le milieu contenant de l’AlPcS2a dans un bain-marie à 37 °C. Remplacez le milieu de culture par le milieu contenant de l’AlPcS2a.
- Incuber les cellules à 37 °C dans l’incubateur alimenté avec 5% de CO2 pendant une nuit (16-18 h).
- Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l’AlPcS2a extracellulaire. Remplacer le milieu par un milieu frais, puis incuber à 37 °C pendant 4 h pour permettre au colorant résiduel le long de la voie endocytaire de s’accumuler en lysosomes.
NOTE: Pour colorer les endosomes, incuber des cellules dans 1 μM AlPcS2a dans DMEM contenant 10% FBS pendant 15 min à 37 °C. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS et incuberez-les dans un milieu préchauffé avant l’imagerie.
Graphique 1. Figure schématique représentant les dommages IV sélectifs avec AlPcS2a. La figure montre les schémas des dommages intraveineux sélectifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Coloration lysosomale avec AlPcS2a. Les lysosomes marqués pendant la nuit avec 1 μM AlPcS2a dans les cellules HeLa sont colorés positivement avec un colorant fluorescent vert de 50 nM. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Imagerie des échantillons et éclairage lumineux
REMARQUE: Des dommages IV dans une région sous-cellulaire d’une seule cellule ou de toutes les cellules marquées AlPcS2a dans une boîte de culture peuvent être effectués. L’éclairage en vrac de l’ensemble de la boîte de culture permet une étude quantitative de ces dommages, y compris des études biochimiques.
- Manipuler des cellules individuelles en endommageant les lysosomes dans une seule cellule, comme décrit ci-dessous.
- Placez la capsule de culture sur la scène d’un microscope confocal. Utilisez les lasers 488 nm et 561 nm pour exciter GFP et AlPcS2a, respectivement.
- Encerclez une région d’intérêt (ROI) de 5 x 5 μm2 sur les vésicules marquées AlPcS2a qui sont sélectionnées pour être endommagées.
- Pulse illumine le ROI avec un laser 633 nm de 0,21 mW pour 70 répétitions. Surveiller la formation de Gal3 puncta comme indicateur de perméabilisation de la membrane lysosomale.
- Endommagez toutes les cellules marquées dans une boîte de culture comme décrit ci-dessous.
- Placez le plat de culture sur une plate-forme. Illuminer la parabole avec 660 nm de lumière LED collimatée (la lumière proche infrarouge est une base idéale sur le spectre d’excitation d’AlPcS2a).
- Placer la capsule de culture sur le microscope et surveiller les indicateurs de perméabilisation membranaire comme mentionné à l’étape 4.1.3.
- Évaluer les blessures des intraveineuses à l’aide des indicateurs suivants.
- Le contenu de l’endosome ou du lysosome est le plus fortement glycosylé, qui est exposé au cytosol lors de la rupture IV. Marquez-les rapidement à l’aide de galectines cytosoliques liant le glycane, y compris la galectine-1, la galectine-3, la galectine-8 et la galectine-916,20.
- La taille de la plaie peut être déterminée par la libération d’un colorant imperméable à la membrane comme décrit en21.
- La différence entre les endosomes et les lysosomes réside dans leur pH luminal. La rupture lysosomale perturbe le pH luminal, qui peut être mesuré à l’aide d’un colorant sensible au pH, tel que FITC-dextran3.
Graphique 3. Le CALI médié par AlPcS2a induit le recrutement local de TagRFP-galectin-3 (Gal3) dans les lysosomes dans la région d’illumination. Les lysosomes dans les cellules HeLa exprimées en TagRFP-galectine-3 ont été colorés pendant la nuit avec 1 μM AlPcS2a, suivis d’une illumination de focalisation avec une lumière proche infrarouge (633 nm) dans le carré jaune. Le signal AlPcS2a dans le carré jaune est photoblanchi, accompagné de la formation de TagRFP-galectin-3 puncta. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Une figure schématique représentant les dommages intraveineux induits par AlPcS2a, y compris l’endosome et le lysosome, a été montrée (Figure 1).
Des marqueurs disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour déterminer les conditions de coloration AlPcS2a . Par exemple, AlPcS 2apuncta et colorant fluorescent vert22 colocalisation (Figure 2).
La galectine-3 marquée au fluorophore peut être appliquée comme indicateur pour surveiller les dommages IV (Figure 3). De plus, l’emplacement de Gal3 puncta a également pu être suivi pour tester la voie de signalisation en aval, y compris la réparation des lysosomes et la lysophagie 3,23. L’accumulation rapide de Gal3 du cytosol à l’IV endommagée augmenterait considérablement l’intensité de Gal3, ce qui rendrait l’intensité de la puncta Gal3 saturée si le contraste des images est ajusté pour montrer Gal3 cytosolique. En fait, les images ont également montré une légère diminution de Gal3 cytosolique.
En résumé, ces résultats indiquent que le CALI basé sur AlPcS2a est capable de contrôler la rupture lysosomale locale dans le ROI, laissant le reste des lysosomes intacts.
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Discussion
AlPcS2a se lie à la membrane plasmique, puis est internalisé par endocytose et finit par s’accumuler dans les lysosomes. AlPcS2a peut ainsi être localisé dans les compartiments subcellulaires en ajustant la durée d’incubation. Une limite de cette méthodologie est que seule une sous-population d’IV pourrait être marquée par AlPcS2a par endocytose, car il existe de nombreuses autres sources membranaires d’IV, telles que les appareils ER et Golgi. En outre, le marquage sélectif d’AlPcS2a dans les endosomes précoces ou tardifs serait difficile, cependant, des marqueurs fluorescents peuvent être utilisés pour différencier les endosomes formés tôt des endosomes formés tardivement lors de l’imagerie subcellulaire. Les dommages IV induits par CALI peuvent être induits avec une variété de colorants 3,24.
L’intensité des dommages peut être contrôlée par la puissance et la durée d’éclairage de la lumière. Une intensité plus élevée des dommages peut entraîner un rétrécissement cellulaire ou une nécrose. Ici, plusieurs indicateurs de dommages IV ont été montrés, qui pourraient être utilisés pour déterminer les conditions expérimentales. De plus, ces indicateurs peuvent également servir de marqueurs pour les IV endommagés et fournir des informations sur leur distribution subcellulaire au fil du temps.
Sur le plan clinique, AlPcS2a est conçu pour améliorer l’administration d’agents thérapeutiques d’une manière spécifique au site et au temps grâce à l’internalisation photochimique (PCI)25. Cependant, des effets secondaires inévitables, tels que l’apoptose cellulaire ou la différenciation, peuvent également accompagner le traitement PCI26. Étant donné que de tels effets peuvent être la conséquence de l’induction de lésions lysosomales, les tests fournis présentent un outil potentiel pour une utilisation préclinique.
Dans cette étude, les protocoles CALI médiés par AlPcS2a décrivent le contrôle sélectif de la taille des dommages (locaux et une partie des endosomes ou des lysosomes). Les scientifiques peuvent surveiller leur comportement subcellulaire, tandis que le reste des IV restent intacts et pourraient être traités comme un contrôle. Cette méthodologie a été appliquée dans plusieurs études. Par exemple, les lysosomes endommagés sont marqués séquentiellement avec l’ubiquitine et la chaîne légère de protéines 3 associée aux microtubules (CL3), et subissent une clairance autophagique3. De plus, le marquage de la galectine-3 et de la galectine-8 sur les endosomes endommagés est contrôlé par le glycane27 de surface cellulaire. Étant donné que AlPcS2a a été utilisé in vivo pour l’ICP, le CALI médié par AlPcS2a pourrait également être utilisé in vivo. Ce protocole fournit un outil robuste pour étudier la biologie cellulaire à l’aide de CALI médié par AlPcS2a. Ces études soutiennent que le CALI médié par AlPcS2a est un outil robuste pour les études de biologie cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier l’Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS pour son soutien à la recherche. L’installation de base est financée par le projet d’instrument de base et d’instrument novateur de l’Academia Sinica (AS-CFII-111-213). Les auteurs remercient l’installation de base d’équipement commun de l’Institut des sciences biomédicales (IBMS), Academia Sinica (AS) pour avoir aidé à l’acquisition d’images.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
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