Summary
L'inattivazione laser assistita da cromoforo mediata da AlPcS2a (CALI) è un potente strumento per studiare il danno spaziotemporale delle vescicole intracellulari (IV) nelle cellule vive.
Abstract
Le vescicole intracellulari (IV) si formano attraverso l'endocitosi delle vescicole nel citoplasma. La formazione IV è coinvolta nell'attivazione di varie vie di segnale attraverso la permeabilizzazione delle membrane IV e la formazione di endosomi e lisosomi. Un metodo chiamato inattivazione laser assistita da cromoforo (CALI) viene applicato per studiare la formazione di IV e i materiali nel controllo della regolazione IV. CALI è una metodologia fotodinamica basata sull'imaging per studiare la via di segnalazione indotta dalla permeabilizzazione della membrana. Il metodo consente la manipolazione spaziotemporale dell'organello selezionato da permeabilizzare in una cellula. Il metodo CALI è stato applicato per osservare e monitorare molecole specifiche attraverso la permeabilizzazione di endosomi e lisosomi. La rottura della membrana delle flebo è nota per reclutare selettivamente proteine leganti i glicani, come la galectina-3. Qui, il protocollo descrive l'induzione della rottura IV da parte di AlPcS2a e l'uso della galectina-3 come marcatore per marcare i lisosomi alterati, che è utile nello studio degli effetti a valle della rottura della membrana IV e dei loro effetti a valle in varie situazioni.
Introduction
Gli endosomi, un tipo di vescicola intracellulare (IV), sono formati dall'endocitosi e poi maturano in lisosomi. Varie vie di segnale intracellulare sono coinvolte nella formazione delle flebo; inoltre, diversi stimoli intrinseci ed estrinseci possono danneggiare le flebo (ad esempio, i patogeni possono sfuggire dalla membrana limitata durante l'infezione ed entrare nel citoplasma1). Questo di solito è accompagnato dalla rottura delle vescicole endocitotiche2. Pertanto, le tecniche per colpire e danneggiare le flebo possono essere utilizzate in studi correlati3.
La terapia fotodinamica (PDT) è una terapia dipendente dalla luce per combattere le malattie uccidendo tumori o agenti patogeni4. Nella PDT, le cellule bersaglio sono marcate con cromofori non tossici, chiamati fotosensibilizzatori, che possono essere attivati localmente dall'illuminazione della luce 5,6. I fotosensibilizzatori assorbono energia dalla luce e si trasformano in uno stato di singoletto eccitato, portando allo stato di tripletta eccitata di lunga durata. I fotosensibilizzatori dello stato di tripletto possono subire un trasferimento di elettroni o energia e formare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in presenza di ossigeno e possono distruggere spazialmente le cellule marcate all'interno della regione di illuminazione7. La conseguenza varia a seconda della potenza della luce8. Controllando la concentrazione di fotosensibilizzatori e l'intensità dell'illuminazione della luce, le biomolecole mirate possono essere inattivate selettivamente senza lisi cellulare, definita come inattivazione della luce assistita da cromofori (CALI)9. Con il significativo sviluppo di fotosensibilizzatori in grado di marcare selettivamente vari bersagli subcellulari, CALI è diventato uno strumento prezioso per controllare l'inattivazione mediata dalla luce di biomolecole per piccole biomolecole come nucleotidi e proteine, nonché organelli come mitocondri ed endolisosomi 3,10,11,12,13.
Rispetto al CALI, vengono utilizzati anche metodi chimici o fisici per compromettere le membrane, come la tossina batterica 14,15 e il trattamento Leu-Leu-OMe16 per il danno lisosomiale. Tuttavia, questi metodi mostrano una compromissione di massa delle flebo all'interno delle cellule. Fotosensibilizzanti robusti (cioè acido disolfonico cloruro di ftalocianina Al(III) (AlPcS2a)) sono utilizzati in CALI; AlPcS2a, che colpisce i lisosomi attraverso l'endocitosi, viene utilizzato per rompere endosomi o lisosomi in una regione controllata17. AlPcS2a è un cromoforo a base di ftalocianina impermeabile alla membrana cellulare che si lega ai lipidi sulla membrana plasmatica e viene internalizzato attraverso l'endocitosi e alla fine si accumula all'interno del lisosoma attraverso la via endocitica18. Assorbe la luce all'interno di una regione spettrale del vicino infrarosso e genera ossigeno singoletto, un importante ROS generato da AlPcS2a18 eccitato. Il decadimento dell'ossigeno singoletto limita rapidamente la sua diffusione e distanza di reazione all'interno di una piccola regione nelle cellule (circa 10-20 nm)19. Regolando la durata dell'incubazione di AlPcS2a e l'illuminazione della luce, è consentito il controllo spaziotemporale del danno delle flebo all'interno di un'area subcellulare. CALI diventa quindi un potente strumento per esaminare le conseguenze del danno IV e la formazione e la regolazione delle IV.
In questo studio, viene affrontato un protocollo specifico di CALI che utilizza AlPcS2a come fotosensibilizzatore. Questo protocollo può essere applicato a vari tipi di flebo, inclusi endosomi e lisosomi, e utilizzato per esaminare le risposte di follow-up dopo la rottura della membrana. Le cellule HeLa che esprimono galectina-3 coniugata con fluorofori 16,20 rivelate dopo la rottura del lisosoma sono utilizzate per dimostrare questo protocollo.
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Protocol
1. Preparazione delle scorte AlPcS2a
- Sciogliere 10 mg di AlPcS2a in 400 μL di 0,1 M NaOH. Per migliorare la solubilità, riscaldare la soluzione a 50 °C e vortice.
- Mescolare la soluzione con 4 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Quindi, filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm per rimuovere i precipitati insolubili.
- Misurare la concentrazione della soluzione attraverso uno spettrofotometro UV-Vis. Il coefficiente di estinzione di AlPcS2a a 672 nm è 4 x 104 cm-1 M-1. Diluire la soluzione AlPcS2a con PBS per ottenere una soluzione da 1 mM. Preparare 1 mL di aliquote e conservare a -20 °C.
2. Trasfezione
NOTA: Gal3-GFP viene applicato come indicatore per l'imaging delle cellule vive della rottura lisosomiale.
- Mantenere la coltura cellulare HeLa in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Dopo aver lavato le cellule con PBS, tripsinizzare le cellule, quindi risospendere le cellule in DMEM integrato con FBS al 10%.
NOTA: il metodo è applicabile alla maggior parte delle linee cellulari collegate, comprese le linee cellulari HeLa e A549. In linea di principio, nonostante non si verifichino le celle in sospensione, i test CALI potrebbero essere eseguiti con esse. - Diluire 300 ng di plasmide Gal3-GFP in 25 μL di mezzo sierico ridotto, quindi aggiungere 0,6 μL di reagente P3000. Mescolare delicatamente. Diluire 0,45 μL di reagente Lipofectamine 3000 in 25 μL di terreno sierico ridotto. Mescolare delicatamente.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Mescolare DNA diluito e Lipofectamine 3000 diluito, quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Mescolare la miscela DNA-Lipofectamina, 3 x 105 cellule HeLa sospese e 200 μL di DMEM + 10% FBS, quindi seminare le cellule sulla regione centrale del vetro di un pulsante di vetro da 35 mm.
3. Colorazione AlPcS2a
- Per consentire l'attacco della cella, incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore alimentato con il 5% di CO2 per almeno 4 ore.
- Diluire AlPcS2a in DMEM integrato con FBS al 10% per ottenere una soluzione di AlPcS2a da 1 μM. Preriscaldare il mezzo contenente AlPcS2a a bagnomaria a 37 °C. Sostituire il terreno di coltura con il terreno contenente AlPcS2a.
- Incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore alimentato con il 5% di CO2 durante la notte (16-18 h).
- Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere AlPcS2a extracellulare. Sostituire il terreno con terreno fresco, quindi incubare a 37 °C per 4 ore per consentire al colorante residuo lungo la via endocitica di accumularsi nei lisosomi.
NOTA: Per colorare gli endosomi, incubare le cellule in 1 μM AlPcS2a in DMEM contenente il 10% di FBS per 15 minuti a 37 °C. Quindi, lavare le cellule due volte con PBS e incubarle in un mezzo preriscaldato prima dell'imaging .
Figura 1. Una figura schematica che rappresenta il danno IV selettivo con AlPcS2a. La figura mostra gli schemi del danno IV selettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Colorazione lisosomiale con AlPcS2a. I lisosomi marcati durante la notte con 1 μM AlPcS2a nelle cellule HeLa sono colorati positivamente con colorante fluorescente verde 50 nM. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Imaging del campione e illuminazione della luce
NOTA: È possibile eseguire danni IV all'interno di una regione subcellulare di una singola cellula o di tutte le cellule marcate con AlPcS2a in un piatto di coltura. L'illuminazione di massa dell'intero piatto di coltura consente lo studio quantitativo di questo danno, compresi gli studi biochimici.
- Manipolare singole cellule danneggiando i lisosomi all'interno di una singola cellula, come descritto di seguito.
- Posiziona il piatto di cultura sul palcoscenico di un microscopio confocale. Utilizzare i laser a 488 nm e 561 nm per emozionare GFP e AlPcS2a, rispettivamente.
- Cerchiare una regione di interesse (ROI) 5 x 5 μm2 sulle vescicole marcate AlPcS2a selezionate per essere danneggiate.
- Pulse illumina il ROI con un laser a 633 nm da 0,21 mW per 70 ripetizioni. Monitorare la formazione di Gal3 puncta come indicatore di permeabilizzazione della membrana lisosomiale.
- Danneggiare tutte le cellule etichettate in un piatto di coltura come descritto di seguito.
- Posiziona il piatto di cultura su una piattaforma. Illuminare il piatto con 660 nm di luce LED collimata (la luce nel vicino infrarosso è la base ideale sullo spettro di eccitazione di AlPcS2a).
- Posizionare il piatto di coltura sul microscopio e monitorare gli indicatori di permeabilizzazione della membrana come indicato al punto 4.1.3.
- Valutare le lesioni delle flebo utilizzando i seguenti indicatori.
- Il contenuto dell'endosoma o del lisosoma è più altamente glicosilato, che sono esposti al citosol dopo la rottura IV. Etichettarli rapidamente usando galectine leganti i glicani citosolici, tra cui galectina-1, galectina-3, galectina-8 e galectina-916,20.
- La dimensione della ferita può essere determinata dal rilascio di colorante impermeabile alla membrana come descritto in21.
- La differenza tra endosomi e lisosomi è il loro valore di pH luminale. La rottura lisosomiale perturba il pH luminale, che può essere misurato utilizzando coloranti sensibili al pH, come il FITC-destrano3.
Figura 3. Il CALI mediato da AlPcS2a induce il reclutamento locale di TagRFP-galectina-3 (Gal3) nei lisosomi all'interno della regione di illuminazione. I lisosomi nelle cellule HeLa espresse da TagRFP-galectina-3 sono stati colorati durante la notte con 1 μM AlPcS2a, seguiti dall'illuminazione focalizzata con luce nel vicino infrarosso (633 nm) all'interno del quadrato giallo. Il segnale AlPcS2a all'interno del quadrato giallo viene fotosbiancato, accompagnato dalla formazione di TagRFP-galectina-3 puncta. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Representative Results
È stata mostrata una figura schematica che rappresenta il danno IV indotto da AlPcS2a, inclusi endosoma e lisosoma (Figura 1).
I marcatori disponibili in commercio possono essere utilizzati per determinare le condizioni di colorazione di AlPcS2a . Ad esempio, AlPcS2a puncta e colorante fluorescente verde22 colocalizzazione (Figura 2).
La galectina-3 marcata con fluoroforo può essere applicata come indicatore per il monitoraggio del danno IV (Figura 3). Inoltre, la posizione di Gal3 puncta potrebbe anche essere monitorata per il dosaggio della via di segnalazione a valle, compresa la riparazione del lisosoma e la lisofagia 3,23. Il rapido accumulo di Gal3 dal citosol alla IV danneggiata aumenterebbe significativamente l'intensità di Gal3, il che renderebbe l'intensità del Gal3 puncta saturo se il contrasto delle immagini fosse regolato per mostrare Gal3 citosolico. Infatti, le immagini hanno anche mostrato una leggera diminuzione del Gal3 citosolico.
In sintesi, questi risultati indicano che il CALI basato su AlPcS2a è in grado di controllare la rottura lisosomiale locale all'interno del ROI, lasciando intatto il resto dei lisosomi.
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Discussion
AlPcS2a si lega alla membrana plasmatica, quindi viene internalizzato dall'endocitosi e alla fine si accumula nei lisosomi. AlPcS2a può quindi essere localizzato nei compartimenti subcellulari regolando la durata dell'incubazione. Una limitazione di questa metodologia è che solo una sottopopolazione di IV potrebbe essere marcata da AlPcS2a attraverso l'endocitosi perché ci sono molte altre fonti di membrana di IV, come l'apparato ER e di Golgi. Inoltre, la marcatura selettiva di AlPcS2a negli endosomi precoci o tardivi sarebbe impegnativa, tuttavia, i marcatori fluorescenti possono essere utilizzati per differenziare gli endosomi formati precocemente da quelli formati tardivamente durante l'imaging subcellulare. Il danno IV indotto da CALI può essere indotto con una varietà di coloranti 3,24.
L'intensità del danno può essere controllata dalla potenza e dalla durata dell'illuminazione della luce. Una maggiore intensità del danno può causare restringimento delle cellule o necrosi. Qui, sono stati mostrati diversi indicatori di danno IV, che potrebbero essere utilizzati per determinare le condizioni sperimentali. Inoltre, questi indicatori possono anche servire come marcatori per IV-danneggiati e fornire informazioni sulla loro distribuzione subcellulare nel tempo.
Clinicamente, AlPcS2a è progettato per migliorare la somministrazione di agenti terapeutici in modo specifico per sito e tempo attraverso l'internalizzazione fotochimica (PCI)25. Tuttavia, effetti collaterali inevitabili, come l'apoptosi o la differenziazione cellulare, possono anche accompagnare il trattamento PCI26. Poiché tali effetti possono essere la conseguenza dell'induzione di danno lisosomiale, i saggi forniti rappresentano un potenziale strumento per l'uso preclinico.
In questo studio, i protocolli CALI mediati da AlPcS2a descrivono il controllo selettivo della dimensione del danno (locale e parte degli endosomi o dei lisosomi). Gli scienziati possono monitorare il loro comportamento subcellulare, mentre il resto delle flebo rimane intatto e potrebbe essere trattato come un controllo. Questa metodologia è stata applicata in diversi studi. Ad esempio, i lisosomi danneggiati sono marcati sequenzialmente con ubiquitina e catena leggera 3 (LC3) associata a microtubuli e sottoposti a clearance autofagica3. Inoltre, la marcatura di galectina-3 e galectina-8 sugli endosomi danneggiati è controllata dal glicano27 della superficie cellulare. Poiché AlPcS2a è stato utilizzato in vivo per PCI, il CALI mediato da AlPcS2a potrebbe essere utilizzato anche in vivo. Questo protocollo fornisce uno strumento robusto per studiare la biologia cellulare utilizzando ALicS2a-mediato CALI. Questi studi supportano che il CALI mediato da AlPcS2a è uno strumento robusto per gli studi di biologia cellulare.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare l'Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS per il supporto alla ricerca. La struttura principale è finanziata dall'Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Gli autori ringraziano la Common Equipment Core Facility dell'Istituto di Scienze Biomediche (IBMS), Academia Sinica (AS) per aver assistito l'acquisizione delle immagini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
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