Summary
AlPcS2a-gemedieerde chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van spatiotemporale schade van intracellulaire blaasjes (IV's) in levende cellen.
Abstract
Intracellulaire blaasjes (IV's) worden gevormd door endocytose van blaasjes in cytoplasma. IV-formatie is betrokken bij het activeren van verschillende signaalroutes door permeabilisatie van IV-membranen en de vorming van endosomen en lysosomen. Een methode genaamd chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) wordt toegepast om de vorming van IV's en de materialen bij het beheersen van IV-regulatie te bestuderen. CALI is een op beeldvorming gebaseerde fotodynamische methodologie om de signaalroute geïnduceerd door membraanpermeabilisatie te bestuderen. De methode maakt het mogelijk om spatiotemporale manipulatie van het geselecteerde organel in een cel te permeabiliseren. De CALI-methode is toegepast om specifieke moleculen te observeren en te monitoren door de permeabilisatie van endosomen en lysosomen. Van de membraanruptuur van IV's is bekend dat het selectief glycaanbindende eiwitten rekrutert, zoals galectine-3. Hier beschrijft het protocol de inductie van IV-breuk door AlPcS2a en het gebruik van galectine-3 als een marker om aangetaste lysosomen te labelen, wat nuttig is bij het bestuderen van de stroomafwaartse effecten van IV-membraanruptuur en hun stroomafwaartse effecten onder verschillende situaties.
Introduction
Endosomen, een soort intracellulair blaasje (IV), worden gevormd door endocytose en rijpen vervolgens tot lysosomen. Verschillende intracellulaire signaalroutes zijn betrokken bij de vorming van IV's; bovendien kunnen verschillende intrinsieke en extrinsieke stimuli IV's beschadigen (pathogenen kunnen bijvoorbeeld tijdens infectie uit het begrensde membraan ontsnappen en cytoplasma1 binnendringen). Dit gaat meestal gepaard met het scheuren van endocytotische blaasjes2. Daarom kunnen de technieken voor het richten en beschadigen van IV's worden gebruikt in gerelateerde studies3.
Fotodynamische therapie (PDT) is een lichtafhankelijke therapie om ziekten te bestrijden door tumoren of ziekteverwekkers te doden4. In PDT worden gerichte cellen gelabeld met niet-toxische chromoforen, fotosensitizers genaamd, die lokaal kunnen worden geactiveerd door lichtverlichting 5,6. Fotosensitizers absorberen energie van licht en transformeren in een aangeslagen singlettoestand, wat leidt tot de langlevende aangeslagen triplettoestand. Fotosensitizers van de triplettoestand kunnen elektronen- of energieoverdracht ondergaan en reactieve zuurstofsoorten (ROS) vormen in aanwezigheid van zuurstof, en kunnen gelabelde cellen binnen het verlichtingsgebiedruimtelijk vernietigen 7. Het gevolg varieert afhankelijk van de kracht van licht8. Door de concentratie van fotosensitizers en de intensiteit van lichtverlichting te regelen, kunnen gerichte biomoleculen selectief worden geïnactiveerd zonder cellyse, aangeduid als chromofoorondersteunde lichtinactivatie (CALI)9. Met de aanzienlijke ontwikkeling van fotosensitizers die selectief verschillende subcellulaire doelen kunnen labelen, is CALI een waardevol hulpmiddel geworden om lichtgemedieerde inactivatie van biomoleculen voor kleine biomoleculen zoals nucleotiden en eiwitten, evenals organellen zoals mitochondriën en endo-lysosomen 3,10,11,12,13 te beheersen.
In vergelijking met CALI worden chemische of fysische methoden ook gebruikt om membranen aan te tasten, zoals bacteriële toxine 14,15 en Leu-Leu-OMe16-behandeling voor lysosomale schade. Deze methoden vertonen echter bulkbeschadiging van IV's in cellen. Robuuste fotosensitizers (d.w.z. Al(III) ftalocyaninechloridedisulfonzuur (AlPcS2a)) worden gebruikt in CALI; AlPcS2a, gericht op de lysosomen door middel van endocytose, wordt gebruikt om endosomen of lysosomen te scheuren in een gecontroleerd gebied17. AlPcS2a is een celmembraan-ondoordringbare ftalocyanine-gebaseerde chromofoor die bindt aan lipide op plasmamembraan en wordt geïnternaliseerd door endocytose en uiteindelijk accumuleert in het lysosoom via de endocytische route18. Het absorbeert licht in een nabij-infrarood spectraal gebied en genereert singlet zuurstof, een belangrijke ROS gegenereerd door geëxciteerde AlPcS2a18. Singlet zuurstof die snel vervalt, beperkt de diffusie- en reactieafstand binnen een klein gebied in cellen (ongeveer 10-20 nm)19. Door de duur van AlPcS2a-incubatie en lichtverlichting aan te passen, is spatiotemporele controle van de schade aan IV's binnen een subcellulair gebied mogelijk. CALI wordt daarom een krachtig instrument voor het onderzoeken van de gevolgen van IV-schade en de vorming en regulering van IV's.
In deze studie wordt een specifiek protocol van CALI met AlPcS2a als fotosensitizer behandeld. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende soorten IV's, waaronder endosomen en lysosomen, en worden gebruikt om de follow-upreacties na membraanruptuur te onderzoeken. HeLa-cellen die fluorofoor-geconjugeerd galectine-316,20 tot expressie brengen, onthuld na lysosoomruptuur, worden gebruikt om dit protocol aan te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. AlPcS2a voorraadvoorbereiding
- Los 10 mg AlPcS2a op in 400 μL van 0,1 M NaOH. Om de oplosbaarheid te verbeteren, verwarmt u de oplossing bij 50 °C en vortex.
- Meng de oplossing met 4 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Filter vervolgens de oplossing met een filter van 0,22 μm om de onoplosbare neerslag te verwijderen.
- Meet de concentratie van de oplossing met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. De extinctiecoëfficiënt van AlPcS2a bij 672 nm is 4 x 104 cm-1 M-1. Verdun de AlPcS2a-oplossing met PBS om een oplossing van 1 mM te maken. Maak 1 ml aliquots en bewaar bij -20 °C.
2. Transfectie
OPMERKING: Gal3-GFP wordt toegepast als een indicator voor live-cell beeldvorming van lysosomale ruptuur.
- Behoud HeLa-celkweek in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Na het wassen van de cellen met PBS, trypsiniseren van de cellen, vervolgens resuspenderen de cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS.
OPMERKING: De methode is van toepassing op de meeste aangesloten cellijnen, waaronder HeLa- en A549-cellijnen. In principe zouden CALI-testen, ondanks het niet testen van suspensiecellen, met hen kunnen worden uitgevoerd. - Verdun 300 ng Gal3-GFP-plasmide in 25 μl gereduceerd serummedium en voeg vervolgens 0,6 μl P3000-reagens toe. Meng voorzichtig. Verdun 0,45 μl Lipofectamine 3000-reagens in 25 μl gereduceerd serummedium. Meng voorzichtig.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Meng verdund DNA en verdund Lipofectamine 3000 en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Meng het DNA-Lipofectamine mengsel, 3 x 105 gesuspendeerde HeLa-cellen en 200 μL DMEM + 10% FBS, en zaai de cellen vervolgens op het centrale glazen gebied van een glazen knopschaal van 35 mm.
3. AlPcS2a kleuring
- Om celaanhechting mogelijk te maken, incubeer de cellen bij 37 °C in de incubator die gedurende ten minste 4 uur wordt voorzien van 5% CO2.
- Verdun AlPcS 2a in DMEM aangevuld met 10% FBS om een 1 μM AlPcS2a oplossing te maken. Verwarm het AlPcS2a-bevattende medium voor in een waterbad van 37 °C. Vervang het kweekmedium door het AlPcS2a-bevattende medium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C in de incubator die 's nachts (16-18 uur) wordt voorzien van 5% CO2 .
- Was de cellen de volgende dag tweemaal met PBS om extracellulaire AlPcS2a te verwijderen. Vervang het medium door vers medium en incubeer vervolgens gedurende 4 uur bij 37 °C om resterende kleurstof langs de endocytische route te laten accumuleren in lysosomen.
OPMERKING: Om endosomen te kleuren, incubeert u cellen in 1 μM AlPcS2a in DMEM met 10% FBS gedurende 15 minuten bij 37 °C. Was vervolgens cellen twee keer met PBS en incuber ze in voorverwarmd medium voordat u beeldvorming uitvoert.
Figuur 1. Een schematische figuur die de selectieve IV-schade met AlPcS2a weergeeft. De figuur toont de schema's van selectieve IV-schade. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Lysosomale kleuring met AlPcS2a. Lysosomen die 's nachts zijn gelabeld met 1 μM AlPcS2a in HeLa-cellen zijn positief gekleurd met 50 nM groene fluorescerende kleurstof. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Voorbeeldbeeldvorming en lichtverlichting
OPMERKING: IV-schade binnen een subcellulair gebied van een enkele cel of alle AlPcS2a-gelabelde cellen in een kweekschaal kan worden uitgevoerd. Bulkverlichting van de hele kweekschaal maakt kwantitatieve studie van deze schade mogelijk, inclusief biochemische studies.
- Manipuleer afzonderlijke cellen door lysosomen in een enkele cel te beschadigen, zoals hieronder beschreven.
- Plaats de kweekschaal op het podium van een confocale microscoop. Gebruik de 488 nm en 561 nm lasers voor spannende GFP en AlPcS2a, respectievelijk.
- Omcirkel een 5 x 5 μm2 interessegebied (ROI) op de AlPcS 2a-gelabelde blaasjes die zijn geselecteerd om te worden beschadigd.
- Pulse verlicht de ROI met een 633 nm laser van 0,21 mW voor 70 herhalingen. Controleer de vorming van Gal3 puncta als een indicator van lysosomale membraanpermeabilisatie.
- Beschadig alle gelabelde cellen in een kweekschaal zoals hieronder beschreven.
- Plaats de cultuurschaal op een platform. Verlicht de schotel met 660 nm gecollimeerd LED-licht (nabij-infrarood licht is de ideale basis op het excitatiespectrum van AlPcS2a).
- Plaats de kweekschaal op de microscoop en controleer de indicatoren van membraanpermeabilisatie zoals vermeld in stap 4.1.3.
- Beoordeel letsel van IV's met behulp van de volgende indicatoren.
- De inhoud van endosoom of lysosoom is het meest geglycosyleerd, die worden blootgesteld aan cytosol bij IV-breuk. Label deze snel met behulp van cytosolische glycaanbindende galectines, waaronder galectine-1, galectine-3, galectine-8 en galectine-9 16,20.
- De grootte van de wond kan worden bepaald door het vrijkomen van membraan-ondoordringbare kleurstof zoals beschreven in21.
- Het verschil tussen endosomen en lysosomen is hun luminale pH-waarde. Lysosomale breuk verstoort de luminale pH, die kan worden gemeten met behulp van pH-gevoelige kleurstof, zoals FITC-dextran3.
Figuur 3. AlPcS2a-gemedieerde CALI induceert lokale rekrutering van TagRFP-galectine-3 (Gal3) naar de lysosomen binnen het verlichtingsgebied. Lysosomen in TagRFP-galectine-3-tot expressie gebrachte HeLa-cellen werden 's nachts gekleurd met 1 μM AlPcS2a, gevolgd door focusverlichting met nabij-infrarood licht (633 nm) binnen het gele vierkant. AlPcS 2a signaal binnen het gele vierkant is gefotoblekeerd, vergezeld van de vorming van TagRFP-galectine-3puncta . Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische figuur die de door AlPcS2a geïnduceerde schade van IV weergeeft, inclusief endosoom en lysosoom, is getoond (figuur 1).
In de handel verkrijgbare markers kunnen worden gebruikt om de AlPcS 2a-kleuringscondities te bepalen. Bijvoorbeeld AlPcS 2apuncta en groene fluorescerende kleurstof22 colocalisatie (figuur 2).
Fluorofoor-gelabeld galectine-3 kan worden toegepast als indicator voor het monitoren van IV-schade (figuur 3). Bovendien kon de locatie van Gal3 puncta ook worden gevolgd voor het testen van de stroomafwaartse signaleringsroute, inclusief lysosoomherstel en lysofagie 3,23. De snelle accumulatie van Gal3 van cytosol naar beschadigd IV zou de intensiteit van Gal3 aanzienlijk verhogen, waardoor de intensiteit van de Gal3-puncta verzadigd zou raken als het contrast van de beelden wordt aangepast om cytosolisch Gal3 te tonen. In feite toonden de afbeeldingen ook een lichte afname van cytosolisch Gal3.
Samenvattend geven deze resultaten aan dat op AlPcS2a gebaseerde CALI in staat is om lokale lysosomale breuk binnen de ROI te beheersen, waardoor de rest van de lysosomen intact blijft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AlPcS2a bindt zich aan het plasmamembraan, wordt vervolgens geïnternaliseerd door endocytose en hoopt zich uiteindelijk op in lysosomen. AlPcS2a kan dus worden gelokaliseerd in de subcellulaire compartimenten door de incubatietijd aan te passen. Een beperking van deze methodologie is dat alleen een subpopulatie van IV's kan worden gelabeld door AlPcS2a door endocytose omdat er veel andere membraanbronnen van IV's zijn, zoals ER- en Golgi-apparaten. Bovendien zou de selectieve etikettering van AlPcS2a in vroege of late endosomen een uitdaging zijn, maar fluorescerende markers kunnen worden gebruikt om vroeg gevormde endosomen te onderscheiden van laat gevormde tijdens subcellulaire beeldvorming. CALI-geïnduceerde IV-schade kan worden geïnduceerd met een verscheidenheid aan kleurstoffen 3,24.
De intensiteit van de schade kan worden geregeld door het vermogen en de verlichtingsduur van het licht. Een hogere intensiteit van de schade kan leiden tot celkrimp of necrose. Hier zijn verschillende indicatoren van IV-schade getoond, die kunnen worden gebruikt om de experimentele omstandigheden te bepalen. Bovendien kunnen deze indicatoren ook dienen als markers voor beschadigde IV's en informatie geven over hun subcellulaire distributie in de loop van de tijd.
Klinisch gezien is AlPcS2a ontworpen om de toediening van therapeutische middelen op een locatie- en tijdspecifieke manier te verbeteren door middel van fotochemische internalisatie (PCI)25. Onvermijdelijke bijwerkingen, zoals celapoptose of differentiatie, kunnen echter ook gepaard gaan met de PCI-behandeling26. Aangezien dergelijke effecten het gevolg kunnen zijn van inductie van lysosomale schade, vormen de verstrekte testen een potentieel hulpmiddel voor preklinisch gebruik.
In deze studie beschrijven de AlPcS2a-gemedieerde CALI-protocollen de selectieve controle van de schadegrootte (lokaal en onderdeel van endosomen of lysosomen). Wetenschappers kunnen hun subcellulaire gedrag volgen, terwijl de rest van de IV's intact blijven en als een controle kunnen worden behandeld. Deze methodologie is toegepast in verschillende studies. Beschadigde lysosomen worden bijvoorbeeld sequentieel gelabeld met ubiquitine en microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3) en ondergaan autofagische klaring3. Bovendien worden galectine-3 en galectine-8 labeling op beschadigde endosomen gecontroleerd door celoppervlak glycaan27. Aangezien AlPcS2a in vivo is gebruikt voor PCI, kan AlPcS2a-gemedieerde CALI ook in vivo worden gebruikt. Dit protocol biedt een robuust hulpmiddel om celbiologie te bestuderen met behulp van AlPcS2a-gemedieerde CALI. Deze studies ondersteunen dat de AlPcS2a-gemedieerde CALI een robuust hulpmiddel is voor celbiologische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs willen de Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS bedanken voor onderzoeksondersteuning. De kernfaciliteit wordt gefinancierd door de Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). De auteurs bedanken de Common Equipment Core Facility van het Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) voor het assisteren bij de beeldacquisitie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
- Cossart, P., Helenius, A.
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C.
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y.
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y.
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
