Summary
AlPcS2a-medieret kromoforassisteret laserinaktivering (CALI) er et kraftfuldt værktøj til at studere spatiotemporal skade på intracellulære vesikler (IV'er) i levende celler.
Abstract
Intracellulære vesikler (IV'er) dannes gennem endocytose af vesikler i cytoplasma. IV-dannelse er involveret i aktivering af forskellige signalveje gennem permeabilisering af IV-membraner og dannelse af endosomer og lysosomer. En metode ved navn kromoforassisteret laserinaktivering (CALI) anvendes til at studere dannelsen af IV'er og materialerne til styring af IV-regulering. CALI er en billeddannelsesbaseret fotodynamisk metode til at studere signalvejen induceret af membranpermeabilisering. Metoden tillader spatiotemporal manipulation af den valgte organel at blive permeabiliseret i en celle. CALI-metoden er blevet anvendt til at observere og overvåge specifikke molekyler gennem permeabilisering af endosomer og lysosomer. Membranbruddet af IV'er er kendt for selektivt at rekruttere glycanbindende proteiner, såsom galectin-3. Her beskriver protokollen induktionen af IV-brud af AlPcS2a og brugen af galectin-3 som markør til mærkning af svækkede lysosomer, hvilket er nyttigt til at studere nedstrømsvirkningerne af IV-membranbrud og deres nedstrømsvirkninger under forskellige situationer.
Introduction
Endosomer, en type intracellulær vesikel (IV), dannes ved endocytose og modnes derefter til lysosomer. Forskellige intracellulære signalveje er involveret i dannelsen af IV'er; Derudover kan forskellige indre og ydre stimuli beskadige IV'er (f.eks. Patogener kan undslippe fra den afgrænsede membran under infektion og komme ind i cytoplasma1). Dette ledsages normalt af brud på endocytotiske vesikler2. Derfor kan teknikkerne til målretning og beskadigelse af IV'er anvendes i relaterede undersøgelser3.
Fotodynamisk terapi (PDT) er en lysafhængig terapi til bekæmpelse af sygdomme ved at dræbe tumorer eller patogener4. I PDT er målrettede celler mærket med ikke-toksiske kromoforer, kaldet fotosensibilisatorer, der kan aktiveres lokalt ved lysbelysning 5,6. Fotosensibilisatorer absorberer energi fra lys og omdannes til en ophidset singlettilstand, hvilket fører til den langlivede ophidsede triplettilstand. Fotosensibilisatorer i triplettilstanden kan gennemgå elektron- eller energioverførsel og danne reaktive iltarter (ROS) i nærvær af ilt og kan rumligt ødelægge mærkede celler inden for belysningsområdet7. Konsekvensen varierer afhængigt af lysets kraft8. Ved at kontrollere koncentrationen af fotosensibilisatorer og intensiteten af lysbelysning kan målrettede biomolekyler selektivt inaktiveres uden cellelyse, betegnet som kromoforassisteret lysinaktivering (CALI)9. Med den betydelige udvikling af fotosensibilisatorer, der selektivt kan mærke forskellige subcellulære mål, er CALI blevet et værdifuldt værktøj til at kontrollere lysmedieret inaktivering af biomolekyler til små biomolekyler såsom nukleotider og proteiner samt organeller såsom mitokondrier og endolysosomer 3,10,11,12,13.
Sammenlignet med CALI anvendes kemiske eller fysiske metoder også til at forringe membraner, såsom bakterietoksin 14,15 og Leu-Leu-OMe 16-behandling for lysosomal skade. Imidlertid viser disse metoder bulkforringelse af IV'er i celler. Robuste fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)phthalocyaniddisulfonsyre (AlPcS2a)) anvendes i CALI; AlPcS2a, der målretter lysosomerne gennem endocytose, bruges til at sprænge endosomer eller lysosomer i et kontrolleret område17. AlPcS2a er en cellemembran-uigennemtrængelig phthalocyaninbaseret kromofor, der binder til lipid på plasmamembranen og internaliseres gennem endocytose og til sidst akkumuleres i lysosomet gennem den endocytiske vej18. Det absorberer lys i et nær-infrarødt spektralområde og genererer singlet oxygen, en vigtig ROS genereret af exciteret AlPcS2a18. Singlet oxygen, der henfalder hurtigt, begrænser dets diffusions- og reaktionsafstand inden for et lille område i celler (ca. 10-20 nm)19. Ved at justere varigheden af AlPcS2a-inkubation og lysbelysning er rumlig tidsmæssig kontrol af beskadigelsen af IV'er inden for et subcellulært område tilladt. CALI bliver derfor et kraftfuldt værktøj til at undersøge konsekvenserne af IV-skader og dannelsen og reguleringen af IV'er.
I denne undersøgelse behandles en specifik protokol for CALI, der bruger AlPcS2a som fotosensibilisator. Denne protokol kan anvendes på forskellige typer IV'er, herunder endosomer og lysosomer, og bruges til at undersøge opfølgningsresponserne efter membranbrud. HeLa-celler, der udtrykker fluorofor-konjugeret galectin-316,20 afsløret efter lysosombrud, bruges til at demonstrere denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af AlPcS2a-lager
- 10 mg AlPcS2a opløses i 400 μL 0,1 M NaOH. For at forbedre opløseligheden opvarmes opløsningen til 50 °C og hvirvelstrøm.
- Bland opløsningen med 4 ml fosfatbufret saltvand (PBS). Derefter filtreres opløsningen med et 0,22 μm filter for at fjerne de uopløselige bundfald.
- Opløsningens koncentration måles gennem et UV-Vis-spektrofotometer. Udryddelseskoefficienten for AlPcS2a ved 672 nm er 4 x 104 cm-1 M-1. Fortynd AlPcS2a-opløsningen med PBS for at lave en 1 mM-opløsning. Der fremstilles 1 ml alikvoter og opbevares ved -20 °C.
2. Transfektion
BEMÆRK: Gal3-GFP anvendes som indikator for levende cellebilleddannelse af lysosomal ruptur.
- Oprethold HeLa-cellekultur i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Efter vask af cellerne med PBS trypsiniseres cellerne, og cellerne resuspenderes derefter i DMEM suppleret med 10% FBS.
BEMÆRK: Metoden kan anvendes til de fleste af de vedhæftede cellelinjer, herunder HeLa- og A549-cellelinjer. I princippet, på trods af ikke at teste suspensionsceller, kunne CALI-assays udføres med dem. - 300 ng Gal3-GFP-plasmid fortyndes i 25 μL reduceret serummedium, og der tilsættes derefter 0,6 μL P3000-reagens. Bland forsigtigt. Fortynd 0,45 μL lipofectamin 3000 reagens i 25 μL reduceret serummedium. Bland forsigtigt.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Bland fortyndet DNA og fortyndet lipofectamin 3000, og inkuber derefter i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Bland DNA-lipofektaminblandingen, 3 x 105 suspenderede HeLa-celler og 200 μL DMEM + 10% FBS, og frø derefter cellerne på det centrale glasområde i en 35 mm glasknapskål.
3. AlPcS2a-farvning
- For at muliggøre cellebinding inkuberes cellerne ved 37 °C i inkubatoren, der forsynes med 5% CO2 i mindst 4 timer.
- Fortynd AlPcS 2a i DMEM suppleret med 10% FBS for at lave en 1 μM AlPcS2a-opløsning. Forvarm det AlPcS2a-holdige medium i et 37 °C vandbad. Udskift dyrkningsmediet med det AlPcS2a-holdige medium.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C i inkubatoren, der forsynes med 5% CO2 natten over (16-18 timer).
- Den følgende dag vaskes cellerne to gange med PBS for at fjerne ekstracellulær AlPcS2a. Substratet erstattes med frisk substrat, og inkuberes derefter ved 37 °C i 4 timer for at tillade, at restfarvestof langs den endocytotiske vej akkumuleres til lysosomer.
BEMÆRK: For at plette endosomer inkuberes celler i 1 μM AlPcS2a i DMEM indeholdende 10% FBS i 15 minutter ved 37 °C. Derefter vaskes celler to gange med PBS og inkuberes i forvarmet medium før billeddannelse .
Figur 1. En skematisk figur, der repræsenterer den selektive IV-skade med AlPcS2a. Figuren viser skemaerne over selektive IV-skader. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Lysosomal farvning med AlPcS2a. Lysosomer mærket natten over med 1 μM AlPcS2a i HeLa-celler farves positivt med 50 nM grønt fluorescerende farvestof. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Prøve billeddannelse og lysbelysning
BEMÆRK: IV-skade inden for et subcellulært område af en enkelt celle eller alle AlPcS2a-mærkede celler i en dyrkningsskål kan udføres. Bulkbelysning af hele kulturskålen muliggør kvantitativ undersøgelse af denne skade, herunder biokemiske undersøgelser.
- Manipuler enkeltceller ved at beskadige lysosomer i en enkelt celle, som beskrevet nedenfor.
- Placer kulturskålen på scenen i et konfokalmikroskop. Brug 488 nm og 561 nm lasere til spændende GFP og AlPcS2a, henholdsvis.
- Sæt en cirkel om et 5 x 5 μm2 interesseområde (ROI) på de AlPcS2a-mærkede vesikler, der er udvalgt til at være beskadiget.
- Puls belyser ROI med en 633 nm laser på 0,21 mW for 70 gentagelser. Overvåg dannelsen af Gal3 puncta som en indikator for lysosomal membranpermeabilisering.
- Beskadiger alle mærkede celler i en kulturskål som beskrevet nedenfor.
- Placer kulturskålen på en platform. Oplys skålen med 660 nm kollimeret LED-lys (nær-infrarødt lys er ideel base på excitationsspektret for AlPcS2a).
- Kulturskålen anbringes på mikroskopet, og indikatorerne for membranpermeabilisering overvåges som nævnt i trin 4.1.3.
- Vurder skade på IV'er ved hjælp af følgende indikatorer.
- Indholdet af endosom eller lysosomer er mest glykosyleret, som udsættes for cytosol ved IV-brud. Mærk hurtigt disse ved hjælp af cytosoliske glycanbindende galectiner, herunder galectin-1, galectin-3, galectin-8 og galectin-916,20.
- Sårets størrelse kan bestemmes ved frigivelse af membranuigennemtrængeligt farvestof som beskrevet i21.
- Forskellen mellem endosomer og lysosomer er deres luminale pH-værdi. Lysosomal ruptur forstyrrer den luminale pH, som kan måles ved anvendelse af pH-følsomt farvestof, såsom FITC-dextran3.
Figur 3. AlPcS2a-medieret CALI inducerer lokal rekruttering af TagRFP-galectin-3 (Gal3) til lysosomerne inden for belysningsområdet. Lysosomer i TagRFP-galectin-3-udtrykte HeLa-celler blev farvet natten over med 1 μM AlPcS2a, efterfulgt af fokusering af belysning med nær-infrarødt lys (633 nm) inden for den gule firkant. AlPcS2a-signalet i den gule firkant fotobleges, ledsaget af dannelsen af TagRFP-galectin-3 puncta. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk figur, der repræsenterer AlPcS2a-induceret skade på IV, herunder endosom og lysosom, er vist (figur 1).
Kommercielt tilgængelige markører kan bruges til at bestemme AlPcS2a-farvningsbetingelserne. For eksempel AlPcS 2a puncta og grønt fluorescerende farvestof22 colokalisering (figur 2).
Fluoroformærket galectin-3 kan anvendes som indikator for overvågning af IV-skader (figur 3). Desuden kunne placeringen af Gal3 puncta også spores til analyse af nedstrøms signalvejen, herunder lysosomreparation og lysofagi: 3,23. Den hurtige akkumulering af Gal3 fra cytosol til beskadiget IV ville øge intensiteten af Gal3 betydeligt, hvilket ville gøre intensiteten af Gal3 puncta mættet, hvis kontrasten af billederne justeres til at vise cytosolisk Gal3. Faktisk viste billederne også et lille fald i cytosolisk Gal3.
Sammenfattende indikerer disse resultater, at AlPcS2a-baseret CALI er i stand til at kontrollere lokal lysosomal ruptur inden for ROI, hvilket efterlader resten af lysosomerne intakte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AlPcS2a binder til plasmamembranen, internaliseres derefter ved endocytose og akkumuleres til sidst i lysosomer. AlPcS2a kan således lokaliseres i de subcellulære rum ved at justere inkubationsvarigheden. En begrænsning af denne metode er, at kun en underpopulation af IV'er kunne mærkes af AlPcS2a gennem endocytose, fordi der er mange andre membrankilder til IV'er, såsom ER- og Golgi-apparater. Derudover ville den selektive mærkning af AlPcS2a i tidlige eller sene endosomer være udfordrende, men fluorescerende markører kan bruges til at differentiere tidligt dannede endosomer fra sent dannede under subcellulær billeddannelse. CALI-induceret IV-skade kan induceres med en række farvestoffer 3,24.
Skadeintensiteten kan styres af lysets effekt og belysningsvarighed. Højere intensitet af skade kan resultere i cellekrympning eller nekrose. Her er der vist flere indikatorer for IV-skader, som kunne bruges til at bestemme forsøgsbetingelserne. Derudover kan disse indikatorer også tjene som markører for beskadigede IV'er og give information om deres subcellulære fordeling over tid.
Klinisk er AlPcS2a designet til at forbedre leveringen af terapeutiske midler på en sted- og tidsspecifik måde gennem fotokemisk internalisering (PCI)25. Imidlertid kan uundgåelige bivirkninger, såsom celleapoptose eller differentiering, også ledsage PCI-behandlingen26. Da sådanne virkninger kan være konsekvensen af induktion af lysosomal skade, udgør de tilvejebragte assays et potentielt værktøj til præklinisk brug.
I denne undersøgelse beskriver AlPcS2a-medierede CALI-protokoller den selektive kontrol af skadestørrelsen (lokal og en del af endosomer eller lysosomer). Forskere kan overvåge deres subcellulære adfærd, mens resten af IV'erne forbliver intakte og kan behandles som en kontrol. Denne metode er blevet anvendt i flere undersøgelser. For eksempel mærkes beskadigede lysosomer sekventielt med ubiquitin og mikrotubulusassocieret proteinlyskæde 3 (LC3) og gennemgår autofagisk clearance3. Desuden styres galectin-3 og galectin-8 mærkning på beskadigede endosomer af celleoverfladeglycan27. Da AlPcS2a er blevet anvendt in vivo til PCI, kan AlPcS2a-medieret CALI også anvendes in vivo. Denne protokol giver et robust værktøj til at studere cellebiologi ved hjælp af AlPcS2a-medieret CALI. Disse undersøgelser understøtter, at AlPcS2a-medieret CALI er et robust værktøj til cellebiologiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS for forskningsstøtte. Hovedfaciliteten finansieres af Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Forfatterne takker Common Equipment Core Facility ved Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) for at hjælpe med billedoptagelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
- Cossart, P., Helenius, A.
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C.
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y.
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y.
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
