Summary
AlPcS2a-mediert kromoforassistert laserinaktivering (CALI) er et kraftig verktøy for å studere spatiotemporal skade av intracellulære vesikler (IV) i levende celler.
Abstract
Intracellulære vesikler (IV) dannes gjennom endocytose av vesikler til cytoplasma. IV-dannelse er involvert i aktivering av forskjellige signalveier gjennom permeabilisering av IV-membraner og dannelse av endosomer og lysosomer. En metode som kalles kromoforassistert laserinaktivering (CALI) brukes til å studere dannelsen av IV og materialene i å kontrollere IV-regulering. CALI er en bildebasert fotodynamisk metodikk for å studere signalveien indusert av membranpermeabilisering. Metoden tillater spatiotemporal manipulering av den valgte organellen som skal permeabiliseres i en celle. CALI-metoden har blitt brukt til å observere og overvåke spesifikke molekyler gjennom permeabilisering av endosomer og lysosomer. Membranbrudd av IVs er kjent for å selektivt rekruttere glykanbindende proteiner, slik som galektin-3. Her beskriver protokollen induksjon av IV-ruptur av AlPcS2a og bruk av galektin-3 som markør for å merke nedsatte lysosomer, noe som er nyttig for å studere nedstrømseffektene av IV-membranbrudd og deres nedstrømseffekter under ulike situasjoner.
Introduction
Endosomer, en type intracellulær vesikkel (IV), dannes ved endocytose og modnes deretter til lysosomer. Ulike intracellulære signalveier er involvert i dannelsen av IVer; I tillegg kan forskjellige indre og ytre stimuli skade IVs (f.eks. patogener kan unnslippe fra den begrensede membranen under infeksjon og gå inn i cytoplasma1). Dette er vanligvis ledsaget av brudd på endocytotiske vesikler2. Derfor kan teknikkene for å målrette og skade IVs brukes i relaterte studier3.
Fotodynamisk terapi (PDT) er en lysavhengig terapi for å bekjempe sykdommer ved å drepe svulster eller patogener4. I PDT er målrettede celler merket med ikke-giftige kromoforer, kalt fotosensibilisatorer, som kan aktiveres lokalt ved lysbelysning 5,6. Fotosensibilisatorer absorberer energi fra lys og forvandles til en opphisset singlettilstand, noe som fører til den langlivede eksiterte trillingtilstanden. Fotosensibilisatorer av tripletttilstanden kan gjennomgå elektron- eller energioverføring og danne reaktive oksygenarter (ROS) i nærvær av oksygen, og kan romlig ødelegge merkede celler i belysningsområdet7. Konsekvensen varierer avhengig av lysets kraft8. Ved å kontrollere konsentrasjonen av fotosensibilisatorer og intensiteten av lysbelysning, kan målrettede biomolekyler selektivt inaktiveres uten cellelyse, betegnet som kromoforassistert lysinaktivering (CALI)9. Med den betydelige utviklingen av fotosensibilisatorer som selektivt kan merke forskjellige subcellulære mål, har CALI blitt et verdifullt verktøy for å kontrollere lysmediert inaktivering av biomolekyler for små biomolekyler som nukleotider og proteiner, samt organeller som mitokondrier og endo-lysosomer 3,10,11,12,13.
Sammenlignet med CALI brukes kjemiske eller fysiske metoder også for å svekke membraner, for eksempel bakteriell toksin 14,15 og Leu-Leu-OMe 16-behandling for lysosomal skade. Imidlertid viser disse metodene bulk svekkelse av IVs i celler. Robuste fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)ftalocyaninkloriddisulfonsyre (AlPcS2a)) brukes i CALI; AlPcS2a, rettet mot lysosomene gjennom endocytose, brukes til å bryte endosomer eller lysosomer i et kontrollert område17. AlPcS2a er en cellemembran-ugjennomtrengelig ftalocyaninbasert kromofor som binder seg til lipid på plasmamembran og internaliseres gjennom endocytose og til slutt akkumuleres i lysosomet gjennom endocytisk vei18. Den absorberer lys i et nær-infrarødt spektralområde og genererer singlet oksygen, en stor ROS generert av eksitert AlPcS2a18. Singlet oksygenhenfall begrenser raskt diffusjons- og reaksjonsavstanden innenfor et lite område i celler (ca. 10-20 nm)19. Ved å justerevarigheten av AlPcS 2a-inkubasjon og lysbelysning, er spatiotemporal kontroll av skaden av IV innenfor et subcellulært område tillatt. CALI blir derfor et kraftig verktøy for å undersøke konsekvensene av IV-skade, og dannelse og regulering av IV.
I denne studien adresseres en spesifikk protokoll for CALI ved bruk av AlPcS2a som fotosensibilisator. Denne protokollen kan brukes på ulike typer IV, inkludert endosomer og lysosomer, og brukes til å undersøke oppfølgingsresponsene etter membranbrudd. HeLa-celler som uttrykker fluoroforkonjugert galektin-316,20 avslørt etter lysosomruptur, brukes til å demonstrere denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. AlPcS2a lagerforberedelse
- Løs opp 10 mg AlPcS2a i 400 μL med 0,1 M NaOH. For å forbedre løseligheten, varm opp oppløsningen ved 50 °C og virvel.
- Bland oppløsningen med 4 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Filtrer deretter løsningen med et 0,22 μm filter for å fjerne de uoppløselige utfellingene.
- Mål konsentrasjonen av oppløsningen gjennom et UV-Vis-spektrofotometer. Ekstinksjonskoeffisienten til AlPcS2a ved 672 nm er 4 x 104 cm-1 M-1. Fortynn AlPcS2a-løsningen med PBS for å lage en 1 mM løsning. Lag 1 ml alikoter og oppbevar ved -20 °C.
2. Transfeksjon
MERK: Gal3-GFP brukes som en indikator for levende celleavbildning av lysosomal ruptur.
- Opprettholde HeLa-cellekultur i DMEM supplert med 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Etter å ha vasket cellene med PBS, trypsiniser cellene, og resuspender deretter cellene i DMEM supplert med 10% FBS.
MERK: Metoden er anvendelig for de fleste av de tilknyttede cellelinjene, inkludert HeLa og A549 cellelinjer. Til tross for at suspensjonsceller ikke ble testet, kunne CALI-analyser i prinsippet utføres med dem. - Fortynn 300 ng Gal3-GFP-plasmid i 25 μL redusert serummedium, og tilsett deretter 0,6 μL P3000-reagens. Bland forsiktig. Fortynn 0,45 μl lipofektamin 3000-reagens i 25 mikrol redusert serummedium. Bland forsiktig.
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur. Bland fortynnet DNA og fortynnet lipofektamin 3000, og inkuber deretter i 10 minutter ved romtemperatur.
- Bland DNA-lipofektaminblandingen, 3 x 105 suspenderte HeLa-celler og 200 μL DMEM + 10% FBS, og frø deretter cellene på det sentrale glassområdet i en 35 mm glassfatfat.
3. AlPcS2a-farging
- For å tillate cellefeste, inkuber cellene ved 37 ° C i inkubatoren som leveres med 5% CO2 i minst 4 timer.
- Fortynn AlPcS 2a i DMEM supplert med 10% FBS for å lage en 1 μM AlPcS2a-løsning. Forvarm det AlPcS2a-holdige mediet i et vannbad på 37 °C. Erstatt kulturmediet med det AlPcS2a-holdige mediet.
- Inkuber cellene ved 37 °C i inkubatoren som leveres med 5% CO2 over natten (16-18 timer).
- Neste dag, vask cellene to ganger med PBS for å fjerne ekstracellulær AlPcS2a. Erstatt mediet med friskt medium, og inkuber deretter ved 37 °C i 4 timer for å la gjenværende fargestoff langs endocytisk vei akkumuleres til lysosomer.
MERK: For å flekke endosomer, inkuber celler i 1 μM AlPcS2a i DMEM som inneholder 10% FBS i 15 minutter ved 37 ° C. Deretter vasker du celler to ganger med PBS og inkuberer dem i forvarmet medium før avbildning.
Figur 1. En skjematisk figur som representerer den selektive IV-skaden med AlPcS2a. Figuren viser skjemaene for selektiv IV-skade. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Lysosomal farging med AlPcS2a. Lysosomer merket over natten med 1 μM AlPcS2a i HeLa-celler er positivt farget med 50 nM grønt fluorescerende fargestoff. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Prøveavbildning og lysbelysning
MERK: IV-skade i et subcellulært område av en enkelt celle eller alle AlPcS2a-merkede celler i en kulturskål kan utføres. Bulkbelysning av hele kulturskålen tillater kvantitativ studie av denne skaden, inkludert biokjemiske studier.
- Manipulere enkeltceller ved å skade lysosomer i en enkelt celle, som beskrevet nedenfor.
- Legg kulturfatet på scenen i et konfokalmikroskop. Bruk 488 nm og 561 nm lasere for spennende GFP og AlPcS2a, henholdsvis.
- Sett ring rundt en 5 x 5 μm2 interesseregion (ROI) på de AlPcS2a-merkede vesiklene som er valgt for å bli skadet.
- Puls belyser avkastningen med en 633 nm laser på 0,21 mW for 70 repetisjoner. Overvåk dannelsen av Gal3 puncta som en indikator på lysosomal membranpermeabilisering.
- Skad alle merkede celler i en kulturskål som beskrevet nedenfor.
- Legg kulturfatet på en plattform. Lys opp parabolen med 660 nm kollimert LED-lys (nær-infrarødt lys er ideell base på eksitasjonsspekteret til AlPcS2a).
- Plasser dyrkningsskålen på mikroskopet og overvåk indikatorene for membranpermeabilisering som nevnt i trinn 4.1.3.
- Vurder skade på IVs ved hjelp av følgende indikatorer.
- Innholdet av endosomet eller lysosomet er mest glykosylert, som eksponeres for cytosol ved IV-brudd. Merk disse raskt ved hjelp av cytosoliske glykanbindende galektiner, inkludert galektin-1, galektin-3, galektin-8 og galektin-916,20.
- Størrelsen på såret kan bestemmes ved frigjøring av membran-ugjennomtrengelig fargestoff som beskrevet i21.
- Forskjellen mellom endosomer og lysosomer er deres luminale pH-verdi. Lysosomal ruptur forstyrrer luminal pH, som kan måles ved bruk av pH-sensitivt fargestoff, slik som FITC-dextran3.
Figur 3. AlPcS2a-mediert CALI induserer lokal rekruttering av TagRFP-galektin-3 (Gal3) til lysosomene i belysningsområdet. Lysosomer i TagRFP-galektin-3-uttrykte HeLa-celler ble farget over natten med 1 μM AlPcS2a, etterfulgt av fokuseringsbelysning med nær-infrarødt lys (633 nm) i den gule firkanten. AlPcS2a-signalet i den gule firkanten er fotobleket, ledsaget av dannelsen av TagRFP-galektin-3 puncta. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk figur som representerer AlPcS 2a-indusert skade av IV, inkludert endosom og lysosom, er vist (figur 1).
Kommersielt tilgjengelige markører kan brukes til å bestemme AlPcS2a-fargeforholdene . For eksempel AlPcS2a puncta og grønt fluorescerende fargestoff22 samlokalisering (figur 2).
Fluoroformerket galektin-3 kan brukes som indikator for overvåking av IV-skade (figur 3). Videre kan plasseringen av Gal3 puncta også spores for å analysere signalveien nedstrøms, inkludert lysosomreparasjon og lysophagy 3,23. Den raske akkumuleringen av Gal3 fra cytosol til skadet IV vil øke intensiteten til Gal3 betydelig, noe som vil gjøre intensiteten til Gal3-puncta mettet hvis kontrasten til bildene justeres for å vise cytosolisk Gal3. Faktisk viste bildene også en liten reduksjon i cytosolisk Gal3.
Oppsummert indikerer disse resultatene at AlPcS2a-basert CALI er i stand til å kontrollere lokal lysosomal ruptur innenfor avkastningen, slik at resten av lysosomene er intakte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AlPcS2a binder seg til plasmamembranen, blir deretter internalisert ved endocytose og akkumuleres til slutt i lysosomer. AlPcS2a kan dermed lokaliseres i de subcellulære rommene ved å justere inkubasjonsvarigheten. En begrensning av denne metoden er at bare en underpopulasjon av IV kan merkes av AlPcS2a gjennom endocytose fordi det er mange andre membrankilder til IV, som ER og Golgi-apparater. I tillegg vil den selektive merkingen av AlPcS2a i tidlige eller sene endosomer være utfordrende, men fluorescerende markører kan brukes til å skille tidlig dannede endosomer fra sent dannede under subcellulær avbildning. CALI-indusert IV-skade kan induseres med en rekke fargestoffer 3,24.
Intensiteten av skaden kan styres av lysets strøm og belysningsvarighet. Høyere intensitet av skade kan føre til cellekrymping eller nekrose. Her har flere indikatorer på IV-skade blitt vist, som kan brukes til å bestemme eksperimentelle forhold. I tillegg kan disse indikatorene også tjene som markører for skadede IVer og gi informasjon om deres subcellulære fordeling over tid.
Klinisk er AlPcS2a designet for å forbedre leveransen av terapeutiske midler på en steds- og tidsspesifikk måte gjennom fotokjemisk internalisering (PCI)25. Imidlertid kan uunngåelige bivirkninger, som celleapoptose eller differensiering, også følge PCI-behandlingen26. Siden slike effekter kan være konsekvensen av induksjon av lysosomal skade, presenterer de medfølgende analysene et potensielt verktøy for preklinisk bruk.
I denne studien beskriver AlPcS2a-medierte CALI-protokoller den selektive kontrollen av skadestørrelsen (lokal og del av endosomer eller lysosomer). Forskere kan overvåke deres subcellulære oppførsel, mens resten av IVene forblir intakte og kan behandles som en kontroll. Denne metodikken har blitt brukt i flere studier. For eksempel er skadede lysosomer merket sekvensielt med ubiquitin og mikrotubuli-assosiert proteinlyskjede 3 (LC3), og gjennomgår autofagisk clearance3. Videre styres galektin-3- og galektin-8-merking på skadede endosomer av celleoverflateglykanen27. Siden AlPcS2a har blitt brukt in vivo for PCI, kan AlPcS2a-mediert CALI også brukes in vivo. Denne protokollen gir et robust verktøy for å studere cellebiologi ved hjelp av AlPcS2a-mediert CALI. Disse studiene støtter at AlPcS2a-mediert CALI er et robust verktøy for cellebiologiske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS for forskningsstøtte. Kjernefasiliteten er finansiert av Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Forfatterne takker Common Equipment Core Facility ved Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) for å hjelpe bildeoppkjøpet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
- Cossart, P., Helenius, A.
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C.
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y.
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y.
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
