Summary
AlPcS2a-medierad kromoforassisterad laserinaktivering (CALI) är ett kraftfullt verktyg för att studera spatiotemporal skada av intracellulära vesiklar (IV) i levande celler.
Abstract
Intracellulära vesiklar (IV) bildas genom endocytos av vesiklar i cytoplasma. IV-bildning är involverad i aktivering av olika signalvägar genom permeabilisering av IV-membran och bildandet av endosomer och lysosomer. En metod som kallas kromoforassisterad laserinaktivering (CALI) används för att studera bildandet av intravenösa läkemedel och materialen vid styrning av intravenös reglering. CALI är en bildbaserad fotodynamisk metod för att studera signalvägen inducerad av membranpermeabilisering. Metoden tillåter spatiotemporal manipulation av den valda organellen att permeabiliseras i en cell. CALI-metoden har tillämpats för att observera och övervaka specifika molekyler genom permeabilisering av endosomer och lysosomer. Membranbrottet av IV är känt för att selektivt rekrytera glykanbindande proteiner, såsom galectin-3. Här beskriver protokollet induktionen av IV-ruptur av AlPcS2a och användningen av galectin-3 som en markör för att märka nedsatta lysosomer, vilket är användbart för att studera nedströmseffekterna av IV-membranbrott och deras nedströmseffekter under olika situationer.
Introduction
Endosomer, en typ av intracellulär vesikel (IV), bildas av endocytos och mognar sedan till lysosomer. Olika intracellulära signalvägar är involverade i bildandet av IV; Dessutom kan olika inneboende och yttre stimuli skada IV (t.ex. patogener kan fly från det avgränsade membranet under infektion och gå in i cytoplasma1). Detta åtföljs vanligtvis av bristning av endocytotiska vesiklar2. Därför kan teknikerna för inriktning och skada IV användas i relaterade studier3.
Fotodynamisk terapi (PDT) är en ljusberoende terapi för att bekämpa sjukdomar genom att döda tumörer eller patogener4. I PDT är riktade celler märkta med giftfria kromoforer, kallade fotosensibiliserare, som kan aktiveras lokalt med ljusbelysning 5,6. Fotosensibilisatorer absorberar energi från ljus och omvandlas till ett exciterat singletttillstånd, vilket leder till det långlivade exciterade tripletttillståndet. Fotosensibilisatorer i tripletttillståndet kan genomgå elektron- eller energiöverföring och bilda reaktiva syrearter (ROS) i närvaro av syre och kan rumsligt förstöra märkta celler inom belysningsområdet7. Konsekvensen varierar beroende på ljusets kraft8. Genom att kontrollera koncentrationen av fotosensibilisatorer och intensiteten hos ljusbelysning kan riktade biomolekyler selektivt inaktiveras utan celllys, benämnd kromoforassisterad ljusinaktivering (CALI)9. Med den betydande utvecklingen av fotosensibilisatorer som selektivt kan märka olika subcellulära mål har CALI blivit ett värdefullt verktyg för att kontrollera ljusmedierad inaktivering av biomolekyler för små biomolekyler såsom nukleotider och proteiner, liksom organeller såsom mitokondrier och endososomer 3,10,11,12,13.
Jämfört med Cali används kemiska eller fysiska metoder också för att försämra membran, såsom bakterietoxin 14,15 och Leu-Leu-OMe 16-behandling för lysosomal skada. Dessa metoder visar emellertid bulkförsämring av IV i celler. Robusta fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)ftalocyaninkloriddisulfonsyra (AlPcS2a)) används i CALI; AlPcS 2a, som riktar sig mot lysosomerna genom endocytos, används för attbrista endosomer eller lysosomer i en kontrollerad region17. AlPcS2a är en cellmembranogenomtränglig ftalocyaninbaserad kromofor som binder till lipid på plasmamembran och internaliseras genom endocytos och ackumuleras så småningom i lysosomen genom den endocytiska vägen18. Det absorberar ljus inom ett nära infrarött spektralområde och genererar singlettsyre, en viktig ROS som genereras av exciterad AlPcS2a18. Singlettsyresönderfall begränsar snabbt dess diffusions- och reaktionsavstånd inom ett litet område i celler (ungefär 10-20 nm)19. Genom att justeravaraktigheten av AlPcS 2a-inkubation och ljusbelysning tillåts spatiotemporal kontroll av skadorna på IV inom ett subcellulärt område. CALI blir därför ett kraftfullt verktyg för att undersöka konsekvenserna av IV-skador och bildandet och regleringen av IV.
I denna studie behandlas ett specifikt protokoll för CALI som använder AlPcS2a som fotosensibiliserare. Detta protokoll kan tillämpas på olika typer av IV, inklusive endosomer och lysosomer, och används för att undersöka uppföljningssvaren efter membranbrott. HeLa-celler som uttrycker fluoroforkonjugerat galectin-316,20 som avslöjats efter lysosombrott används för att demonstrera detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. AlPcS2a lagerberedning
- Lös 10 mg AlPcS2a i 400 μl 0,1 M NaOH. För att förbättra lösligheten, värm lösningen vid 50 °C och virvel.
- Blanda lösningen med 4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Filtrera sedan lösningen med ett 0,22 μm filter för att avlägsna de olösliga fällningarna.
- Mät lösningens koncentration genom en UV-Vis-spektrofotometer. Extinktionskoefficienten för AlPcS2a vid 672 nm är 4 x 104 cm-1 M-1. Späd AlPcS2a-lösningen med PBS för att göra en 1 mM lösning. Gör 1 ml alikvoter och förvara vid -20 °C.
2. Transfektion
Gal3-GFP används som en indikator för levande cellavbildning av lysosomal ruptur.
- Behåll HeLa-cellodling i DMEM kompletterat med 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Efter tvättning av cellerna med PBS, trypsinisera cellerna och återsuspendera sedan cellerna i DMEM kompletterat med 10% FBS.
OBS: Metoden är tillämplig för de flesta av de bifogade cellinjerna, inklusive HeLa- och A549-cellinjer. I princip, trots att suspensionsceller inte testades, kunde CALI-analyser utföras med dem. - Späd 300 ng Gal3-GFP-plasmid i 25 μl reducerat serummedium och tillsätt sedan 0,6 μL P3000-reagens. Blanda försiktigt. Späd 0,45 μl lipofektamin 3000-reagens i 25 μl reducerat serummedium. Blanda försiktigt.
- Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Blanda utspätt DNA och utspädd lipofektamin 3000 och inkubera sedan i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Blanda DNA-lipofektaminblandningen, 3 x 105 suspenderade HeLa-celler och 200 μL DMEM + 10% FBS, och frö sedan cellerna på det centrala glasområdet i en 35 mm glasknappskål.
3. AlPcS2a-färgning
- För att möjliggöra cellbindning, inkubera cellerna vid 37 °C i inkubatorn som levereras med 5% CO2 i minst 4 timmar.
- Späd AlPcS 2a i DMEM kompletterat med 10% FBS för att göra en 1 μM AlPcS2a-lösning. Förvärm det AlPcS2a-innehållande mediet i ett 37 °C vattenbad. Byt ut odlingsmediet mot det AlPcS2a-innehållande mediet.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i inkubatorn som levereras med 5% CO2 över natten (16-18 timmar).
- Följande dag, tvätta cellerna två gånger med PBS för att avlägsna extracellulär AlPcS2a. Byt ut mediet mot färskt medium och inkubera sedan vid 37 °C i 4 timmar så att kvarvarande färgämne längs den endocytiska vägen ackumuleras till lysosomer.
OBS: För att färga endosomer, inkubera celler i 1 μM AlPcS2a i DMEM innehållande 10% FBS i 15 minuter vid 37 °C. Tvätta sedan celler två gånger med PBS och inkubera dem i förvärmt medium före avbildning .
Figur 1. En schematisk figur som representerar den selektiva IV-skadan med AlPcS2a. Figuren visar schemat för selektiv IV-skada. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Lysosomal färgning med AlPcS2a. Lysosomer märkta över natten med 1 μM AlPcS2a i HeLa-celler färgas positivt med 50 nM grönt fluorescerande färgämne. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Provavbildning och ljusbelysning
OBS: IV-skador inom en subcellulär region av en enda cell eller alla AlPcS2a-märkta celler i en odlingsskål kan utföras. Bulkbelysning av hela odlingsskålen möjliggör kvantitativ studie av denna skada, inklusive biokemiska studier.
- Manipulera enskilda celler genom att skada lysosomer i en enda cell, som beskrivs nedan.
- Placera odlingsskålen på scenen i ett konfokalmikroskop. Använd 488 nm och 561 nm lasrar för spännande GFP respektive AlPcS2a.
- Ringa in ett 5 x 5 μm2 intresseområde (ROI) på de AlPcS2a-märkta vesiklarna som valts ut för att skadas.
- Puls belyser ROI med en 633 nm laser på 0,21 mW för 70 upprepningar. Övervaka bildandet av Gal3 puncta som en indikator på lysosomal membranpermeabilisering.
- Skada alla märkta celler i en odlingsskål enligt beskrivningen nedan.
- Lägg kulturskålen på en plattform. Belysa skålen med 660 nm kollimerat LED-ljus (nära infrarött ljus är idealisk bas på excitationsspektrumet för AlPcS2a).
- Placera odlingsskålen på mikroskopet och övervaka indikatorerna för membranpermeabilisering som nämns i steg 4.1.3.
- Bedöm skada på IV med hjälp av följande indikatorer.
- Innehållet i endosom eller lysosom är mest glykosylerat, vilket utsätts för cytosol vid IV-brott. Märk snabbt dessa med cytosoliska glykanbindande galektiner, inklusive galectin-1, galectin-3, galectin-8 och galectin-916,20.
- Sårets storlek kan bestämmas genom frisättning av membranogenomträngligt färgämne som beskrivs i21.
- Skillnaden mellan endosomer och lysosomer är deras luminala pH-värde. Lysosomal ruptur stör luminalt pH, vilket kan mätas med hjälp av pH-känsligt färgämne, såsom FITC-dextran3.
Figur 3. AlPcS2a-medierad CALI inducerar lokal rekrytering av TagRFP-galectin-3 (Gal3) till lysosomerna inom belysningsområdet. Lysosomer i TagRFP-galectin-3-uttryckta HeLa-celler färgades över natten med 1 μM AlPcS2a, följt av fokusering av belysning med nära infrarött ljus (633 nm) inom den gula fyrkanten. AlPcS2a-signalen inom den gula fyrkanten fotoblekas, åtföljd av bildandet av TagRFP-galectin-3 puncta. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk figur som representerar AlPcS2a-inducerad skada av IV, inklusive endosom och lysosom, har visats (figur 1).
Kommersiellt tillgängliga markörer kan användas för att bestämma färgningsförhållandena för AlPcS2a. Till exempel AlPcS2a puncta och grönt fluorescerande färgämne22 samlokalisering (figur 2).
Fluoroformärkt galectin-3 kan användas som en indikator för övervakning av IV-skador (figur 3). Dessutom kunde platsen för Gal3 puncta också spåras för att analysera signalvägen nedströms, inklusive lysosomreparation och lysofagi 3,23. Den snabba ackumuleringen av Gal3 från cytosol till skadad IV skulle signifikant öka intensiteten hos Gal3, vilket skulle göra intensiteten hos Gal3 puncta mättad om kontrasten hos bilderna justeras för att visa cytosolisk Gal3. Faktum är att bilderna också visade en liten minskning av cytosolisk Gal3.
Sammanfattningsvis indikerar dessa resultat att AlPcS 2a-baserad CALI kan kontrollera lokal lysosomal bristning inom ROI och lämna resten av lysosomernaintakta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AlPcS2a binder till plasmamembranet, internaliseras sedan av endocytos och ackumuleras så småningom i lysosomer. AlPcS2a kan således lokaliseras i de subcellulära facken genom att justera inkubationstiden. En begränsning av denna metod är att endast en subpopulation av IV kan märkas av AlPcS2a genom endocytos eftersom det finns många andra membrankällor för IV, såsom ER och Golgi-apparater. Dessutom skulle den selektiva märkningen av AlPcS 2a i tidiga ellersena endosomer vara utmanande, men fluorescerande markörer kan användas för att skilja tidigt bildade endosomer från senbildade under subcellulär avbildning. CALI-inducerad IV-skada kan induceras med en mängd olika färgämnen 3,24.
Skadornas intensitet kan styras av ljusets effekt och belysningstid. Högre intensitet av skador kan leda till cellkrympning eller nekros. Här har flera indikatorer på IV-skador visats, som kan användas för att bestämma experimentbetingelserna. Dessutom kan dessa indikatorer också fungera som markörer för skadade IV och ge information om deras subcellulära fördelning över tiden.
Kliniskt är AlPcS2a utformad för att förbättra leveransen av terapeutiska medel på ett plats- och tidsspecifikt sätt genom fotokemisk internalisering (PCI)25. Oundvikliga biverkningar, såsom cellapoptos eller differentiering, kan emellertid också åtfölja PCI-behandlingen26. Eftersom sådana effekter kan vara en följd av induktion av lysosomal skada, utgör de tillhandahållna analyserna ett potentiellt verktyg för preklinisk användning.
I denna studie beskriver AlPcS 2a-medierade CALI-protokoll denselektiva kontrollen av skadans storlek (lokal och del av endosomer eller lysosomer). Forskare kan övervaka deras subcellulära beteende, medan resten av IV: erna förblir intakta och kan behandlas som en kontroll. Denna metod har tillämpats i flera studier. Till exempel märks skadade lysosomer sekventiellt med ubiquitin och mikrotubuliassocierad proteinljuskedja 3 (LC3) och genomgår autofagisk clearance3. Vidare styrs galectin-3 och galectin-8-märkning på skadade endosomer av cellytan glykan27. Eftersom AlPcS 2a har använts in vivo för PCI, kan AlPcS2a-medierad CALI också användas in vivo. Detta protokoll ger ett robust verktyg för att studera cellbiologi med AlPcS2a-medierad CALI. Dessa studier stöder att AlPcS2a-medierad CALI är ett robust verktyg för cellbiologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS för forskningsstöd. Kärnfaciliteten finansieras av Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Författarna tackar Common Equipment Core Facility vid Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) för att hjälpa bildförvärvet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
- Cossart, P., Helenius, A.
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C.
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y.
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y.
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
