Summary
A inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) mediada por AlPcS2a é uma ferramenta poderosa para estudar danos espaço-temporais de vesículas intracelulares (IVs) em células vivas.
Abstract
As vesículas intracelulares (IVs) são formadas através da endocitose das vesículas no citoplasma. A formação IV está envolvida na ativação de várias vias de sinal através da permeabilização das membranas IV e da formação de endossomos e lisossomos. Um método denominado inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) é aplicado para estudar a formação de IVs e os materiais no controle da regulação de IV. CALI é uma metodologia fotodinâmica baseada em imagens para estudar a via de sinalização induzida pela permeabilização da membrana. O método permite a manipulação espaço-temporal da organela selecionada para ser permeabilizada em uma célula. O método CALI tem sido aplicado para observar e monitorar moléculas específicas através da permeabilização de endossomos e lisossomos. Sabe-se que a ruptura da membrana dos IVs recruta seletivamente proteínas ligadoras de glicanos, como a galectina-3. Aqui, o protocolo descreve a indução de ruptura IV por AlPcS2a e o uso de galectina-3 como marcador para marcar lisossomos comprometidos, o que é útil no estudo dos efeitos a jusante da ruptura da membrana IV e seus efeitos a jusante em várias situações.
Introduction
Os endossomos, um tipo de vesícula intracelular (IV), são formados pela endocitose e depois amadurecem em lisossomos. Várias vias de sinal intracelular estão envolvidas na formação de IVs; além disso, diferentes estímulos intrínsecos e extrínsecos podem danificar IVs (por exemplo, patógenos podem escapar da membrana limitada durante a infecção e entrar no citoplasma1). Geralmente é acompanhada de ruptura de vesículas endocitóticas2. Portanto, as técnicas de direcionamento e lesão de IVs podem ser utilizadas em estudosrelacionados3.
A terapia fotodinâmica (TFD) é uma terapia fotodependente para combater doenças matando tumores ou patógenos4. Na TFD, as células-alvo são marcadas com cromóforos atóxicos, denominados fotossensibilizadores, que podem ser ativados localmente pela iluminação luminosa 5,6. Os fotossensibilizadores absorvem a energia da luz e se transformam em um estado singlete excitado, levando ao estado trigêmeo excitado de longa duração. Os fotossensibilizadores do estado triplete podem sofrer transferência eletrônica ou de energia e formar espécies reativas de oxigênio (EROs) na presença de oxigênio, podendo destruir espacialmente células marcadas dentro da região de iluminação7. A consequência varia de acordo com a potência da luz8. Controlando a concentração de fotossensibilizadores e a intensidade da iluminação luminosa, biomoléculas alvo podem ser seletivamente inativadas sem lise celular, denominada inativação luminosa assistida por cromóforos (CALI)9. Com o significativo desenvolvimento de fotossensibilizadores que podem marcar seletivamente vários alvos subcelulares, o CALI tornou-se uma ferramenta valiosa para controlar a inativação mediada pela luz de biomoléculas para pequenas biomoléculas, como nucleotídeos e proteínas, bem como organelas, como mitocôndrias e endolisossomos3,10,11,12,13.
Comparado ao CALI, métodos químicos ou físicos também são utilizados para prejudicar as membranas, como a toxina bacteriana 14,15 e o tratamento com Leu-Leu-OMe16 para danos lisossômicos. No entanto, esses métodos mostram comprometimento em massa de IVs dentro das células. Fotossensibilizadores robustos (i.e., ácido dissulfônico de cloreto de ftalocianina Al(III) (AlPcS2a)) são usados em CALI; O AlPcS2a, que tem como alvo os lisossomos através da endocitose, é usado para romper endossomos ou lisossomos em uma região controlada17. AlPcS2a é um cromóforo à base de ftalocianina impermeável à membrana celular que se liga a lipídios na membrana plasmática e é internalizado através de endocitose e eventualmente se acumula dentro do lisossomo através da via endocítica18. Ele absorve luz dentro de uma região espectral no infravermelho próximo e gera oxigênio singlete, uma das principais ROS geradas pelo AlPcS2a18 excitado. O decaimento do oxigênio singlete limita rapidamente sua difusão e distância de reação dentro de uma minúscula região das células (aproximadamente 10-20 nm)19. Ao ajustar a duração da incubação do AlPcS2a e a iluminação da luz, é permitido o controle espaço-temporal do dano de IVs dentro de uma área subcelular. O CALI torna-se, portanto, uma ferramenta poderosa para examinar as consequências dos danos IV, e a formação e regulação dos IVs.
Neste estudo, um protocolo específico de CALI usando AlPcS2a como fotossensibilizador é abordado. Este protocolo pode ser aplicado a vários tipos de IVs, incluindo endossomos e lisossomos, e usado para examinar as respostas de seguimento após a ruptura da membrana. Células HeLa expressando galectina-3 conjugada com fluoróforo16,20 reveladas após ruptura do lisossomo são utilizadas para demonstrar este protocolo.
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Protocol
1. Preparação de estoque AlPcS2a
- Dissolver 10 mg de AlPcS2a em 400 μL de NaOH 0,1 M. Para melhorar a solubilidade, aqueça a solução a 50 °C e vórtice.
- Misturar a solução com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, filtrar a solução com um filtro de 0,22 μm para remover os precipitados insolúveis.
- Medir a concentração da solução através de um espectrofotômetro UV-Vis. O coeficiente de extinção de AlPcS2a a 672 nm é de 4 x 104 cm-1 M-1. Diluir a solução de AlPcS2a com PBS para fazer uma solução de 1 mM. Fazer alíquotas de 1 ml e conservar a -20 °C.
2. Transfecção
NOTA: Gal3-GFP é aplicado como um indicador para imagens de células vivas de ruptura lisossômica.
- Manter cultura de células HeLa em DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Depois de lavar as células com PBS, tripsinize as células e, em seguida, ressuspenda as células em DMEM suplementado com FBS a 10%.
Observação : O método é aplicável para a maioria das linhas de célula anexadas, incluindo linhas de célula HeLa e A549. Em princípio, apesar de não testar células de suspensão, ensaios de CALI poderiam ser realizados com elas. - Diluir 300 ng do plasmídeo Gal3-GFP em 25 μL de meio sérico reduzido e, em seguida, adicionar 0,6 μL do reagente P3000. Misture delicadamente. Diluir 0,45 μL do reagente Lipofectamina 3000 em 25 μL de meio sérico reduzido. Misture delicadamente.
- Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente. Misturar o ADN diluído e a Lipofectamina 3000 diluída e, em seguida, incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Misture a mistura DNA-Lipofectamina, 3 x 105 células HeLa suspensas e 200 μL de DMEM+10% FBS e, em seguida, semeie as células na região central de vidro de uma placa de botão de vidro de 35 mm.
3. Coloração de AlPcS2a
- Para permitir a fixação celular, incubar as células a 37 °C na incubadora fornecida com 5% de CO2 durante pelo menos 4 horas.
- Diluir AlPcS 2a em DMEM suplementado com 10% FBS para fazer uma solução de AlPcS2a de 1 μM. Pré-aqueça o meio contendo AlPcS2a em banho-maria a 37 °C. Substitua o meio de cultura pelo meio contendo AlPcS2a.
- Incubar as células a 37 °C na incubadora abastecida com 5% de CO2 durante a noite (16-18 h).
- No dia seguinte, lave as células duas vezes com PBS para remover AlPcS2a extracelular. Substitua o meio por meio fresco e, em seguida, incube a 37 °C durante 4 h para permitir que o corante residual ao longo da via endocítica se acumule nos lisossomas.
NOTA: Para corar endossomos, incubar as células em 1 μM de AlPcS2a em DMEM contendo 10% de SFB por 15 min a 37 °C. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS e incube-as em meio pré-aquecido antes da obtenção de imagens.
Gráfico 1. Figura esquemática representando o dano IV seletivo com AlPcS2a. A figura mostra os esquemas de dano IV seletivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Coloração lisossômica com AlPcS2a. Lisossomos marcados durante a noite com 1 μM de AlPcS2a em células HeLa são positivamente corados com corante fluorescente verde 50 nM. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Imagem da amostra e iluminação da luz
NOTA: Danos IV dentro de uma região subcelular de uma única célula ou todas as células marcadas com AlPcS2a em uma placa de cultura podem ser realizados. A iluminação em massa de toda a placa de cultura permite o estudo quantitativo deste dano, incluindo estudos bioquímicos.
- Manipular células únicas, danificando lisossomos dentro de uma única célula, conforme descrito abaixo.
- Coloque a placa de cultura no palco de um microscópio confocal. Use os lasers de 488 nm e 561 nm para excitar GFP e AlPcS2a, respectivamente.
- Circule uma região de interesse (ROI) de 5 x 5 μm2 nas vesículas marcadas com AlPcS2a selecionadas para serem danificadas.
- Pulso iluminar a ROI com um laser de 633 nm de 0,21 mW para 70 repetições. Monitorar a formação de pontos de Gal3 como um indicador de permeabilização da membrana lisossomal.
- Danificar todas as células marcadas em uma placa de cultura, conforme descrito abaixo.
- Coloque o prato da cultura em uma plataforma. Ilumine o prato com 660 nm de luz LED colimada (a luz infravermelha próxima é a base ideal no espectro de excitação de AlPcS2a).
- Colocar a placa de cultura no microscópio e monitorar os indicadores de permeabilização da membrana, conforme mencionado no passo 4.1.3.
- Avalie a lesão de IVs usando os seguintes indicadores.
- O conteúdo do endossomo ou lisossomo é mais altamente glicosilado, que são expostos ao citosol após a ruptura IV. Rotulá-los rapidamente usando galectinas citosólicas ligantes de glicanos, incluindo galectina-1, galectina-3, galectina-8 e galectina-916,20.
- O tamanho da ferida pode ser determinado pela liberação de corante impermeável à membrana, conforme descrito em21.
- A diferença entre endossomos e lisossomos é o seu valor de pH luminal. A ruptura lisossômica perturba o pH luminal, que pode ser medido usando corante sensível ao pH, como o FITC-dextran3.
Gráfico 3. O CALI mediado por AlPcS2a induz o recrutamento local de TagRFP-galectina-3 (Gal3) para os lisossomos dentro da região de iluminação. Os lisossomos em células HeLa expressas por TagRFP-galectina-3 foram corados durante a noite com 1 μM de AlPcS2a, seguido de iluminação focalizada com luz infravermelha próxima (633 nm) dentro do quadrado amarelo. O sinal de AlPcS2a dentro do quadrado amarelo é fotobranqueado, acompanhado pela formação de puncta de TagRFP-galectina-3. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Uma figura esquemática representando o dano IV induzido por AlPcS2a, incluindo endossomo e lisossomo, foi mostrada (Figura 1).
Marcadores disponíveis comercialmente podem ser usados para determinar as condições de coloração de AlPcS2a . Por exemplo, a colocalização de AlPcS2a puncta e corante verdefluorescente 22 (Figura 2).
A galectina-3 marcada com fluoróforo pode ser aplicada como um indicador para monitorar danos IV (Figura 3). Além disso, a localização do puncta de Gal3 também pôde ser rastreada para o ensaio da via de sinalização a jusante, incluindo reparo lisossomal e lisofagia 3,23. O rápido acúmulo de Gal3 do citosol para o IV danificado aumentaria significativamente a intensidade de Gal3, o que tornaria a intensidade do ponto de Gal3 saturada se o contraste das imagens fosse ajustado para mostrar Gal3 citosólico. De fato, as imagens também mostraram uma ligeira diminuição na Gal3 citosólica.
Em resumo, esses resultados indicam que o CALI baseado em AlPcS2a é capaz de controlar a ruptura lisossômica local dentro da ROI, deixando o restante dos lisossomos intacto.
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Discussion
AlPcS2a liga-se à membrana plasmática, em seguida, é internalizado por endocitose e eventualmente se acumula em lisossomos. AlPcS2a pode, assim, ser localizado nos compartimentos subcelulares ajustando a duração da incubação. Uma limitação dessa metodologia é que apenas uma subpopulação de IVs poderia ser marcada por AlPcS2a através de endocitose, pois existem muitas outras fontes de IV de membrana, como RE e aparelho de Golgi. Além disso, a marcação seletiva de AlPcS2a em endossomos precoces ou tardios seria um desafio, no entanto, marcadores fluorescentes podem ser usados para diferenciar endossomos formados precocemente daqueles formados tardiamente durante imagens subcelulares. Danos IV induzidos por CALI podem ser induzidos com uma variedade de corantes 3,24.
A intensidade do dano pode ser controlada pela potência e duração da iluminação da luz. Maior intensidade de dano pode resultar em encolhimento celular ou necrose. Aqui, vários indicadores de dano IV foram mostrados, os quais poderiam ser usados para determinar as condições experimentais. Além disso, esses indicadores também podem servir como marcadores para IVs danificados e fornecer informações sobre sua distribuição subcelular ao longo do tempo.
Clinicamente, o AlPcS2a foi projetado para melhorar a liberação de agentes terapêuticos de maneira local e tempo-específica por meio da internalização fotoquímica (ICP)25. Entretanto, efeitos colaterais inevitáveis, como apoptose ou diferenciação celular, também podem acompanhar o tratamento da ICP26. Uma vez que tais efeitos podem ser consequência da indução de dano lisossomal, os ensaios fornecidos apresentam uma ferramenta potencial para uso pré-clínico.
Neste estudo, os protocolos de CALI mediados por AlPcS2a descrevem o controle seletivo do tamanho do dano (local e parte de endossomos ou lisossomos). Os cientistas podem monitorar seu comportamento subcelular, enquanto o resto dos IVs permanecem intactos e podem ser tratados como um controle. Essa metodologia tem sido aplicada em diversos estudos. Por exemplo, lisossomos danificados são marcados sequencialmente com ubiquitina e proteína de cadeia leve associada a microtúbulos 3 (CL3), e sofrem depuração autofágica3. Além disso, a marcação de galectina-3 e galectina-8 em endossomos lesados é controlada pelo glicano de superfície celular27. Uma vez que o AlPcS2a tem sido usado in vivo para ICP, o CALI mediado por AlPcS2a também pode ser usado in vivo. Este protocolo fornece uma ferramenta robusta para estudar a biologia celular usando o cali mediado por AlPcS2a. Esses estudos suportam que o CALI mediado por AlPcS 2a é uma ferramentarobusta para estudos de biologia celular.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS pelo apoio à pesquisa. A instalação principal é financiada pela Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Os autores agradecem ao Common Equipment Core Facility do Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) pelo auxílio na aquisição das imagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
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