Summary
La inactivación láser asistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS2a es una poderosa herramienta para estudiar el daño espaciotemporal de vesículas intracelulares (IV) en células vivas.
Abstract
Las vesículas intracelulares (IV) se forman a través de la endocitosis de vesículas en citoplasma. La formación IV está involucrada en la activación de varias vías de señal a través de la permeabilización de las membranas IV y la formación de endosomas y lisosomas. Se aplica un método llamado inactivación láser asistida por cromóforos (CALI) para estudiar la formación de IV y los materiales en el control de la regulación IV. CALI es una metodología fotodinámica basada en imágenes para estudiar la vía de señalización inducida por la permeabilización de la membrana. El método permite la manipulación espaciotemporal del orgánulo seleccionado para ser permeabilizado en una célula. El método CALI se ha aplicado para observar y monitorizar moléculas específicas mediante la permeabilización de endosomas y lisosomas. Se sabe que la ruptura de la membrana de las vías intravenosas recluta selectivamente proteínas de unión a glicanos, como la galectina-3. Aquí, el protocolo describe la inducción de la ruptura IV por AlPcS2a y el uso de galectina-3 como marcador para marcar lisosomas deteriorados, lo cual es útil para estudiar los efectos posteriores de la ruptura de la membrana IV y sus efectos aguas abajo en diversas situaciones.
Introduction
Los endosomas, un tipo de vesícula intracelular (IV), se forman por endocitosis y luego maduran en lisosomas. Varias vías de señal intracelular están involucradas en la formación de IV; además, diferentes estímulos intrínsecos y extrínsecos pueden dañar las vías intravenosas (por ejemplo, los patógenos pueden escapar de la membrana limitada durante la infección y entrar en el citoplasma1). Esto suele ir acompañado de la ruptura de vesículas endocitóticas2. Por lo tanto, las técnicas para atacar y dañar las IV pueden ser utilizadas en estudios relacionados3.
La terapia fotodinámica (TFD) es una terapia dependiente de la luz para combatir enfermedades matando tumores o patógenos4. En la TFD, las células diana son marcadas con cromóforos no tóxicos, llamados fotosensibilizadores, que pueden ser activados localmente por la iluminación de la luz 5,6. Los fotosensibilizadores absorben la energía de la luz y se transforman en un estado singlete excitado, lo que lleva al estado de triplete excitado de larga duración. Los fotosensibilizadores del estado triplete pueden sufrir transferencia de electrones o energía y formar especies reactivas de oxígeno (ROS) en presencia de oxígeno, y pueden destruir espacialmente las células marcadas dentro de la región de iluminación7. La consecuencia varía dependiendo de la potencia de la luz8. Al controlar la concentración de fotosensibilizadores y la intensidad de la iluminación de la luz, las biomoléculas objetivo pueden inactivarse selectivamente sin lisis celular, denominada inactivación de la luz asistida por cromóforos (CALI)9. Con el desarrollo significativo de fotosensibilizadores que pueden etiquetar selectivamente varios objetivos subcelulares, CALI se ha convertido en una herramienta valiosa para controlar la inactivación mediada por luz de biomoléculas para biomoléculas pequeñas como nucleótidos y proteínas, así como orgánulos como mitocondrias y endolisosomas 3,10,11,12,13.
En comparación con CALI, también se utilizan métodos químicos o físicos para dañar las membranas, como la toxina bacteriana 14,15 y el tratamiento con Leu-Leu-OMe16 para el daño lisosomal. Sin embargo, estos métodos muestran un deterioro masivo de las vías intravenosas dentro de las células. En la CALI se utilizan fotosensibilizadores robustos (es decir, ácido disulfónico cloruro de ftalocianina Al(III) (AlPcS2a)); AlPcS2a, dirigido a los lisosomas a través de endocitosis, se utiliza para romper endosomas o lisosomas en una región controlada17. AlPcS2a es un cromóforo basado en ftalocianina impermeable a la membrana celular que se une a los lípidos en la membrana plasmática y se internaliza a través de la endocitosis y finalmente se acumula dentro del lisosoma a través de la vía endocítica18. Absorbe la luz dentro de una región espectral del infrarrojo cercano y genera oxígeno singlete, un ROS importante generado por AlPcS2a 18 excitado. La descomposición del oxígeno singlete limita rápidamente su difusión y distancia de reacción dentro de una pequeña región en las células (aproximadamente 10-20 nm)19. Al ajustar la duración de la incubación de AlPcS2a y la iluminación de la luz, se permite el control espacio-temporal del daño de las vías intravenosas dentro de un área subcelular. Por lo tanto, CALI se convierte en una herramienta poderosa para examinar las consecuencias del daño IV y la formación y regulación de las IV.
En este estudio, se aborda un protocolo específico de CALI utilizando AlPcS2a como fotosensibilizador. Este protocolo se puede aplicar a varios tipos de IV, incluidos endosomas y lisosomas, y se puede utilizar para examinar las respuestas de seguimiento después de la ruptura de la membrana. Las células HeLa que expresan galectina-3 conjugada con fluoróforos16,20 reveladas después de la ruptura del lisosoma se utilizan para demostrar este protocolo.
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Protocol
1. Preparación de existencias de AlPcS2a
- Disolver 10 mg de AlPcS2a en 400 μL de NaOH 0,1 M. Para mejorar la solubilidad, caliente la solución a 50 °C y el vórtice.
- Mezcle la solución con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, filtre la solución con un filtro de 0.22 μm para eliminar los precipitados insolubles.
- Mida la concentración de la solución a través de un espectrofotómetro UV-Vis. El coeficiente de extinción de AlPcS2a a 672 nm es 4 x 104 cm-1 M-1. Diluir la solución de AlPcS2a con PBS para hacer una solución de 1 mM. Preparar 1 ml de alícuotas y almacenar a -20 °C.
2. Transfección
NOTA: Gal3-GFP se aplica como un indicador para la obtención de imágenes de células vivas de ruptura lisosomal.
- Mantener el cultivo de células HeLa en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Después de lavar las células con PBS, tripsinizar las células, luego resuspender las células en DMEM suplementado con 10% FBS.
NOTA: El método es aplicable para la mayoría de las líneas celulares adjuntas, incluidas las líneas celulares HeLa y A549. En principio, a pesar de no probar las células de suspensión, los ensayos CALI podrían realizarse con ellas. - Diluir 300 ng de plásmido Gal3-GFP en 25 μL de medio sérico reducido y, a continuación, añadir 0,6 μL de reactivo P3000. Mezclar suavemente. Diluir 0,45 μL de reactivo Lipofectamina 3000 en 25 μL de medio sérico reducido. Mezclar suavemente.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Mezclar ADN diluido y Lipofectamina 3000 diluida, y luego incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Mezcle la mezcla de ADN y lipofectamina, 3 x 105 células HeLa suspendidas y 200 μL de DMEM + 10% FBS, y luego siembre las células en la región central de vidrio de un plato de botón de vidrio de 35 mm.
3. Tinción de AlPcS2a
- Para permitir la fijación celular, incubar las células a 37 °C en la incubadora suministrada con 5% deCO2 durante al menos 4 h.
- Diluir AlPcS 2a en DMEM suplementado con FBS al 10% para hacer una solución de AlPcS2a de 1 μM. Precaliente el medio que contiene AlPcS2a en un baño maría a 37 °C. Reemplace el medio de cultivo con el medio que contiene AlPcS2a.
- Incubar las células a 37 °C en la incubadora suministrada con 5% deCO2 durante la noche (16-18 h).
- Al día siguiente, lave las células dos veces con PBS para eliminar AlPcS2a extracelular. Reemplace el medio con medio fresco y luego incubar a 37 °C durante 4 h para permitir que el colorante residual a lo largo de la vía endocítica se acumule en los lisosomas.
NOTA: Para teñir endosomas, incubar células en 1 μM AlPcS2a en DMEM que contenga 10% de FBS durante 15 min a 37 °C. A continuación, lave las células dos veces con PBS e incubarlas en un medio precalentado antes de obtener imágenes.
Figura 1. Una figura esquemática que representa el daño IV selectivo con AlPcS2a. La figura muestra los esquemas del daño intravenoso selectivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Tinción lisosomal con AlPcS2a. Los lisosomas marcados durante la noche con 1 μM AlPcS2a en células HeLa se tiñen positivamente con colorante fluorescente verde 50 nM. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Imágenes de muestra e iluminación de luz
NOTA: Se puede realizar daño intravenoso dentro de una región subcelular de una sola célula o todas las células marcadas con AlPcS2a en una placa de cultivo. La iluminación a granel de toda la placa de cultivo permite el estudio cuantitativo de este daño, incluidos los estudios bioquímicos.
- Manipular células individuales dañando lisosomas dentro de una sola célula, como se describe a continuación.
- Coloque la placa de cultivo en el escenario de un microscopio confocal. Utilice los láseres de 488 nm y 561 nm para excitar GFP y AlPcS2a, respectivamente.
- Encierre en un círculo una región de interés (ROI) de 5 x 5 μm2 en las vesículas marcadas con AlPcS2a seleccionadas para ser dañadas.
- Pulse ilumina el ROI con un láser de 633 nm de 0,21 mW para 70 repeticiones. Monitorizar la formación de Gal3 puncta como indicador de permeabilización de la membrana lisosomal.
- Dañar todas las células etiquetadas en una placa de cultivo como se describe a continuación.
- Coloque el plato de cultivo en una plataforma. Ilumine el plato con 660 nm de luz LED colimada (la luz infrarroja cercana es la base ideal en el espectro de excitación de AlPcS2a).
- Colocar la placa de cultivo en el microscopio y controlar los indicadores de permeabilización de la membrana como se menciona en el paso 4.1.3.
- Evalúe la lesión de las vías intravenosas utilizando los siguientes indicadores.
- El contenido del endosoma o lisosoma es más altamente glicosilado, que se expone al citosol tras la ruptura IV. Marquételos rápidamente usando galectinas citosólicas de unión a glicanos, incluyendo galectina-1, galectina-3, galectina-8 y galectina-916,20.
- El tamaño de la herida se puede determinar mediante la liberación de tinte impermeable a la membrana como se describe en21.
- La diferencia entre endosomas y lisosomas es su valor de pH luminal. La ruptura lisosomal perturba el pH luminal, que se puede medir mediante el uso de colorantes sensibles al pH, como FITC-dextrano3.
Figura 3. CALI mediada por AlPcS2a induce el reclutamiento local de TagRFP-galectina-3 (Gal3) a los lisosomas dentro de la región de iluminación. Los lisosomas en las células HeLa expresadas con TagRFP-galectina-3 se tiñeron durante la noche con 1 μM AlPcS2a, seguido de iluminación de enfoque con luz infrarroja cercana (633 nm) dentro del cuadrado amarillo. La señal de AlPcS2a dentro del cuadrado amarillo se fotoblanquea, acompañada de la formación de TagRFP-galectina-3 puntcta. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Se ha mostrado una figura esquemática que representa el daño IV inducido por AlPcS2a, incluyendo endosoma y lisosoma (Figura 1).
Los marcadores disponibles comercialmente se pueden utilizar para determinar las condiciones de tinción de AlPcS2a . Por ejemplo, AlPcS2a punto y colorante verdefluorescente 22 colocalización (Figura 2).
La galectina-3 marcada con fluoróforos se puede aplicar como un indicador para monitorear el daño IV (Figura 3). Además, la ubicación de Gal3 puncta también podría rastrearse para analizar la vía de señalización aguas abajo, incluida la reparación de lisosomas y la lisofagia 3,23. La rápida acumulación de Gal3 del citosol al IV dañado aumentaría significativamente la intensidad de Gal3, lo que haría que la intensidad de la Gal3 punto se saturara si el contraste de las imágenes se ajusta para mostrar Gal3 citosólico. De hecho, las imágenes también mostraron una ligera disminución de Gal3 citosólico.
En resumen, estos resultados indican que el CALI basado en AlPcS2a es capaz de controlar la ruptura lisosomal local dentro del ROI, dejando intactos el resto de los lisosomas.
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Discussion
AlPcS 2a se une a la membrana plasmática, luego es internalizado por endocitosis y finalmente seacumula en los lisosomas. Por lo tanto, AlPcS2a se puede localizar en los compartimentos subcelulares ajustando la duración de la incubación. Una limitación de esta metodología es que solo una subpoblación de IV podría ser etiquetada por AlPcS2a a través de endocitosis porque hay muchas otras fuentes de membrana de IV, como ER y aparato de Golgi. Además, el etiquetado selectivo de AlPcS2a en endosomas tempranos o tardíos sería un desafío, sin embargo, los marcadores fluorescentes se pueden usar para diferenciar los endosomas formados temprano de los formados tardíamente durante las imágenes subcelulares. El daño IV inducido por CALI puede ser inducido con una variedad de colorantes 3,24.
La intensidad del daño puede ser controlada por la potencia y la duración de la iluminación de la luz. Una mayor intensidad del daño puede provocar encogimiento celular o necrosis. Aquí, se han mostrado varios indicadores de daño intravenoso, que podrían usarse para determinar las condiciones experimentales. Además, estos indicadores también pueden servir como marcadores para IVs dañados y proporcionar información sobre su distribución subcelular a lo largo del tiempo.
Clínicamente, AlPcS2a está diseñado para mejorar la administración de agentes terapéuticos de una manera específica en el sitio y el tiempo a través de la internalización fotoquímica (PCI)25. Sin embargo, efectos secundarios inevitables, como la apoptosis o diferenciación celular, también pueden acompañar al tratamiento con ICP26. Dado que tales efectos pueden ser consecuencia de la inducción del daño lisosomal, los ensayos proporcionados presentan una herramienta potencial para el uso preclínico.
En este estudio, los protocolos CALI mediados por AlPcS2a describen el control selectivo del tamaño del daño (local y parte de endosomas o lisosomas). Los científicos pueden monitorear su comportamiento subcelular, mientras que el resto de las vías intravenosas permanecen intactas y podrían tratarse como un control. Esta metodología se ha aplicado en varios estudios. Por ejemplo, los lisosomas dañados se marcan secuencialmente con ubiquitina y proteína asociada a microtúbulos de cadena ligera 3 (LC3), y se someten a depuración autofágica3. Además, el marcado de galectina-3 y galectina-8 en endosomas dañados está controlado por el glicano27 de la superficie celular. Dado que AlPcS2a se ha utilizado in vivo para PCI, CALI mediado por AlPcS2a también podría usarse in vivo. Este protocolo proporciona una herramienta robusta para estudiar la biología celular utilizando CALI mediada por AlPcS2a. Estos estudios respaldan que el CALI mediado por AlPcS2a es una herramienta robusta para estudios de biología celular.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS por el apoyo a la investigación. La instalación central está financiada por el Proyecto de Instrumento Innovador y Instalación Central de la Academia Sínica (AS-CFII-111-213). Los autores agradecen a Common Equipment Core Facility del Instituto de Ciencias Biomédicas (IBMS), Academia Sinica (AS) por ayudar a la adquisición de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
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