Summary
يعد التحديد الدقيق للخلايا السلفية الليفية الدهنية المنشأ (FAPs) والخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) أمرا بالغ الأهمية لدراسة وظيفتها البيولوجية في الحالات الفسيولوجية والمرضية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لعزل وتنقية وزراعة FAPs و MuSCs من عضلات الفئران البالغة.
Abstract
الخلايا السلفية الليفية الشحمية (FAPs) هي مجموعة من الخلايا اللحمية الوسيطة المقيمة في العضلات الهيكلية (MSCs) القادرة على التمييز على طول السلالة الليفية أو الشحمية أو العظمية أو الغضرونية. جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) ، تلعب FAPs دورا حاسما في توازن العضلات وإصلاحها وتجديدها ، مع الحفاظ بنشاط على المصفوفة خارج الخلية (ECM) وإعادة تشكيلها. في الحالات المرضية ، مثل التلف المزمن والحثل العضلي ، تخضع FAPs لتنشيط شاذ وتتمايز إلى خلايا ليفية منتجة للكولاجين والخلايا الشحمية ، مما يؤدي إلى التليف وتسلل الدهون العضلية. وبالتالي ، تلعب FAPs دورا مزدوجا في تجديد العضلات ، إما عن طريق الحفاظ على دوران MuSC وتعزيز إصلاح الأنسجة أو المساهمة في تكوين ندبة ليفية وتسلل الدهون خارج الرحم ، مما يعرض سلامة ووظيفة الأنسجة العضلية الهيكلية للخطر. يعد التنقية المناسبة ل FAPs و MuSCs شرطا أساسيا لفهم الدور البيولوجي لهذه الخلايا في الظروف الفسيولوجية وكذلك في الحالات المرضية. هنا ، نصف طريقة موحدة للعزل المتزامن ل FAPs و MuSCs من عضلات الأطراف للفئران البالغة باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS). يصف البروتوكول بالتفصيل التفكك الميكانيكي والإنزيمي للخلايا أحادية النواة من عضلات الأطراف بأكملها وعضلات الظنبوب الأمامية (TA) المصابة. يتم عزل FAPs و MuSCs لاحقا باستخدام فارز خلايا شبه آلي للحصول على مجموعات خلايا نقية. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة محسنة لزراعة FAPs و MuSCs الهادئة والمنشطة ، إما بمفردها أو في ظروف الزراعة المشتركة.
Introduction
العضلات الهيكلية هي أكبر نسيج في الجسم ، وهو ما يمثل ~ 40 ٪ من وزن الإنسان البالغ ، وهي مسؤولة عن الحفاظ على الموقف ، وتوليد الحركة ، وتنظيم استقلاب الطاقة الأساسية ، ودرجة حرارة الجسم1. العضلات الهيكلية هي نسيج ديناميكي للغاية وتمتلك قدرة ملحوظة على التكيف مع مجموعة متنوعة من المحفزات ، مثل الإجهاد الميكانيكي ، والتغيرات الأيضية ، والعوامل البيئية اليومية. بالإضافة إلى ذلك ، تتجدد العضلات الهيكلية استجابة للإصابة الحادة ، مما يؤدي إلى استعادة كاملة لمورفولوجيتها ووظائفها2. تعتمد لدونة العضلات الهيكلية بشكل أساسي على مجموعة من الخلايا الجذعية العضلية المقيمة (MuSCs) ، والتي تسمى أيضا الخلايا الساتلية ، والتي تقع بين غشاء البلازما من الألياف العضلية والصفيحة القاعدية 2,3. في ظل الظروف العادية ، توجد MuSCs في مكان العضلات في حالة هادئة ، مع عدد قليل من الانقسامات للتعويض عن دوران الخلايا وتجديد مجموعة الخلايا الجذعية4. استجابة للإصابة ، تدخل MuSCs دورة الخلية ، وتتكاثر ، وتساهم إما في تكوين ألياف عضلية جديدة أو تعود إلى مكانتها في عملية تجديد ذاتي 2,3. بالإضافة إلى MuSCs ، تعتمد الصيانة الاستتبابية وتجديد العضلات الهيكلية على دعم مجموعة من الخلايا المقيمة في العضلات تسمى السلف الليفي الشحمي (FAPs) 5،6،7. FAPs هي خلايا لحمية وسيطة مدمجة في النسيج الضام العضلي وقادرة على التمييز على طول السلالة الليفية أو الشحمية أو العظمية أو الغضروفية5،8،9،10. توفر FAPs الدعم الهيكلي ل MuSCs لأنها مصدر لبروتينات المصفوفة خارج الخلية في مجال الخلايا الجذعية العضلية. كما تعزز FAPs الصيانة طويلة الأجل للعضلات الهيكلية عن طريق إفراز السيتوكينات وعوامل النمو التي توفر الدعم الغذائي لتكوين العضلات ونمو العضلات 6,11. عند الإصابة العضلية الحادة ، تتكاثر FAPs بسرعة لإنتاج مكانة عابرة تدعم السلامة الهيكلية للعضلات المجددة وتوفر بيئة مواتية للحفاظ على انتشار MuSCs والتمايز بطريقة باراكرين5. مع استمرار التجديد ، يتم مسح FAPs من العضلات التجديدية عن طريق موت الخلايا المبرمج ، وتعود أعدادها تدريجيا إلى المستوى القاعدي12. ومع ذلك ، في الظروف التي تفضل إصابة العضلات المزمنة ، تتجاوز FAPs الإشارات المؤيدة للاستماتة وتتراكم في مكانة العضلات ، حيث تتمايز إلى الخلايا الليفية المنتجة للكولاجين والخلايا الدهنية ، مما يؤدي إلى تسلل الدهون خارج الرحم وتشكيل ندبة ليفية12,13.
نظرا لتعدد قدراتها وقدراتها التجديدية ، تم تحديد FAPs و MuSCs كأهداف محتملة في الطب التجديدي لعلاج اضطرابات العضلات الهيكلية. لذلك ، للتحقيق في وظيفتها وإمكاناتها العلاجية ، من المهم إنشاء بروتوكولات فعالة وقابلة للتكرار لعزل وثقافة FAPs و MuSCs.
يمكن لفرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) تحديد مجموعات الخلايا المختلفة بناء على الخصائص المورفولوجية مثل الحجم والدقة ، ويسمح بالعزل الخاص بالخلية بناء على استخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح الخلية. في الفئران البالغة ، تعبر MuSCs عن جزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1 ، المعروف أيضا باسم CD106) 14,15 و α7-Integrin15 ، بينما تعبر FAPs عن مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية α (PDGFRα) ومستضد الخلايا الجذعية 1 (Sca1 أو Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . في البروتوكول الموصوف هنا ، تم تحديد MuSCs على أنها CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ ، في حين تم تحديد FAPs على أنها CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. بدلا من ذلك ، تم استخدام الفئران PDGFRαEGFP لعزل FAPs مثل CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- الأحداث18,19. علاوة على ذلك ، قارنا التداخل بين إشارة الفلورسنت لخلايا PDGFRα-GFP + بالخلايا التي حددتها علامة السطح Sca1. أظهر تحليلنا أن جميع الخلايا المعبرة عن GFP كانت إيجابية أيضا ل Sca1 ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام أي من النهجين لتحديد وعزل FAPs. وأخيرا ، أكد التلطيخ بأجسام مضادة محددة العلامة نقاء كل مجموعة خلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات (ACUC) التابعة للمعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية (NIAMS). يجب على المحققين الذين يقومون بتنفيذ هذا البروتوكول الالتزام بالمبادئ التوجيهية المحلية لأخلاقيات الحيوان.
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية عزل FAPs و MuSCs من الأطراف الخلفية وعضلات الظنبوب الأمامية المصابة (TA) للفئران البالغة من الذكور والإناث (3-6 أشهر) ويوفر إرشادات للتثاقف المشترك FAPs و MuSCs. ويرد في الشكل 1 نظرة عامة على الإجراء التجريبي. يجب تنفيذ جميع خطوات هذا البروتوكول في ظروف معقمة وفي درجة حرارة الغرفة (RT) ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. إعداد الكاشف
- متوسط الغسيل (WM): قم بإعداد هذا الحل عن طريق إضافة مصل الحصان بنسبة 10٪ (vol / vol) و 1x البنسلين / الستربتومايسين إلى وسائط خلايا F-10 Nutrient Mix من Ham. يمكن تحضير WM مسبقا وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
- المخزن المؤقت لتفكك العضلات (MDB): قم بإعداد هذا المخزن المؤقت عن طريق إذابة الكولاجيناز II في WM. في حالة جمع عضلات الأطراف الخلفية الكاملة ، قم بإذابة 1000 U / mL Collagenase II في 10 مل من WM لكل فأر (ليتم تحضيره في أنبوب مخروطي 50 مل). في حالة جمع عضلات TA ، قم بإذابة 800 U / mL Collagenase II في 7 مل من WM لكل فأر (ليتم تحضيره في أنبوب مخروطي 15 مل). بالنسبة لعضلات TA ، سيساعد ذلك على تصور كريات الخلايا بشكل أفضل والحصول على عائد أعلى من FAPs و MuSCs. تحضير MDB طازجة قبل جمع العضلات والاحتفاظ بها على الجليد حتى الحاجة.
- مخزون محلول الكولاجيناز II: قم بتحضير هذا المحلول عن طريق إذابة الكولاجيناز II في محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي قدره 1000 U / mL. قم بتصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر و aliquot إلى مخزون 1 مل. تخزين الحل في -20 درجة مئوية.
- قم بتحضير هذا المحلول عن طريق إذابة Dispase في 1x PBS معقمة إلى تركيز نهائي قدره 11 U / mL. قم بتصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر و aliquot إلى مخزون 1 مل. تخزين الحل في -20 درجة مئوية.
- تحضير وسط زراعة FAP عن طريق استكمال DMEM مع 10٪ (vol / vol) مصل البقر الجنيني ، 1x البنسلين / الستربتومايسين ، و 2.5 نانوغرام / مل FGF. تخزين الوسط في 4 درجات مئوية.
- قم بإعداد وسط ثقافة MuSC المكمل F10 مع مصل الحصان بنسبة 10٪ (vol / vol) ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين ، و 2.5 نانوغرام / مل FGF. تخزين الوسط في 4 درجات مئوية.
- تحضير وسط الاستزراع المشترك عن طريق استكمال DMEM مع 10٪ (vol / vol) مصل البقر الجنيني ، 10٪ (vol / vol) مصل الحصان ، 1x البنسلين / الستربتومايسين ، و 2.5 نانوغرام / مل FGF. تخزين الوسط في 4 درجات مئوية.
2. حصاد عضلات الأطراف الخلفية
- أضف 2-3 مل من WM في طبق 6 سم (طبق واحد لكل ماوس) وضعه على الثلج.
- أداء القتل الرحيم عن طريق الاختناق: ضع الماوس في غرفة CO 2 وأدخل 100٪ CO2. استخدم خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة.
- ضع الماوس ضعيفا على وسادة تشريح ورشه بالإيثانول بنسبة 70٪ (vol / vol) لتجنب التلوث.
- استخدم الملقط لقرص مركز جلد بطن الماوس وقطع فتحة ~ 1 سم أفقيا. أمسك حواف الجرح والمكتب في الماوس عن طريق سحب الفتحة في اتجاهين متعاكسين للكشف عن العضلات الموجودة تحتها. كشف جانب واحد من الطرف الخلفي للماوس في ذلك الوقت.
- قبل جمع العضلات ، قم بإزالة الدهون بين العضلات بين أوتار الركبة والطرف القريب من العضلة رباعية الرؤوس. سيؤدي ذلك إلى تحسين عزل FAPs و MuSCs.
- دون الإضرار بالأنسجة، استخدم ملقطا حادا لكسر اللفافة وتقشيرها لكشف عضلات TA والباسطة الرقمية الطويلة (EDL) الموجودة تحتها. قم بتشغيل الطرف الحاد من الملقط أسفل عضلات TA / EDL لفصل العضلات عن الساق.
- اقطع الأوتار التي تربط TA / EDL بالكاحل ، وأثناء إمساكها بالملقط ، قم بقص العضلات بمقص على طول الخط الطولي ل TA / EDL. قطع الأوتار حول الركبة لفصل عضلات TA / EDL بأكملها. ضع العضلات في طبق 6 سم محفوظ على الثلج.
- المضي قدما في عزل المعدة والعضلات الوحيدة عن طريق قطع جميع الأوتار في الكاحل وفصل العضلات عن الساق والشظية. قطع حول الركبة ونقل العضلات إلى طبق 6 سم.
- قشر اللفافة حول الفخذ الرباعية وافصلها عن عظم الفخذ عن طريق تشغيل الطرف الحاد من الملقط بين العضلات والعظام. قطع الأوتار حول الركبة ، وأثناء عقد الفخذ الرباعي مع ملقط في الطرف البعيد ، قم بتقليم بقية العضلات عن طريق قطع عظم الفخذ. ضع العضلات في طبق 6 سم.
- افصل أوتار الركبة والعضلات المتبقية حول عظم الفخذ وانقلها إلى طبق 6 سم. اجمع عضلات الأطراف الخلفية في طبق طوله 6 سم محفوظ على الثلج.
ملاحظة: تجنب إتلاف الأوعية الدموية، عندما يكون ذلك ممكنا، لمنع تكوين كتل الدم التي يمكن أن تتداخل مع عزل المصب. في حالة حدوث نزيف ، قم بمسح الوعاء المعزول على الفور بشاش معقم لامتصاص الدم. - جمع TA ، EDL ، gastrocnemius ، وحيد ، رباعية الرؤوس ، وعضلات أوتار الركبة من الطرف المقابل.
ملاحظة: عند عزل عضلات الأطراف الخلفية بأكملها ، لا تجمع اثنين أو أكثر من الفئران. في حالة عزل عضلات TA ، يمكن تجميع ما يصل إلى ثلاث عضلات TA.
3. هضم العضلات الميكانيكية والأنزيمية
- استنشق WM من طبق 6 سم وأضف 1-2 مل من MDB للحفاظ على رطوبة العضلات.
- افرم العضلات جيدا حتى الحصول على عجينة ملاط من الأنسجة المفرومة جيدا. للقيام بذلك ، استخدم الملقط لتثبيت أحد طرفي قطعة من العضلات ، ثم استخدم مشرطا لتمزيق العضلات وتقطيعها إلى شرائح حتى تصبح أقل إحكاما.
- باستخدام المقص ، استمر في قطع العضلات إلى قطع صغيرة لمدة 1-2 دقيقة. كرر هذه الخطوة لكل مجموعة من العضلات حتى تحصل على حمأة عضلية مفروم جيدا.
ملاحظة: هذه خطوة حاسمة للغاية لزيادة عائد FAPs و MuSCs. يوصى بقضاء 8-10 دقائق (4-5 دقائق في حالة عزل عضلات TA فقط) في هذه الخطوة لضمان فرم العضلات بشكل صحيح. - انقل العضلات المفرومة من كل فأر إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على MDB.
- أغلق الأنابيب بفيلم مختبري واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية مع إثارة (75 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة. ضع الأنابيب أفقيا على طول مسار الاهتزاز واستخدم الأوزان للحفاظ على الأنابيب مغمورة في الماء.
- إذابة 1 مل من مخزون Collagenase II و 1 مل من مخزون dispase لكل ماوس. قبل الاستخدام، قم بتدوير مخزون dispase في دوار دلو متأرجح عند 10000 × g لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. استخدم فقط supernatant.
- إذا تم جمع عضلات الأطراف الخلفية بأكملها ، فتابع على النحو التالي:
- بعد 1 ساعة ، قم بإزالة الأنبوب من الخلاط واملأه إلى 50 مل ب WM. قم بعكسه بلطف عدة مرات لضمان الخلط.
- الطرد المركزي للخلايا في دوار دلو متأرجح عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل 42 مل من supernatant إلى أنبوبين جديدين (~ 21 مل في كل أنبوب) واترك ~ 8 مل في الأنبوب الأصلي.
- املأ الأنابيب الجديدة التي تحتوي على 21 مل من السوبرناتانت حتى 50 مل باستخدام WM. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى في دوار دلو متأرجح عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشاق كل supernatant والحفاظ على الكريات على الجليد.
- أضف 1 مل من مخزون الكولاجيناز II و 1 مل من مخزون dispase في الأنبوب الأصلي الذي يحتوي على ~ 8 مل من MDB.
- باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أعد تعليق الكريات 10 مرات دون انسداد. أخرج المحلول نحو جدار الأنبوب ، وتجنب تكوين فقاعات. في حالة حدوث انسداد أثناء إعادة التعليق ، ادفع طرف الماصة ضد الجزء السفلي من الأنبوب لتعطيل قطع العضلات ميكانيكيا. انتقل إلى الخطوة 3.9.
- إذا تم جمع عضلات TA ، فتابع على النحو التالي:
- بعد 1 ساعة ، قم بإزالة الأنبوب من الخلاط واملأه إلى 15 مل ب WM. قم بعكسه بلطف عدة مرات لضمان الخلط.
- الطرد المركزي للخلايا في دوار دلو متأرجح عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل 13 مل من supernatant إلى أنبوب واحد جديد 15 مل واترك ~ 2 مل في الأنبوب الأصلي.
- املأ الأنبوب الجديد الذي يحتوي على 13 مل من السوبرناتانت حتى 15 مل باستخدام WM. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى في دوار دلو متأرجح عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق كل السوبرناتانت واحتفظ بالحبيبات على الجليد.
- باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق الكريات في الأنبوب الأصلي لأعلى ولأسفل دون انسداد.
- أضف 1 مل من مخزون Collagenase II و 1 مل من مخزون dispase في الأنبوب الأصلي الذي يحتوي على 2 مل من MDB واملأ ما يصل إلى 10 مل ب WM. انتقل إلى الخطوة 3.9.
- أغلق الأنابيب بفيلم مختبري واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية مع إثارة (75 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة. ضع الأنابيب كما في الخطوة 3.5.
4. توليد الخلايا أحادية النواة
ملاحظة: في حالة العمل مع عضلات TA التي تم جمعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل، انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل قبل المتابعة مع الخطوة 4.1.
- بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الأنبوب من الخلاط. شفط وإخراج تعليق العضلات من خلال حقنة 10 مل مع إبرة 20 غرام بنجاح 10 مرات.
ملاحظة: قم بإخراج تعليق العضلات باتجاه جدار الأنبوب لتجنب الفقاعات والرغوة. قد تسد قطع صغيرة من الأوتار أو الغضاريف غير المهضومة الإبرة خلال الجولات الأولى من الشفط. في حالة حدوث انسداد ، استخدم ملقط معقم لإزالة الانسداد من طرف الإبرة. - املأ كل أنبوب يصل إلى 50 مل ب WM وقلبه بلطف عدة مرات لضمان الخلط.
- الطرد المركزي للخلايا في دوار دلو متأرجح عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد (~ 42 مل) وترك ~ 8 مل في الأنبوب الأصلي.
- املأ الأنبوب الجديد الذي يحتوي على 42 مل من السوبرناتانت حتى 50 مل باستخدام WM. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى في دوار دلو متأرجح عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق كل السوبرناتانت واحتفظ بالحبيبات على الجليد.
- ضع مصفاة خلية نايلون 40 ميكرومتر في الأنبوب المخروطي الأصلي سعة 50 مل الذي يحتوي على 8 مل من WM وقم بترطيب مصفاة الخلية مسبقا ب 1-2 مل من WM.
- أثناء حمل مصفاة خلايا النايلون 40 ميكرومتر ، استخدم ماصة 10 مل لإعادة تعليق الكريات بلطف 5-10 مرات. قم بتصفية الكريات من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى إلى نفس الأنبوب لتقليل فقدان الخلايا.
- في هذه الخطوة ، تأكد من وجود أنابيب إضافية مع كريات الخلايا على الجليد. قم بتصفية هذه الكريات مرة أخرى إلى الأنبوب الأصلي عن طريق إضافة 4-5 مل من WM إلى كل أنبوب لإعادة تعليق الكريات ونقل المحلول إلى مصفاة الخلية الموضوعة في الأنبوب الأصلي. السماح بالتصفية حسب الجاذبية.
- بعد جمع جميع الكريات في الأنبوب المخروطي الأصلي سعة 50 مل ، اشطف مصفاة الخلية ب 4-5 مل أخرى من WM. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من مصفاة الخلية.
- املأ كل أنبوب ب WM حتى 50 مل وقلبه بلطف عدة مرات لضمان الخلط.
- الطرد المركزي للخلايا في دوار دلو متأرجح عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. على الفور استنشاق كل supernatant بعد الطرد المركزي دون إزعاج الكرية.
- أعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر من WM وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 2 مل.
5. تلطيخ الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي
ملاحظة: لكل تجربة، قم بإعداد عناصر التحكم التالية: i) التحكم غير الملطخ، ii) التحكم في الجدوى للاختيار لسكان الخلايا الحية، iii) عناصر التحكم في التعويض الملطخة المفردة لتصحيح انتشار انبعاثات الفلوروكروم، IV) عناصر التحكم في التألق ناقص واحد (FMO) لتعيين حدود البوابة عن طريق حساب الانتشار غير المباشر. ارجع إلى الجدول 1 للحصول على قائمة كاملة بعناصر التحكم في التلوين.
- لإعداد تحكم غير ملطخ ، انقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على 190 ميكرولتر من WM. أعد تعليق الخلية وقم بالتصفية من خلال أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل مع غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر. اسمح لنظام التعليق بالتصفية حسب الجاذبية.
- استخدم ماصة 200 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من مصفاة الخلية. ختم مع غطاء وتركه على الجليد ، محمية من الضوء.
- قم بإعداد قابلية البقاء ، FMO ، وعناصر التحكم ذات اللون الواحد: تسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيق 10 2 مل وإضافة 190 ميكرولتر من WM إلى كل أنبوب و 10 ميكرولتر من تعليق الخلية. ارجع إلى الجدول 1 للحصول على قائمة كاملة بعناصر التحكم. أضف أجساما مضادة إلى الأنبوب المناسب اعتمادا على التحكم التجريبي. ارجع إلى الجدول 1 للحصول على معلومات حول تركيبة الأجسام المضادة وتركيزها.
- انقل بقية تعليق الخلية (500 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل (أنبوب تجريبي) وأضف الأجسام المضادة التالية: CD31-APC و CD45-APC و Sca1-Pacific Blue و VCAM-1-biotinو α7-Integrin-PE. ارجع إلى الجدول 1 للحصول على معلومات حول تركيبة الأجسام المضادة وتركيزها.
- اخلط كل أنبوب جيدا برفق لضمان التوزيع الموحد واحتضان الخلايا في شاكر دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة محمية من الضوء.
- بعد 45 دقيقة ، املأ جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيق حتى 2 مل ب WM. قم بعكس الأنابيب بلطف عدة مرات لضمان الخلط الكامل. الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي مبرد مع دوار ثابت الزاوية عند 250 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط supernatant دون إزعاج الكرية.
- أعد تعليق الخلايا في جميع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة في 300 ميكرولتر من WM.
- أضف الجسم المضاد للستربتافيدين إلى الأنابيب المناسبة. ارجع إلى الجدول 1 للحصول على معلومات حول تركيبة الأجسام المضادة وتركيزها. اخلط بلطف جيدا كل أنبوب لضمان توزيع موحد واحتضان الخلايا في شاكر دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. اترك الأنابيب المتبقية على الجليد ، محمية من الضوء.
- بعد 20 دقيقة ، املأ أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على جسم مضاد للستربتافيدين إلى 2 مل باستخدام WM. قم بعكس الأنابيب بلطف عدة مرات لضمان الخلط الكامل. الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي مبرد مع دوار ثابت الزاوية عند 250 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط supernatant تماما وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من WM.
- قبل البلل غطاء مصفاة الخلايا 35 ميكرومتر من أنابيب البوليسترين المستديرة القاع 10 5 مل مع 200 ميكرولتر من WM. تصفية الخلايا من أنابيب التحكم من خلال أنابيب البوليسترين المستديرة القاع المناسبة 5 مل. استخدم ماصة 200 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من مصفاة الخلية. ختم مع قبعات ، وترك الأنابيب على الجليد ، وحمايتها من الضوء.
- أعد تعليق الخلايا في الأنبوب التجريبي ب 200 ميكرولتر إضافية من WM لما مجموعه 500 ميكرولتر من WM. قبل أن تبلل غطاء مصفاة الخلية من أنبوب البوليسترين الدائري القاع 5 مل مع 200 ميكرولتر من WM. انقل تعليق الخلية من الأنبوب التجريبي إلى أنبوب البوليسترين ذو القاع المستدير 5 مل واسمح له بالتصفية حسب الجاذبية.
- شطف أنبوب الطرد المركزي الدقيق 2 مل الذي يحتوي على تعليق العينة التجريبي مع 300 ميكرولتر من WM وتمريره من خلال نفس غطاء المصفاة. استخدم ماصة 200 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من مصفاة الخلية. ختم مع غطاء ، وترك أنابيب على الجليد ، وحمايتها من الضوء.
ملاحظة: في حالة حدوث انسداد في غطاء مصفاة الخلايا 35 ميكرومتر، انقر برفق على الأنبوب الموجود على المقعد لتسهيل التدفق. - قم بإعداد وتسمية أنابيب التجميع ل FAPs و MuSCs. إذا كانت الخلايا المعزولة عن عضلات الأطراف الخلفية بأكملها ، فقم بفرز الخلايا في أنابيب مستديرة القاع من البولي بروبيلين سعة 5 مل مع ما يصل إلى 1 مل من FAPs أو MuSCs وسط الثقافة مع استكمال مصل 2x. في حالة عزل الخلايا من عضلات TA ، قم بفرز FAPs و MuSCs في أنابيب طرد مركزي دقيقة 2 مل تحتوي على ما يصل إلى 400 ميكرولتر من وسط الثقافة مع استكمال مصل 2x.
6. فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS)
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مقياس تدفق خلوي بحثي مدمج على الطاولة مجهز بفوهة 100 ميكرومتر ويتميز بتكوين ثلاثي الليزر (488 نانومتر ، 640 نانومتر ، 405 نانومتر) مع القدرة على تحليل ما يصل إلى تسعة فلوروكرومات مختلفة (11 معلمة بما في ذلك المبعثر الأمامي والجانبي). الفلوروكرومات المستخدمة في هذا البروتوكول ومرشحات ممر النطاق الكاشف المرتبطة بها هي كما يلي: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; أزرق المحيط الهادئ 448/45; 7-أمينوكتينومايسين د (7-AAD) 700/54، GFP 527/32. يتم فرز الخلايا عند 4 درجات مئوية وتبقى على الجليد بعد الفرز. قبل تشغيل هذه الأداة ، تأكد من تدريب المستخدم بشكل صحيح من قبل أخصائي تطبيقات تقنية.
- قم بإعداد فارز الخلايا والتحقق من أدائه وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- إعداد استراتيجية بوابات هرمية لتحديد FAPs و MuSCs (الشكل 2).
- عزل FAPs استنادا إلى المخطط التالي: i) منطقة تشتت الخلايا الأمامية مقابل منطقة تشتت الخلايا الجانبية (FSC-A مقابل SSC-A) لفصل الخلايا مقابل الحطام ، ii) ارتفاع تشتت الخلايا الجانبية مقابل عرض تشتت الخلايا الجانبية (SSC-H مقابل SSC-W) لتمييز المفردات من الثنائيات في نطاق SSC ، iii) ارتفاع تشتت الخلية الأمامية مقابل عرض تشتت الخلايا الأمامية (FSC-H مقابل FSC-W) لتمييز المفردات من الثنائيات في نطاق FSC ، و iv) منطقة 7-AAD مقابل SSC-A للتمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة.
- في حالة عزل FAPs من خلال الطريقة القائمة على الأجسام المضادة ، استخدم المخطط التالي: v) منطقة APC-CD45 / CD31 مقابل منطقة المحيط الهادئ Blue-Ly-6A / E (Sca1) لاستبعاد خلايا CD31 + و CD45 + من مزيد من التحليل ، و vi) منطقة PE-Cy7-VCAM-1 مقابل منطقة PE-α7-Integrin من سكان CD31-/CD45-/Sca1+ لتمييز FAPs. يتم تحديد FAPs على أنها أحداث CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin.
- في حالة عزل FAPs من خلال طريقة مراسل GFP الذاتية المنشأ ، استخدم المخطط التالي: v) منطقة APC-CD45 / CD31 مقابل منطقة GFP-PDGFRα لاستبعاد خلايا CD31 + و CD45 + من مزيد من التحليل وعزل خلايا GFP +. يتم تحديد FAPs على أنها أحداث CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin.
- عزل MuSCs استنادا إلى المخطط التالي: i) منطقة تشتت الخلايا الأمامية مقابل منطقة تشتت الخلايا الجانبية (FSC-A مقابل SSC-A) لفصل الخلايا مقابل الحطام ، ii) ارتفاع تشتت الخلايا الجانبية مقابل عرض تشتت الخلايا الجانبية (SSC-H مقابل SSC-W) لتمييز المفردات من الثنائيات في نطاق SSC ، iii) ارتفاع تشتت الخلية الأمامية مقابل عرض تشتت الخلية الأمامي (FSC-H مقابل FSC-W) لتمييز المفردات من الثنائيات في نطاق FSC ، iv) منطقة 7-AAD مقابل SSC-A للتمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة ، v) منطقة APC-CD45 / CD31 مقابل منطقة المحيط الهادئ Blue-Ly-6A / E (Sca1) لاستبعاد خلايا CD31 + و CD45 + من مزيد من التحليل ، و vi) منطقة PE-Cy7-VCAM-1 مقابل منطقة PE-α7-Integrin من سكان CD31-/CD45-/Sca1- لتمييز MuSCs. يتم تحديد MuSCs على أنها أحداث CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
- عزل FAPs استنادا إلى المخطط التالي: i) منطقة تشتت الخلايا الأمامية مقابل منطقة تشتت الخلايا الجانبية (FSC-A مقابل SSC-A) لفصل الخلايا مقابل الحطام ، ii) ارتفاع تشتت الخلايا الجانبية مقابل عرض تشتت الخلايا الجانبية (SSC-H مقابل SSC-W) لتمييز المفردات من الثنائيات في نطاق SSC ، iii) ارتفاع تشتت الخلية الأمامية مقابل عرض تشتت الخلايا الأمامية (FSC-H مقابل FSC-W) لتمييز المفردات من الثنائيات في نطاق FSC ، و iv) منطقة 7-AAD مقابل SSC-A للتمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة.
- قم بتشغيل التحكم غير الملطخ والتحكم في الجدوى لضمان وضع مجموعة الخلايا بشكل صحيح في مؤامرة SSC-A مقابل FSC-A وبوابة بشكل صحيح على الخلايا الفردية الحية.
- احصل على جميع عناصر التحكم ذات اللون الواحد وقم بإنشاء مصفوفة تعويض غير مباشرة.
- قم بتشغيل جميع عناصر تحكم FMO وتحديد نقطة الانقطاع بين انتشار التألق في الخلفية والسكان الملطخين بشكل إيجابي.
- قبل حوالي 5-10 دقائق من الحصول على العينة التجريبية ، أضف صبغة قابلة للحياة 7-AAD واخلطها بلطف.
- بمجرد معالجة جميع عناصر التحكم ، قم بتعيين بوابات الفرز وفقا لعناصر تحكم FMO ؛ الحصول على العينات التجريبية وفرزها.
- بعد معالجة جميع العينات ، قم بتنظيف مقياس الخلايا وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. تصدير كافة بيانات .fcs للتحليل.
7. ثقافة FAPs و MuSCs
ملاحظة: يجب زراعة الخلايا التي تم فرزها مباشرة بعد الفرز ، في وسط مناسب على ألواح الكولاجين I المطلية.
- الطرد المركزي لأنابيب التجميع في دوار بزاوية ثابتة عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- شفط supernatant دون إزعاج بيليه الخلية.
- بالنسبة لزراعة MuSC ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط زراعة MuSC واحتضنها في الظروف القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- لوحة MuSCs المعزولة حديثا بكثافة 20000 خلية / سم 2 وتنشيط MuSCs بكثافة 15000 خلية / سم2.
- بعد الطلاء ، تظهر الخلايا صغيرة وكروية وشفافة. في غضون 36 ساعة ، تلتصق MuSCs بسطح اللوحة وتزيد ببطء من حجمها لأول 48 ساعة.
- استبدال المتوسطة كل 2 أيام.
ملاحظة: MuSCs حساسة جدا لكثافة الخلايا. للحفاظ على MuSCs في حالتها المنتشرة ، قم بتنميتها حتى تصبح 60٪ -70٪ ملتقية. تمرير الخلايا إلى أطباق أو أطباق جديدة من الكولاجين المغلفة وإضافة وسط طازج جديد كل 2 أيام. إذا تم الاحتفاظ ب MuSCs في نفس الطبق أو الطبق لفترة أطول من 3-4 أيام ، فسوف يكتسب شكلا ممدودا وسيتماشى مع الخلايا المجاورة حتى يندمج معا.
- بالنسبة لثقافة FAP ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط زراعة MuSC واحتضنها في الظروف القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- لوحة FAPs المعزولة من العضلات غير المضطربة بكثافة 15000 خلية / سم 2 و FAPs المعزولة من العضلات المصابة عند 9000 خلية / سم2.
ملاحظة: بعد الطلاء ، تلتصق FAPs تماما بسطح اللوحة في غضون 48 ساعة ، بينما تعلق FAPs المنشطة على اللوحة في غضون ساعات قليلة. بمجرد إرفاقها ، تكتسب FAPs شكلها المميز ، مع جسم خلية صغير وعمليات خلية ممدودة ، وتتكاثر بسرعة. - استبدال المتوسطة كل 2 أيام.
ملاحظة: FAPs حساسة جدا لكثافة الخلايا. يمكن أن يؤدي بذر FAPs بكثافات منخفضة إلى ضعف نمو الخلايا وموت الخلايا. على العكس من ذلك ، فإن طلاء FAPs بكثافة بذر عالية سيعزز بقاء الخلايا على قيد الحياة ويحسن توسعها. عادة ما تتطلب FAPs المستمدة من العضلات التالفة كثافة خلايا أقل من العضلات غير التالفة ، حيث يتم تنشيطها بالفعل. يوصى بضبط كثافة طلاء FAP بناء على الظروف التجريبية للشخص ومصدر العينات.
- لوحة FAPs المعزولة من العضلات غير المضطربة بكثافة 15000 خلية / سم 2 و FAPs المعزولة من العضلات المصابة عند 9000 خلية / سم2.
- بالنسبة للزراعة المشتركة ، أعد تعليق FAPs و MuSCs في وسط الزراعة المشتركة بنسبة 1: 1 واحتضن تلك الموجودة في الظروف القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة 48 ساعة واستبدل الوسط كل 2 أيام.
8. تحليل التألق المناعي ل FAPs المستزرعة و MuSCs
- استنشاق وسط الخلية وقم بإجراء غسلتين أو ثلاث غسلات باستخدام 1x PBS.
- إصلاح الخلايا مع 2٪ بارافورمالديهايد (PFA) في 1x PBS لمدة 15 دقيقة في RT.
- استنشاق 2٪ PFA وغسل الخلايا بسرعة مرتين أو ثلاث مرات مع 1x PBS.
- أداء نفاذية الخلية وحظرها:
- للتلطيخ المناعي ل FAPs المعزولة حديثا ، قم بإجراء نفاذية الخلايا وحظرها عن طريق احتضان الخلايا باستخدام 1x PBS + 0.1٪ Triton X-100 (PBST) + 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) + 5٪ مصل الحمار العادي (NDS) لمدة 30 دقيقة في RT.
- للتلطيخ المناعي ل MuSCs المعزولة حديثا ، قم بإجراء نفاذية الخلايا وحظرها عن طريق احتضان الخلايا باستخدام PBST + 1٪ BSA + 5٪ مصل الماعز الطبيعي (NGS) لمدة 30 دقيقة في RT.
- تطبيق الأجسام المضادة الأولية:
- للتلطيخ المناعي ل FAPs المعزولة حديثا ، ضع الجسم المضاد الأولي PDGFRα المضاد للماعز (1:300) المخفف في PBST + 1٪ BSA + 5٪ NDS بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- للتلطيخ المناعي ل MuSCs المعزولة حديثا ، ضع الجسم المضاد الأولي للماوس Pax7 (1:10) المخفف في PBST + 1٪ BSA + 5٪ NGS لمدة 45 دقيقة في RT.
- اغسل الخلايا مرتين أو ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي.
- تطبيق الأجسام المضادة الثانوية:
- للتلطيخ المناعي ل FAPs المعزولة حديثا ، ضع الجسم المضاد للحمار المضاد للماعز IgG (H + L) Alexa Fluor 488 (1:500) المخفف في PBST + 1٪ BSA لمدة ساعة واحدة في RT.
- للتلطيخ المناعي ل MuSCs المعزولة حديثا ، ضع الماعز المضاد للماوس IgG 1 Alexa Fluor 555 الجسم المضاد الثانوي (1:500) المخفف في PBST +1 ٪ BSA لمدة 45 دقيقة في RT.
- اغسل الخلايا مرتين أو ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي.
- قم بإجراء تلطيخ نووي مضاد عن طريق احتضان الخلايا باستخدام DAPI في PBST (1:1000) لمدة 5 دقائق في RT.
- اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لإزالة محلول DAPI.
تحذير: DAPI سامة وخطرة. التعامل معها بعناية والتخلص منها في زجاجة النفايات الخطرة. - تخزين الخلايا في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح هذا البروتوكول بعزل ما يقرب من مليون FAPs وما يصل إلى 350,000 MuSCs من الأطراف الخلفية غير المصابة للفئران البالغة من النوع البري (3-6 أشهر) ، أي ما يعادل عائدا قدره 8٪ ل FAPs و 3٪ ل MuSCs من إجمالي الأحداث. عند فرز الخلايا من TA التالفة بعد 7 أيام من الإصابة ، يتم تجميع اثنين إلى ثلاثة عضلات TA للحصول على ما يصل إلى 300000 FAPs و 120000 MuSCs ، والتي تتوافق مع عائد 11٪ و 4٪ على التوالي. عادة ما تكون قيم نقاء ما بعد الفرز أعلى من 95٪ ل FAPs و MuSCs.
ويوضح الشكل 2 استراتيجية البوابات المعتمدة لعزل FAPs و MuSCs. أولا ، يتم تحديد مجموعات الخلايا ذات الأهمية عن طريق إنشاء مخطط كثافة مبعثر أمامي (FSC) مقابل مخطط كثافة مبعثر جانبي (SSC) ، مما يسمح بدرجة معينة من تحديد الهوية الخلوية بناء على الخصائص المورفولوجية للخلية. تستخدم استراتيجية البوابات هذه أيضا لاستبعاد الحطام الخلوي الصغير ، والذي يقع عادة في الزاوية اليسرى السفلى من مؤامرة FSC مقابل SSC. يتم وضع المزيد من البوابات لاستبعاد الثنائيات بناء على إشارات الارتفاع والعرض FSC و SSC ، ثم يتم تلطيخ الخلايا المفردة الناتجة ب 7-AAD لتقييم جدواها. يتم تقييم الخلايا الحية بشكل أكبر لتعبير Sca1 و CD31 / CD45 لاستبعاد الخلايا الإيجابية للسلالة من مزيد من التحليل. ثم يتم تلطيخ المفردات السلبية Sca1 السلبية للنسب ل VCAM-1 و α7-Integrin للتمييز بين FAPs و MuSCs. يتم تحديد FAPs على أنها خلايا CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- ويتم تحديد MuSCs على أنها خلايا CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. بدلا من ذلك ، يتم أيضا بوابات الخلايا الحية ل CD31 / CD45 و GFP-PDGFRα لتمييز FAPs. يتم تحديد FAPs على أنها خلايا CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin.
يقدم هذا البروتوكول استراتيجيتين للبوابات لعزل سكان FAP: إما باستخدام مراسل PDGFRα-EGFP داخلي المنشأ أو عن طريق إجراء تلطيخ الخلايا بجسم مضاد Sca1. تعبر الفئران المراسلة المزعجة PDGFRα-EGFP (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 عن جين الاندماج H2B-eGFP من موضع PDGFRα الداخلي المنشأ، مما يسمح بوضع علامات فعالة ومحددة على سلالة PDGFRα (الشكل 3A). كان خط الماوس هذا يستخدم سابقا لعزل Pdgfrα + FAPs وهو في الواقع مفيد جدا لعزل FAPs ، حيث يوفر مراسل GFP إشارة مرئية للغاية ومحددة19. بدلا من ذلك، يصف هذا البروتوكول طريقة عزل تستند إلى Sca1 لتحديد FAPs. يستخدم Sca1 (Ly-6A / E) بشكل شائع لتحديد وعزل FAPs في إعداد العضلات13،16،17. Sca1 هو عضو بروتين مرتبط ب 18-kDa glycosylphosphatidylinositol (GPI) من عائلة Ly-620. ومع ذلك ، إلى جانب التعبير عنه على سطح الخلية لخلايا العضلات السلفية الوسيطة ، لوحظ تعبير Sca1 أيضا في الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) وكذلك الكريات البيض الناضجة والخلايا التائية. في هذا البروتوكول ، أكدنا مدى ملاءمة Sca1 كعلامة FAPs من خلال إجراء دراسات تتبع النسب القائمة على FACS. على وجه التحديد ، تم استخدام الفئران PDGFRα-EGFP لعزل FAPs المعبرة عن Sca1 + / GFP بين مجموعات الخلايا أحادية النوى. وجدنا أن جميع الخلايا المعبرة عن GFP كانت إيجابية أيضا ل Sca1 وسالبة ل CD31 و CD45 و VCAM-1 و α7-Integrin (الشكل 4). وأكد هذا التحليل استخدام الأجسام المضادة Sca1 كعلامة على FAPs في كل من FAPs الهادئة والمنشطة ويوفر وسائل للاستخدام غير الواضح لأي من الاستراتيجيتين لعزل FAPs.
في هذا البروتوكول ، تم أيضا عزل FAPs و MuSCs من الفئران البالغة المصابة بالحقن العضلي من Notexin ، بعد 7 أيام من الإصابة (الشكل 5). بعد الإصابة ، تنشط MuSCs و FAPs وتتكاثر في الجسم الحي ، وتصل إلى ذروة الانتشار بين اليوم 3 و 4 2,3. وتنعكس هذه التغيرات في الانتشار من خلال زيادة في النسبة المئوية للخلايا الإيجابية Sca1/PDFGRα وكذلك VCAM-1/α7-Integrin. ويمثل الشكل 6 التحديد الكمي ل FAPs و MuSCs في TAs غير المصابين و 7 أيام بعد الإصابة. على الرغم من ملاحظة ذروة الانتشار بين اليومين 2 و 3 بعد الإصابة ، إلا أن المعدل المنخفض للخلايا المنتشرة لا يزال ملحوظا بعد 7 أيام من الإصابة. مع تنشيط MuSCs ، هناك زيادة ملحوظة في حجمها الخلوي21,22. لذلك ، أثناء عزل هذه الخلايا بواسطة FACS، من الأهمية بمكان ضبط معلمات FSC-A و SSC-A وتوسيع البوابة لتشمل تلك الخلايا في الوسط (الشكل 5A).
تم تأكيد نقاء مجموعات الخلايا المعزولة عن طريق التلطيخ المناعي ل GFP+ FAPs المستزرعة و MuSCs مع الأجسام المضادة Pax7. تم استزراع GFP+ FAPs المعزولة حديثا و MuSCs لمدة 48 ساعة بنسبة 1: 1 (الشكل 3B). لم تعبر GFP+ FAPs عن علامة Pax7 ، في حين تفاعلت MuSCs مع هذا الجسم المضاد. وبالتالي ، فإن استراتيجية بوابة Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- و Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ فعالة في عزل المجموعات النقية من FAPs و MuSCs ، على التوالي.
الشكل 1: نظرة عامة رسومية على عزل FAP و MuSC. نظرة عامة رسومية تظهر عزل FAP و MuSC عن عضلات الأطراف الخلفية. ينطبق البروتوكول أيضا على الخلايا المعزولة من عضلات TA. أولا ، يتم جمع العضلات وفرمها ميكانيكيا قبل الخضوع لعملية الهضم الأنزيمي. ثم تتم معالجة خليط العضلات من خلال إبرة 20 G وتصفيتها للحصول على تعليق للخلايا أحادية النواة. ثم يتم احتضان الخلايا بمزيج من الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروفور وتعمل في النهاية من خلال فارز الخلايا لعزل مجموعة نقية من FAPs و MuSCs. ثم تتم معالجة مجموعات الخلايا النقية للتطبيق النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لمحة تمثيلية عن FACSs ل FAPs الهادئة و MuSCs. (A-H) استراتيجية البوابات لعزل FAPs و MuSCs. (أ) أولا، تكون العينات مسورة لاستبعاد الحطام الخلوي والثنائيات (B,C) استنادا إلى خصائص SSC وFSC. (د) ثم يتم تلطيخ الخلايا المفردة الناتجة ب 7-AAD لتقييم قابليتها للحياة. (هاء) ثم يتم تقييم الخلايا المفردة السالبة 7-AAD ل APC-CD31/CD45 والمحيط الهادئ Blue-Sca1 لاستبعاد الخلايا الإيجابية للسلالة من التحليل الإضافي. (F,G) ثم يتم تلطيخ المفردات السلبية للنسب ل PE-Cy7-VCAM-1 و PE-α7-Integrin. (و) تعرف FAPs على أنها خلايا CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- و (G) MuSCs على أنها خلايا CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. (ح) عزل FAPs في الفئران PDGFRα-EGFP باستخدام مراسل GFP. (I-M) ملف تعريف FACS لعناصر التحكم في التألق ناقص واحد (FMO) لإثبات التعويض المناسب والبوابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحقق من صحة زراعة خلايا FAP و MuSC . (أ) كانت FAPs المعزولة حديثا التي تعبر عن GFP مطلية وملطخة بجسم مضاد PDGFRα. كانت النوى ملطخة ب DAPI. يتم عرض الصور المدمجة لتلطيخ GFP (أخضر) وPDGFRα (أحمر) وDAPI (أزرق). قضبان المقياس ، 25 ميكرومتر. (ب) تم استزراع FAPs المعزولة حديثا (الخضراء) و MuSCs لمدة 48 ساعة وملطخة ب Pax7 (أحمر). كانت النوى ملطخة ب DAPI. لا تعبر FAPs التي تعبر عن GFP عن Pax7 ، في حين أن MuSCs تعبر حصريا عن Pax7 وليست إيجابية ل GFP ، مما يؤكد نقاء كلا المجموعتين المصنفتين. قضبان المقياس ، 75 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الفئران PDGFRα-EGFP وتعبير Sca1 على وجه التحديد تسمية FAPs في الفئران البالغة. يتم عزل FAPs كخلايا GFP+/Sca1+. يتم تقييم الخلايا المفردة السالبة 7-AAD ل APC-CD31 / CD45 و GFP-PDGFRα لاستبعاد الخلايا الإيجابية للنسب والتمييز بين FAPs. يتم تلطيخ الخلايا السلبية / Sca1 الإيجابية للنسب ل PE-Cy7-VCAM-1 و PE-α7-Integrin لاستبعاد MuSCs. يتم تحديد FAPs على أنها خلايا CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-cells. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الملامح التمثيلية لنظام مراقبة الأصول الميدانية لبرامج FAPs المنشطة و MuSCs. (A-H) استراتيجية البوابات لعزل FAPs و MuSCs المنشطة. (أ) يتم وضع بوابات على العينات لاستبعاد الحطام الخلوي عن طريق إنشاء مخطط كثافة FSC-A مقابل SSC-A. لاحظ البوابة الموسعة لاستيعاب السكان المعنيين. (ب، ج) يتم وضع المزيد من البوابات لإزالة الثنائيات بناء على خصائص SSC و FSC. (د) ثم يتم تلطيخ الخلايا المفردة الناتجة ب 7-AAD لتقييم قابليتها للحياة. (هاء) ثم يتم تقييم الخلايا المفردة السالبة 7-AAD ل APC-CD31/CD45 والمحيط الهادئ Blue-Sca1 لاستبعاد الخلايا الإيجابية للسلالة من التحليل الإضافي. (F,G) ثم يتم تلطيخ المفردات السلبية للنسب ل PE-Cy7-VCAM-1 و PE-α7-integrin. (و) يتم تحديد FAPs على أنها خلايا CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin- و (G) MuSCs على أنها خلايا CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+. (ح) عزل FAPs في الفئران PDGFRα-EGFP باستخدام مراسل GFP. (I-M) ملف تعريف FACS لعناصر التحكم في التألق ناقص واحد (FMO) لإثبات التعويض المناسب والبوابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التحديد الكمي ل FAPs و MuSCs في TAs غير المضطربة والمصابة. القياس الكمي ل FAPs و MuSCs في عضلات TA غير المصابة وبعد 7 أيام من الإصابة. تم إجراء عد الخلايا عن طريق قسمة عدد الخلايا التي تم فرزها لكل ملغ من العضلات التي تم جمعها. ** P < 0.01 بين غير المصابين مقابل المصابين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 7-AAD (ميكروغرام/مل) |
CD31/CD45-APC (ميكروغرام/مل) |
Sca1-المحيط الهادئ الأزرق (ميكروغرام/مل) |
α 7-إنتيغرين-بي (ميكروغرام/مل) |
VCAM-1-البيوتين (ميكروغرام/مل) |
PE-Cy7 ستربتافيدين (ميكروغرام/مل) |
||
| تحكم غير ملطخ | |||||||
| عناصر تحكم أحادية اللون | |||||||
| 7-AAD (التحكم في الجدوى) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| سكا1 | 5 | ||||||
| α7-إنتغرين | 0.4 | ||||||
| في كام-1 | 5 | 2 | |||||
| ضوابط FMO | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| عينة تجريبية | |||||||
| وصمة عار كاملة | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
الجدول 1: مصفوفة تلطيخ الأجسام المضادة. قائمة تركيزات الأجسام المضادة المستخدمة لتلطيخ العينات التجريبية والضابطة. في حالة عزل FAPs بواسطة GFP ، يمكن حذف تلطيخ Sca1. بدلا من ذلك ، قم بتشغيل GFP عنصر تحكم واحد ملطخ و GFP FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن إنشاء بروتوكولات فعالة وقابلة للتكرار لتحديد وعزل مجموعات الخلايا الجذعية البالغة النقية هو الخطوة الأولى والأكثر أهمية نحو فهم وظيفتها. يمكن استخدام FAPs المعزولة و MuSCs لإجراء تحليل متعدد الخلايا في تجارب الزرع كعلاج محتمل للأمراض العضلية أو يمكن تعديلها وراثيا لنمذجة المرض في العلاج بالخلايا الجذعية.
يوفر البروتوكول الموصوف هنا إرشادات موحدة لتحديد وعزل وزراعة FAPs و MuSCs التي تم الحصول عليها من عضلات الأطراف الخلفية للفئران البالغة. تم عزل المجموعات النقية من FAPs و MuSCs باستخدام تقنية قائمة على FACS، وتم تقييم نقائها لاحقا بواسطة خلايا ملطخة بالمناعة مع علامات سطح خلية محددة ووسائل وراثية.
يتكون البروتوكول من ثلاثة أقسام رئيسية تؤثر بشكل كبير على إنتاجية FAPs و MuSCs: هضم العضلات الميكانيكية والأنزيمية ، وتوليد تعليق خلية أحادي النواة من خلال إبرة 20 G ، والعزل النهائي للخلايا المفردة من خلال FACS.
يعد إجراء فرم العضلات السليم ذا أهمية حاسمة لإطلاق الخلايا المفردة. يجب التركيز على هذه الخطوة ، حيث أن الوصول إلى الحجم الأمثل لقطع العضلات بعد الفرم يسمح للإنزيمات المستخدمة في الهضم بالعمل بشكل أفضل ويمنع انسداد الإبرة المستخدمة في الخطوة 4.1. من ناحية أخرى ، قد يؤدي الإفراط في فرم العضلات إلى ضعف إنتاجية الخلايا وانخفاض صلاحية الخلية ، حيث يتم إطلاق MuSCs بسرعة أثناء الهضم الأول ويمكن شفطها في الخطوة 3.7.2 أو 3.8.214. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كفاءة الإنزيمات المستخدمة لهضم إعداد العضلات تؤثر أيضا على جودة التفكك الإنزيمي ، حيث قد يكون هناك تباين بين الكثير من الإنزيمات المختلفة أو انخفاض في نشاط الإنزيمات مع مرور الوقت23. لذلك ، ينصح باختبار كل دفعة من الإنزيمات لتحسين توقيت الهضم والتركيز. علاوة على ذلك ، قد يتأثر التركيز ومقدار الوقت اللازم لهضم العضلات أيضا بالظروف المرضية التي تؤثر على تصلب العضلات. ستتطلب هذه الشروط الخاصة تحسينا فرديا.
يحدث الجيل الأخير من الخلايا أحادية النواة عن طريق تشغيل التعليق من خلال حقنة 10 مل بإبرة 20 جم. يجب توخي الحذر عند تنفيذ هذه الخطوة لتقليل عدد الفقاعات التي تشكلت لأن انفجارها يسبب تلفا إضافيا للخلايا24.
ثم يتم تلطيخ تعليق الخلية بكوكتيل الأجسام المضادة ويتم الحصول عليه باستخدام فارز الخلايا. يعد وضع البوابات المناسبة خطوة حاسمة أخرى. عند إجراء هذه التجارب ، يوصى بشدة بتشغيل عناصر التحكم ذات اللون الواحد المدرجة وعناصر التحكم FMO للتعويض بشكل صحيح عن امتداد الانبعاثات وحساب إشارة الخلفية بسبب انتشار الامتداد غير المباشر. هذا مهم بشكل خاص عند التعامل مع البروتينات الفلورية الساطعة مثل GFP والبقع غير المباشرة مثل مركب VCAM-1-biotin/Stretpavidin-PE-Cy7.
علاوة على ذلك ، قبل تنفيذ هذه التجربة لأول مرة ، من الممارسات الجيدة إجراء معايرة للأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن المجموعات السكانية ذات الاهتمام. يعد تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة خطوة حاسمة لضمان ألمع إشارة للسكان الإيجابيين وتجنب الزيادة في تلطيخ الخلفية.
بمجرد اكتمال الفرز ، من المهم إجراء تحليل ما بعد الفرز على الخلايا التي تم فرزها لتحديد نقائها وقابليتها للحياة. يتأثر العائد وقابلية بقاء الخلايا المفروزة بشكل كبير بمقدار الوقت اللازم لمعالجة العينة ويجب أن يؤخذ في الاعتبار عند التخطيط لمعالجة فئران متعددة. علاوة على ذلك ، فإن الحفاظ على الخلايا التي تم فرزها على الجليد في وسائط غنية بالمصل 2x يمكن أن يساعد في استعادة الخلايا وتحسين قابليتها للحياة.
في هذا البروتوكول ، تم عزل FAPs و MuSCs من العضلات الأمامية الظنبوبية للفئران غير المصابة وكذلك بعد 7 أيام من حقن Notexin. بعد إصابة حادة ، تم الإبلاغ عن مجموعات فرعية مختلفة من FAP و MuSC يتم التعبير عنها بشكل عابر في الأنسجة العضلية المجددة. أبلغت ماليكوفا وزملاؤها عن وجود مجموعة فرعية من VCAM-1 تعبر عن FAPs الغائبة في العضلات غير التالفة ، وبلغت ذروتها بين اليومين 2 و 3 بعد الإصابة في التهاب حاد ، واستمرت في الفئران الضمورالفئران 13. وبالمثل ، أبلغ كافادار وزملاؤه عن زيادة عابرة في التعبير عن Sca1 على مجموعة فرعية صغيرة من السلف العضلي المنشأ بعد يومين من الإصابة25. ومع ذلك ، تم تقليل الخلايا العضلية Sca1 + بشكل كبير بعد 3 أيام من الإصابة25. وينبغي الاعتراف بوجود هذه المجموعات السكانية الفرعية والنظر فيها عند استخدام هذا البروتوكول لعزل FAPs و MuSCs في مراحل مبكرة.
باختصار ، يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وثقافة مجموعة نقية من FAPs و MuSCs معزولة عن عضلات الفئران البالغة السليمة أو المصابة. النقاء العالي وقابلية البقاء للخلايا تجعل هذا البروتوكول مناسبا لمزيد من التطبيقات النهائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
نود أن نشكر توم تشيونغ (جامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا) على المشورة بشأن عزل MuSC. تم تمويل هذا العمل من قبل NIAMS-IRP من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AR041126 و AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
