Summary
Точная идентификация фибро-адипогенных клеток-предшественников (FAPs) и мышечных стволовых клеток (MuSC) имеет решающее значение для изучения их биологической функции в физиологических и патологических состояниях. Этот протокол содержит рекомендации по выделению, очистке и культивированию ФАПов и MUSC из мышц взрослых мышей.
Abstract
Фибро-адипогенные клетки-предшественники (ФАП) представляют собой популяцию скелетных мышечных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), способных дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии. Вместе с мышечными стволовыми клетками (MuSC) FAP играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации, активно поддерживая и реконструируя внеклеточный матрикс (ECM). При патологических состояниях, таких как хронические повреждения и мышечные дистрофии, ФАП подвергаются аберрантной активации и дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к фиброзу и внутримышечной жировой инфильтрации. Таким образом, ФАП играют двойную роль в регенерации мышц, либо поддерживая оборот MuSC и способствуя восстановлению тканей, либо способствуя образованию фиброзных рубцов и внематочных жировых инфильтратов, которые ставят под угрозу целостность и функцию скелетной мышечной ткани. Правильная очистка ФАПов и MuSC является необходимым условием для понимания биологической роли этих клеток как в физиологических, так и в патологических состояниях. Здесь мы описываем стандартизированный метод одновременного выделения FAP и MuSC из мышц конечностей взрослых мышей с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Протокол подробно описывает механическую и ферментативную диссоциацию мононуклеарных клеток из целых мышц конечностей и травмированных передних (ТА) мышц большеберцовой кости. FAP и MuSC впоследствии изолируются с помощью полуавтоматического клеточного сортировщика для получения чистых клеточных популяций. Дополнительно описан оптимизированный метод культивирования покоящихся и активированных ФАПов и MUSC, либо отдельно, либо в условиях кокультуры.
Introduction
Скелетная мышца является самой большой тканью в организме, на которую приходится ~ 40% веса взрослого человека, и отвечает за поддержание осанки, создание движения, регулирование базального энергетического обмена и температуры тела1. Скелетные мышцы являются очень динамичной тканью и обладают замечательной способностью адаптироваться к различным раздражителям, таким как механическое напряжение, метаболические изменения и ежедневные факторы окружающей среды. Кроме того, скелетная мышца регенерирует в ответ на острую травму, что приводит к полному восстановлению ее морфологии и функций2. Пластичность скелетных мышц в основном зависит от популяции резидентных мышечных стволовых клеток (MuSC), также называемых сателлитными клетками, которые расположены между плазматической мембраной миофибры и базальной пластинкой 2,3. В нормальных условиях MuSC находятся в мышечной нише в состоянии покоя, с несколькими делениями, чтобы компенсировать клеточный оборот и пополнить пул стволовых клеток4. В ответ на травму MuSC входят в клеточный цикл, размножаются и либо способствуют образованию новых мышечных волокон, либо возвращаются в нишу в процессе самообновления 2,3. В дополнение к MuSC, гомеостатическое поддержание и регенерация скелетных мышц полагаются на поддержку популяции мышечных резидентных клеток, называемых фибро-адипогенными предшественниками (FAPs)5,6,7. ФАП представляют собой мезенхимальные стромальные клетки, встроенные в мышечную соединительную ткань и способные дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии 5,8,9,10. FAP обеспечивают структурную поддержку MuSC, поскольку они являются источником белков внеклеточного матрикса в нише мышечных стволовых клеток. FAP также способствуют долгосрочному поддержанию скелетных мышц путем секреции цитокинов и факторов роста, которые обеспечивают трофическую поддержку миогенеза и роста мышц 6,11. При остром мышечном повреждении ФАП быстро размножаются, образуя переходную нишу, которая поддерживает структурную целостность регенерирующей мышцы и обеспечивает благоприятную среду для поддержания пролиферации и дифференцировки MUSC паракринным способом5. По мере продолжения регенерации ФАПы очищаются от регенеративной мышцы апоптозом, и их количество постепенно возвращается к базальному уровню12. Однако в условиях, благоприятствующих хроническому повреждению мышц, FAP перекрывают проапоптотическую сигнализацию и накапливаются в мышечной нише, где они дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к инфильтратам эктопического жира и образованию фиброзных рубцов12,13.
Из-за их мультипотентности и регенеративных способностей FAP и MuSC были идентифицированы как перспективные мишени в регенеративной медицине для лечения заболеваний скелетных мышц. Поэтому для исследования их функции и терапевтического потенциала важно установить эффективные и воспроизводимые протоколы для выделения и культивирования ФАПов и MUSC.
Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) может идентифицировать различные клеточные популяции на основе морфологических характеристик, таких как размер и гранулярность, и позволяет выделять специфические клетки на основе использования антител, направленных против маркеров клеточной поверхности. У взрослых мышей MuSC экспрессируют молекулу адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1, также известную как CD106)14,15 и α7-интегрин15, в то время как FAP экспрессируют рецептор фактора роста тромбоцитов α (PDGFRα) и антиген стволовых клеток 1 (Sca1 или Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . В описанном здесь протоколе MuSC были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, в то время как FAP были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Альтернативно, мыши PDGFRαEGFP использовали для выделения FAP как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Кроме того, мы сравнили перекрытие между флуоресцентным сигналом клеток PDGFRα-GFP+ с клетками, идентифицированными поверхностным маркером Sca1. Наш анализ показал, что все GFP-экспрессирующие клетки также были положительными для Sca1, что указывает на то, что любой подход может быть использован для идентификации и изоляции FAP. Наконец, окрашивание специфическими маркерными антителами подтвердило чистоту каждой клеточной популяции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все проведенные эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию (ACUC) Национального института артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний (NIAMS). Исследователи, выполняющие этот протокол, должны придерживаться своих местных руководящих принципов этики животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подробно описывает, как изолировать FAP и MuSC из задних конечностей и поврежденных передних мышц большеберцовой кости (TA) взрослых самцов и самок мышей (3-6 месяцев) и содержит рекомендации по кокультурированию FAP и MuSC. Обзор экспериментальной процедуры показан на рисунке 1. Все этапы этого протокола должны выполняться в стерильных условиях и при комнатной температуре (RT), если не указано иное.
1. Установка реагентов
- Моющая среда (WM): Приготовьте этот раствор, добавив 10% (об./об.) конскую сыворотку и 1x пенициллин/стрептомицин в клеточную среду F-10 Nutrient Mix Ham. WM можно приготовить заранее и хранить при температуре 4 °C.
- Буфер диссоциации мышц (MDB): Подготовьте этот буфер, растворив коллагеназу II в WM. При сборе целых мышц задних конечностей растворите 1000 Ед/мл коллагеназы II в 10 мл WM для каждой мыши (для подготовки в коническую трубку объемом 50 мл). При сборе та-мышц растворяют 800 ЕД/мл коллагеназы II в 7 мл WM для каждой мыши (для подготовки в коническую трубку объемом 15 мл). Для мышц ТА это поможет лучше визуализировать клеточные гранулы и получить более высокий выход ФАПов и MuSC. Подготовьте MDB свежим перед сбором мышц и держите его на льду до тех пор, пока это не понадобится.
- Запас раствора коллагеназы II: Приготовьте этот раствор, растворив коллагеназу II в стерильном 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) до конечной концентрации 1000 Ед/мл. Процедите раствор через шприцевой фильтр 0,45 мкм и аликвоту в запасы по 1 мл. Хранить раствор при температуре -20 °C.
- Запас раствора диспазы: приготовьте этот раствор, растворив Диспазу в стерильном 1x PBS до конечной концентрации 11 Ед/мл. Процедите раствор через шприцевой фильтр 0,45 мкм и аликвоту в запасы по 1 мл. Хранить раствор при температуре -20 °C.
- Приготовьте культуральную среду FAP, дополнив DMEM 10% (об./об.) фетальной бычьей сывороткой, 1x пенициллином/стрептомицином и 2,5 нг/мл FGF. Храните среду при температуре 4 °C.
- Приготовьте культуральную среду MuSC, дополняющую F10 с 10% (об/об)) конской сывороткой, 1x пенициллином/стрептомицином и 2,5 нг/мл FGF. Храните среду при температуре 4 °C.
- Приготовьте кокультурную среду, добавив DMEM с 10% (об./об.) фетальной бычьей сывороткой, 10% (об/об)) конской сывороткой, 1x пенициллином/стрептомицином и 2,5 нг/мл FGF. Храните среду при температуре 4 °C.
2. Сбор мышц задних конечностей
- Добавьте 2-3 мл WM в блюдо размером 6 см (по одному блюду на мышь) и положите на лед.
- Выполняют эвтаназию путем асфиксии: помещают мышь в камеруСО2 и вводят 100%СО2. Используйте вывих шейки матки для подтверждения смерти.
- Поместите мышь лежа на спине на подушечку для рассечения и распылите на нее 70% (об/об)этанола, чтобы избежать загрязнения.
- Используйте щипцы, чтобы зажать центр кожи живота мыши и вырезать отверстие ~ 1 см по горизонтали. Захватите края раны и стол в мыши, потянув отверстие в противоположных направлениях, чтобы раскрыть мышцы под ним. Обнажите одну сторону задней конечности мыши в то время.
- Перед сбором мышц удалите межмышечный жир между подколенными сухожилиями и проксимальным концом квадрицепсов. Это улучшит изоляцию FAP и MuSC.
- Не повреждая ткань, используйте острые щипцы, чтобы сломать и отклеить фасцию, чтобы обнажить нижнюю часть ТА и разгибать мышцы digitorum longus (EDL). Запустите острый кончик щипцов под мышцами TA / EDL, чтобы отделить мышцы от большеберцовой кости.
- Отрежьте сухожилия, прикрепляющие TA/EDL к лодыжке, и, удерживая его щипцами, обрежьте мышцы ножницами вдоль продольной линии TA/EDL. Обрежьте сухожилия вокруг колена, чтобы отделить все мышцы TA / EDL. Поместите мышцы в 6 см блюдо, хранящееся на льду.
- Приступайте к изоляции икроножных и камбаловидных мышц, разрезая все сухожилия на лодыжке и отделяя мышцы от большеберцовой и малоберцовой костей. Обрежьте вокруг колена и переведите мышцы на блюдо длиной 6 см.
- Очистите фасцию вокруг квадрицепсов и отделите ее от бедренной кости, проведя острым кончиком щипцов между мышцей и костью. Отрежьте сухожилия вокруг колена и, удерживая квадрицепсы щипцами на дистальном конце, обрежьте остальную часть мышцы, разрезав вдоль бедренной кости. Поместите мышцы в блюдо размером 6 см.
- Отсоедините подколенные сухожилия и оставшиеся мышцы вокруг бедренной кости и перенесите их на 6 см. Соберите мышцы задних конечностей в 6 см блюдо, хранящееся на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения кровеносных сосудов, когда это возможно, чтобы предотвратить образование сгустков крови, которые могут помешать изоляции вниз по течению. При возникновении кровотечения немедленно промокните иссеченный сосуд стерильной марлей, чтобы впитать кровь. - Соберите TA, EDL, икроножную мышцу, камбалу, квадрицепс и подколенное сухожилие из контралатеральной конечности.
ПРИМЕЧАНИЕ: При изоляции всех мышц задних конечностей не объединяйте двух или более мышей. При изоляции мышц ТА можно объединить до трех мышц ТА.
3. Механическое и ферментативное переваривание мышц
- Аспирируйте WM из тарелки 6 см и добавьте 1-2 мл MDB, чтобы сохранить мышцы влажными.
- Тщательно измельчите мышцы до получения суспензионной пасты из хорошо измельченной ткани. Для этого используйте щипцы, чтобы удерживать один конец куска мышцы, затем используйте скальпель, чтобы разорвать и разрезать мышцу до тех пор, пока она не станет менее напряженной.
- Используя ножницы, продолжайте разрезать мышцу на мелкие кусочки в течение 1-2 мин. Повторяйте этот шаг для каждой группы мышц до получения хорошо измельченного мышечного осадка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг для максимизации выхода FAP и MuSC. Рекомендуется потратить 8-10 мин (4-5 мин, если изолируют только мышцы ТА) на этом этапе, чтобы обеспечить правильное измельчение мышц. - Перенесите измельченные мышцы от каждой мыши к конической трубке, содержащей MDB.
- Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C с перемешиванием (75 об/мин) в течение 1 ч. Поместите трубы горизонтально вдоль траектории встряхивания и используйте грузы, чтобы держать трубы погруженными в воду.
- Разморозьте 1 мл коллагеназы II и 1 мл диспазы на мышь. Перед использованием раскрутите запас диспазы в качающемся роторе ковша при 10 000 х г в течение 1 мин при 4 °C. Используйте только супернатант.
- Если были собраны целые мышцы задних конечностей, действуйте следующим образом:
- Через 1 ч извлеките тюбик из шейкера и заполните его до 50 мл WM. Аккуратно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
- Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Переложите 42 мл супернатанта в две новые трубки (~ 21 мл в каждой пробирке) и оставьте ~ 8 мл в исходной трубке.
- Заполните новые трубки, содержащие 21 мл супернатанта до 50 мл, WM. Центрифугируйте ячейки снова в качающемся роторе ковша при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирируйте все супернатанты и держите гранулы на льду.
- Добавьте 1 мл коллагеназы II и 1 мл диспазы в оригинальную трубку, содержащую ~8 мл MDB.
- Используя серологическую пипетку объемом 5 мл, повторно суспендируйте гранулу 10 раз без засорения. Выталкивайте раствор к стенке трубки, избегая образования пузырьков. Если засорение происходит во время повторного суспензии, прижмите кончик пипетки к дну трубки, чтобы механически нарушить мышечные куски. Перейдите к шагу 3.9.
- Если та-мышцы были собраны, действуйте следующим образом:
- Через 1 ч извлеките трубку из шейкера и заполните их до 15 мл WM. Осторожно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
- Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Переложите 13 мл супернатанта в одну новую трубку объемом 15 мл и оставьте ~ 2 мл в исходной трубке.
- Заполните новую трубку, содержащую 13 мл супернатанта до 15 мл, WM. Центрифугируйте ячейки снова в качающемся роторе ковша при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирируйте все супернатанты и держите гранулу на льду.
- Используя наконечник пипетки объемом 1000 мкл, повторно суспендируйте гранулу в исходной трубке вверх и вниз без засорения.
- Добавьте 1 мл коллагеназы II и 1 мл запаса диспазы в оригинальную трубку, содержащую 2 мл MDB, и заполните до 10 мл WM. Перейдите к шагу 3.9.
- Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C с перемешиванием (75 об/мин) в течение 30 мин. Поместите трубки, как показано на шаге 3.5.
4. Генерация моноядерных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с мышцами ТА, собранными в конической трубке объемом 15 мл, переведите суспензию в коническую трубку объемом 50 мл, прежде чем переходить к этапу 4.1.
- Через 30 мин выньте тюбик из шейкера. Аспирировать и выталкивать мышечную суспензию через шприц объемом 10 мл с иглой 20 г успешно 10 раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выталкивайте мышечную суспензию к стенке трубки, чтобы избежать пузырьков и пенообразования. Небольшие кусочки непереваренных сухожилий или хрящей могут засорять иглу во время первых раундов аспирации. Если происходит засорение, используйте стерильные щипцы, чтобы удалить засор с кончика иглы. - Наполните каждый тюбик до 50 мл WM и осторожно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
- Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую трубку (~42 мл) и оставьте ~8 мл в исходной пробирке.
- Заполните новую трубку, содержащую 42 мл супернатанта до 50 мл, WM. Центрифугируйте ячейки снова в качающемся роторе ковша при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирируйте все супернатанты и держите гранулу на льду.
- Поместите нейлоновый клеточный сетчик размером 40 мкм в исходную коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 8 мл WM, и предварительно смочите клеточный сетчатый фильтр 1-2 мл WM.
- Удерживая 40-мкм нейлоновый клеточный сетчатый фильтр, используйте пипетку объемом 10 мл, чтобы аккуратно повторно суспендировать гранулу 5-10 раз. Отфильтруйте гранулы через клеточный сетчатый фильтр обратно в ту же трубку, чтобы свести к минимуму потери клеток.
- На этом этапе убедитесь, что на льду есть дополнительные трубки с гранулами клеток. Отфильтруйте эти гранулы обратно в исходную трубку, добавив 4-5 мл WM в каждую трубку, чтобы повторно суспендировать гранулы и перенести раствор в клеточный сетчатый фильтр, расположенный в исходной трубке. Допускается фильтрация под действием силы тяжести.
- После сбора всех гранул в оригинальную коническую трубку объемом 50 мл промыть клеточный ситечко еще 4-5 мл WM. Используйте пипетку объемом 1000 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка.
- Наполните каждый тюбик WM до 50 мл и осторожно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
- Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Немедленно аспирировать весь супернатант после центрифугирования, не нарушая гранулу.
- Повторно суспендировать гранулу в 600 мкл WM и перенести ее в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл.
5. Окрашивание антител для проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента настройте следующие средства контроля: i) неиспорченный контроль, ii) контроль жизнеспособности для выбора популяции живых клеток, iii) контроль компенсации с одним окрашиванием для коррекции вторичных эффектов выбросов фторхрома и iv) контроль флуоресценции минус один (FMO) для установления границ затвора путем учета распространения вторичных эффектов. Полный список элементов управления окрашиванием приведен в таблице 1 .
- Для приготовления незапятнанного контроля переведите 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую 190 мкл WM. Повторно суспендируйте клеточную суспензию и фильтруйте через 5 мл полистирольной трубки с круглым дном с 35-мкм крышкой клеточного сетчатого фильтра. Позвольте суспензии фильтроваться под действием силы тяжести.
- Используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка. Запечатайте шляпкой и оставьте на льду, защищенном от света.
- Подготовьте жизнеспособность, FMO и одноокрашенные элементы управления: пометьте 10 2 мл микроцентрифужных пробирок и добавьте 190 мкл WM в каждую трубку и 10 мкл клеточной суспензии. Полный список элементов управления приведен в таблице 1 . Добавляют антитела в соответствующую трубку в зависимости от экспериментального контроля. Обратитесь к Таблице 1 для получения информации о комбинации и концентрации антител.
- Переместите остальную часть клеточной суспензии (500 мкл) в микроцентрифужную трубку (экспериментальную трубку) объемом 2 мл и добавьте следующие антитела: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-биотин и α7-Integrin-PE. Обратитесь к Таблице 1 для получения информации о комбинации и концентрации антител.
- Аккуратно хорошо перемешайте каждую трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при 4 °C в течение 45 мин, защищенных от света.
- Через 45 мин заполните все микроцентрифужные трубки до 2 мл WM. Аккуратно переверните трубки пару раз, чтобы обеспечить полное перемешивание. Центрифугирование трубок в охлажденной центрифуге с неподвижным углом вращения при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу.
- Повторное суспендирование клеток во всех микроцентрифужных трубках в 300 мкл WM.
- Добавьте антитело к стрептавидину в соответствующие пробирки. Обратитесь к Таблице 1 для получения информации о комбинации и концентрации антител. Аккуратно перемешайте каждую трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при 4 °C в течение 20 мин, защищенных от света. Оставьте оставшиеся трубки на льду, защищенные от света.
- Через 20 мин заполните микроцентрифужные пробирки, содержащие антитело стрептавидина до 2 мл, WM. Осторожно переверните трубки несколько раз, чтобы обеспечить полное перемешивание. Центрифугирование трубок в охлажденной центрифуге с неподвижным углом вращения при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатант полностью и повторно суспендировать клетки в 300 мкл WM.
- Предварительно смочите крышку сетчатого фильтра 35 мкм из 10 5 мл полистирольных трубок круглого дна с 200 мкл WM. Фильтрующие ячейки из контрольных трубок через соответствующие 5 мл полистирольных трубок с круглым дном. Используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка. Запечатайте колпачками, оставьте трубки на льду и защитите их от света.
- Повторно суспендируйте ячейки в экспериментальной трубке дополнительными 200 мкл WM в общей сложности 500 мкл WM. Предварительно смочите крышку клеточного сетчатого фильтра из 5 мл полистирольной трубки круглого дна с 200 мкл WM. Перенесите клеточную суспензию из экспериментальной трубки в 5 мл полистирольной трубки круглого дна и позвольте ей фильтровать под действием силы тяжести.
- Промыть микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую экспериментальный образец суспензии с 300 мкл WM, и пропустить ее через тот же колпачок сетчатого фильтра. Используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка. Запечатайте колпачком, оставьте трубки на льду и защитите их от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит засорение крышки клеточного сетчатого фильтра размером 35 мкм, осторожно постучите по трубке на стенде, чтобы облегчить прохождение. - Подготовьте и маркируйте коллекторные трубки для FAP и MuSC. При выделении клеток из целых мышц задних конечностей сортируют клетки в полипропиленовых трубках круглого дна объемом до 1 мл либо ФАПов, либо питательной среды MuSC, дополненной сывороткой 2x. При выделении клеток из та-мышц сортируют ФАП и MuSC в микроцентрифужных пробирках по 2 мл, содержащих до 400 мкл питательной среды, дополненной 2x сывороткой.
6. Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется компактный настольный исследовательский проточный цитометр, оснащенный соплом 100 мкм и имеющий трехлучевую конфигурацию (488 нм, 640 нм, 405 нм) с возможностью анализа до девяти различных фторхромов (11 параметров, включая прямой и боковой рассеяние). Фторхромы, используемые в этом протоколе, и связанные с ними полосовые фильтры детектора следующие: PE 586/42; ПЭ-Cy7 783/56; БТР 660/10; Тихоокеанский синий 448/45; 7-Аминоактиномицин D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Ячейки сортируются при 4 °C и остаются на льду после сортировки. Перед эксплуатацией этого прибора убедитесь, что пользователь должным образом обучен специалистом по техническим приложениям.
- Настройка и проверка производительности сортировщика ячеек в соответствии со спецификациями производителя.
- Настройте иерархическую стратегию измерения для идентификации FAP и MuSC (рисунок 2).
- Изолируйте FAP на основе следующей схемы: i) область рассеяния прямых ячеек против области рассеяния боковых ячеек (FSC-A против SSC-A) для разделения ячеек против мусора, ii) высота рассеяния боковых ячеек против ширины рассеяния боковых ячеек (SSC-H против SSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне SSC, iii) высота рассеяния прямой ячейки против ширины рассеяния прямой ячейки (FSC-H против FSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне FSC, и iv) область 7-AAD и SSC-A для различения живых и мертвых клеток.
- При выделении ФАП методом на основе антител используйте следующую схему: v) область APC-CD45/CD31 против тихоокеанской области Blue-Ly-6A/E (Sca1) для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа и vi) область PE-Cy7-VCAM-1 против области PE-α7-Integrin из популяции CD31-/CD45-/Sca1+ для различения FAPs. FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-события.
- При выделении ФАП эндогенным методом репортера GFP используют следующую схему: v) область APC-CD45/CD31 против области GFP-PDGFRα для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа и выделения клеток GFP+. FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Интегрин-события.
- Изолируйте MuSC на основе следующей схемы: i) область рассеяния прямых ячеек против области рассеяния боковых ячеек (FSC-A против SSC-A) для разделения ячеек против мусора, ii) высота рассеяния боковых ячеек против ширины рассеяния боковых ячеек (SSC-H против SSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне SSC, iii) высота рассеяния прямой ячейки против ширины рассеяния прямых ячеек (FSC-H против FSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне FSC, iv) область 7-AAD против SSC-A для различения живых и мертвых клеток, v) область APC-CD45/CD31 против тихоокеанской области Blue-Ly-6A/E (Sca1) для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа и vi) область PE-Cy7-VCAM-1 против области PE-α7-Integrin из популяции CD31-/CD45-/Sca1- для различения MuSC. MuSC идентифицируются как события CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
- Изолируйте FAP на основе следующей схемы: i) область рассеяния прямых ячеек против области рассеяния боковых ячеек (FSC-A против SSC-A) для разделения ячеек против мусора, ii) высота рассеяния боковых ячеек против ширины рассеяния боковых ячеек (SSC-H против SSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне SSC, iii) высота рассеяния прямой ячейки против ширины рассеяния прямой ячейки (FSC-H против FSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне FSC, и iv) область 7-AAD и SSC-A для различения живых и мертвых клеток.
- Запустите незапятнанный контроль и контроль жизнеспособности, чтобы убедиться, что клеточная популяция правильно расположена на графике SSC-A против FSC-A и правильно включить живые одиночные клетки.
- Приобретите все элементы управления с одним окрашиванием и создайте матрицу компенсации побочных эффектов.
- Запустите все элементы управления FMO и определите точку отсечения между распространением фоновой флуоресценции и положительно окрашенной популяцией.
- Примерно за 5-10 мин до получения экспериментального образца добавляют краситель жизнеспособности 7-AAD и аккуратно перемешивают.
- После того, как все элементы управления будут обработаны, установите ворота сортировки в соответствии с элементами управления FMO; приобретать и сортировать экспериментальные образцы.
- После того, как все образцы были обработаны, очистите цитометр в соответствии со спецификацией производителя. Экспортируйте все данные .fcs для анализа.
7. Культура ФАПов и МУК
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсортированные клетки следует культивировать сразу после сортировки, в соответствующей среде на коллагеновых пластинах, покрытых I.
- Центрифугируйте коллекторные трубки в роторе с фиксированным углом наклона при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Аспирировать супернатант, не нарушая клеточную гранулу.
- Для культуры MuSC повторно суспендируют клетки в соответствующем объеме питательной среды MuSC и инкубируют их в стандартных условиях при 37 °C и 5% CO2.
- Пластинчатые свежеизолированные MuSC при плотности 20 000 клеток/см2 и активированные MuSC при плотности 15 000 клеток/см2.
- После покрытия клетки кажутся маленькими, сферическими и полупрозрачными. В течение 36 ч MuSC прилипают к поверхности пластины и медленно увеличивают свой размер в течение первых 48 ч.
- Заменяйте среду каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: MuSC очень чувствительны к плотности клеток. Чтобы сохранить MuSC в их распространяющемся состоянии, выращивайте их до тех пор, пока они не станут сливающимися на 60-70%. Передавая клетки в новый коллаген, я покрываю посудой или тарелками и добавляю новую свежую среду каждые 2 дня. Если MuSC хранить в одной тарелке или тарелке дольше 3-4 дней, они приобретут вытянутую форму и выровняются с соседними клетками до слияния.
- Для культуры FAP повторно суспендируют клетки в соответствующем объеме питательной среды MuSC и инкубируют их в стандартных условиях при 37 °C и 5% CO2.
- Пластинчатые FAP, выделенные из невозмущенных мышц при плотности 15 000 клеток /см2 , и FAP, выделенные из поврежденной мышцы при 9000 клеток /см2.
ПРИМЕЧАНИЕ: После нанесения покрытия FAP полностью прилипают к поверхности пластины в течение 48 ч, в то время как активированные FAP прикрепляются к пластине в течение нескольких часов. Как только они прикрепляются, ФАПы приобретают свою характерную форму, с маленьким клеточным телом и удлиненными клеточными отростками, и они быстро размножаются. - Заменяйте среду каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: FAP очень чувствительны к плотности клеток. Посев FAP при низкой плотности может привести к плохому росту клеток и гибели клеток. Напротив, покрытие FAP при высокой плотности посева повысит выживаемость клеток и улучшит их расширение. FAP, полученные из поврежденной мышцы, обычно требуют более низкой плотности клеток, чем неповрежденные мышцы, поскольку они уже активированы. Рекомендуется регулировать плотность покрытия FAP в зависимости от экспериментальных условий и источника образцов.
- Пластинчатые FAP, выделенные из невозмущенных мышц при плотности 15 000 клеток /см2 , и FAP, выделенные из поврежденной мышцы при 9000 клеток /см2.
- Для кокультуры повторно суспендировать FAP и MuSC в среде кокультуры в соотношении 1:1 и инкубировать их в стандартных условиях при 37 °C и 5% CO2. Дайте клеткам прикрепиться в течение 48 часов и заменяйте среду каждые 2 дня.
8. Иммунофлуоресцентный анализ культивируемых ФАПов и MUSC
- Аспирируйте клеточную среду и выполните две или три промывки с 1x PBS.
- Зафиксируйте клетки 2% параформальдегидом (PFA) в 1x PBS в течение 15 мин при RT.
- Аспирировать 2% PFA и быстро промыть клетки два или три раза с 1x PBS.
- Выполните пермеабилизацию и блокировку клеток:
- Для иммуноокрашения свежеизолированных ФАП выполняют пермеабилизацию и блокирование клеток путем инкубации клеток с помощью 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 5% Normal Donkey Serum (NDS) в течение 30 мин при RT.
- Для иммуноокрашения свежеизолированных MuSC выполняют пермеабилизацию и блокирование клеток путем инкубации клеток с PBST + 1% BSA + 5% Normal Goat Serum (NGS) в течение 30 мин при RT.
- Применяют первичные антитела:
- Для иммуноокрашения свежеизолированных ФАП применяют первичные антитела против ФДГФРΑ коз (1:300), разведенные в ПБСТ + 1% БСА + 5% НБД на ночь при 4 °C.
- Для иммуноокрашения свежеизолированных MuSC применяют мышиное анти-Pax7 первичное антитело (1:10), разведенное в PBST + 1% BSA + 5% NGS в течение 45 мин при RT.
- Промыть клетки два или три раза 1x PBS, чтобы удалить раствор первичного антитела.
- Применяют вторичные антитела:
- Для иммуноокраширования свежеизолированных ФАП применяют ослиное против козьего IgG (H+L) Alexa Fluor 488 вторичное антитело (1:500), разведенное в ПБСТ + 1% БСА в течение 1 ч при РТ.
- Для иммуноокрашения свежеизолированных MuSC применяют козье противомышечное вторичное антитело IgG1 Alexa Fluor 555 (1:500), разведенное в PBST + 1% BSA в течение 45 мин при RT.
- Промыть клетки два или три раза 1x PBS, чтобы удалить раствор первичного антитела.
- Выполняют ядерное контрокрасление путем инкубации клеток с DAPI в PBST (1:1000) в течение 5 мин при RT.
- Промыть ячейки три раза 1x PBS, чтобы удалить раствор DAPI.
ВНИМАНИЕ: DAPI токсичен и опасен; обращаться с ним осторожно и утилизировать в бутылку с опасными отходами. - Храните ячейки при температуре 4 °C защищенными от света.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол позволяет выделить около одного миллиона FAP и до 350 000 MuSC из неповрежденных задних конечностей взрослых мышей дикого типа (3-6 месяцев), что соответствует выходу 8% для FAP и 3% для MuSC от общего числа событий. При сортировке клеток из поврежденных ТА через 7 дней после травмы две-три мышцы ТА объединяются для получения до 300 000 FAP и 120 000 MuSC, что соответствует выходу 11% и 4% соответственно. Значения чистоты после сортировки обычно превышают 95% для FAP и MuSC.
Стратегия определения размеров, принятая для изоляции ФАП и MUSC, проиллюстрирована на рисунке 2. Во-первых, интересующие клеточные популяции идентифицируются путем создания графика плотности прямого рассеяния (FSC) против бокового рассеяния (SSC), что позволяет обеспечить некоторую степень клеточной идентификации на основе морфологических свойств клеток. Эта стратегия захвата также используется для исключения мелкого клеточного мусора, который обычно расположен в левом нижнем углу графика FSC против SSC. Ячейки дополнительно закрываются для исключения дублетов на основе сигналов высоты и ширины FSC и SSC, и полученные синглетные ячейки затем окрашиваются 7-AAD для оценки их жизнеспособности. Живые клетки дополнительно оцениваются на экспрессию Sca1 и CD31 / CD45, чтобы исключить положительные клетки Lineage из дальнейшего анализа. Отрицательные синглеты Sca1 линии затем окрашиваются для VCAM-1 и α7-Интегрина, чтобы различать FAP и MuSC. FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-клетки, а MuSC идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ клетки. В качестве альтернативы, живые клетки также закрыты для CD31 / CD45 и GFP-PDGFRα для различения FAP. FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Интегрин-клетки.
Этот протокол представляет две стратегии для изоляции популяции FAP: либо с помощью эндогенного репортера PDGFRα-EGFP, либо путем выполнения окрашивания клеток антителом Sca1. Мыши-репортеры PDGFRα-EGFP (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 экспрессируют ген слияния H2B-eGFP из эндогенного локуса PDGFRα, что позволяет эффективно и специфично маркировать линию PDGFRα (рисунок 3A). Эта линия мыши ранее использовалась для изоляции Pdgfrα+ FAP и действительно очень полезна для изоляции FAP, так как репортер GFP обеспечивает хорошо видимый испецифический сигнал 19. Альтернативно, этот протокол описывает метод изоляции на основе Sca1 для идентификации FAP. Sca1 (Ly-6A/E) обычно используется для выявления и выделения ФАПов при подготовке мышц 13,16,17. Sca1 представляет собой 18-кДа гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-связанный белок из семейства Ly-620. Однако, помимо экспрессии на клеточной поверхности мезенхимальных мышечных клеток-предшественников, экспрессия Sca1 также наблюдается в гемопоэтических стволовых клетках (ГСК), а также в зрелых лейкоцитах и Т-клетках. В этом протоколе мы подтвердили пригодность Sca1 в качестве маркера FAP, выполнив исследования по отслеживанию родословной на основе FACS. В частности, мыши PDGFRα-EGFP были использованы для выделения Sca1 +/GFP-экспрессирующих FAP среди популяций мононуклеатных клеток. Мы обнаружили, что все GFP-экспрессирующие клетки также были положительными для Sca1 и отрицательными для CD31, CD45, VCAM-1 и α7-интегрина (рисунок 4). Этот анализ подтвердил использование антитела Sca1 в качестве маркера FAP как в покоящихся, так и в активированных FAP и предоставляет средства для нечеткого использования любой стратегии для выделения FAP.
В этом протоколе FAP и MuSC также были выделены у взрослых мышей, травмированных внутримышечными инъекциями Notexin через 7 дней после травмы (рисунок 5). После травмы MuSC и FAP активируются и размножаются in vivo, достигая пика пролиферации между 3 и 4днем 2,3. Эти изменения в пролиферации отражаются увеличением процента Sca1/PDFGRα, а также VCAM-1/α7-Интегрин-положительных клеток. На рисунке 6 показана количественная оценка ФАП и MUSC в неповрежденных и 7-дневных ТП после травмы; хотя пик пролиферации наблюдается между 2 и 3 днями после травмы, низкий уровень пролиферации клеток все еще заметен через 7 дней после травмы. По мере активации MuSC наблюдается заметное увеличение их клеточного размерана 21,22. Поэтому при изоляции этих ячеек с помощью FACS крайне важно настроить параметры FSC-A и SSC-A и расширить затвор, включив эти ячейки в центр (рисунок 5A).
Чистота изолированных клеточных популяций была подтверждена иммуноокрашиванием кокультурных GFP+ FAP и MuSC с антителами Pax7. Свежеизолированные GFP+ FAP и MuSC кокультурировали в течение 48 ч в соотношении 1:1 (рисунок 3B). GFP+ FAPs не экспрессировали маркер Pax7, в то время как MuSC реагировали с этим антителом. Таким образом, стратегия lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- и Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ эффективна в выделении чистых популяций FAP и MuSC соответственно.
Рисунок 1: Графический обзор изоляции FAP и MuSC. Графический обзор, показывающий изоляцию FAP и MuSC от мышц задних конечностей. Протокол также распространяется на клетки, выделенные из мышц ТА. Сначала мышцы собирают и механически измельчают перед прохождением ферментативного пищеварения. Затем мышечную смесь обрабатывают через иглу 20 Г и фильтруют для получения суспензии мононуклеированных клеток. Затем клетки инкубируются с коктейлем флуорофор-конъюгированных антител и в конечном итоге проходят через сортировщик клеток, чтобы изолировать чистую популяцию FAP и MuSC. Чистые клеточные популяции затем обрабатываются для последующего применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативный профиль FACS по покоящимся FAP и MUSC. (A-H) Стратегия Gating для изоляции FAP и MUSC. (A) Во-первых, образцы закрыты для исключения клеточного мусора и (B,C) дублетов на основе свойств SSC и FSC. (D) Полученные одиночные клетки затем окрашивают 7-AAD для оценки их жизнеспособности. (E) 7-AAD отрицательные одиночные клетки затем оцениваются на APC-CD31 / CD45 и Pacific Blue-Sca1, чтобы исключить положительные клетки Lineage из дальнейшего анализа. (Ф,Г) Затем отрицательные синглеты линии окрашиваются для PE-Cy7-VCAM-1 и PE-α7-Интегрина. (F) FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-интегрин-клетки, а (G) MuSC идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ клетки. (H) Изоляция ФАПов у мышей PDGFRα-EGFP с использованием репортера GFP. (И-М) Профиль FACS для элементов управления «Флуоресценция минус один» (FMO) для демонстрации надлежащей компенсации и гастировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Валидация клеточной культуры FAP и MuSC. (A) Свежеизолированные FAP, экспрессирующие GFP, были покрыты и окрашены антителом PDGFRα. Ядра окрашивали DAPI. Отображаются объединенные изображения окрашивания GFP (зеленый), PDGFRα (красный) и DAPI (синий). Шкала стержней, 25 мкм. (B) Свежеизолированные FAP (зеленый) и MuSC кокультурировали в течение 48 ч и окрашивали Pax7 (красный). Ядра окрашивали DAPI. GFP-экспрессирующие FAP не экспрессируют Pax7, в то время как MuSC исключительно экспрессируют Pax7 и не являются положительными для GFP, подтверждая чистоту обеих отсортированных популяций. Шкала стержней, 75 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Мыши PDGFRα-EGFP и экспрессия Sca1 специально маркируют FAP у взрослых мышей. FAP выделяются в виде клеток GFP+/Sca1+. 7-AAD отрицательные одиночные клетки оцениваются для APC-CD31 / CD45 и GFP-PDGFRα для исключения положительных клеток Lineage и различения FAP. Lineage negative/Sca1 положительные клетки окрашивают для PE-Cy7-VCAM-1 и PE-α7-Integrin для исключения MuSC. FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-интегрин-клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативный профиль FACS активированных FAP и MuSC. (A-H) Стратегия Gating для изоляции активированных FAP и MuSC. (A) Образцы закрыты для исключения клеточного мусора путем создания графика плотности FSC-A против SSC-A. Обратите внимание на увеличенные ворота для размещения интересующего населения. (В,С) Образцы дополнительно закрываются для устранения дублетов на основе свойств SSC и FSC. (D) Полученные одиночные клетки затем окрашивают 7-AAD для оценки их жизнеспособности. (E) 7-AAD отрицательные одиночные клетки затем оцениваются на APC-CD31 / CD45 и Pacific Blue-Sca1, чтобы исключить положительные клетки Lineage из дальнейшего анализа. (Ф,Г) Затем отрицательные синглеты линии окрашиваются для PE-Cy7-VCAM-1 и PE-α7-интегрина. (F) FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-интегрин-клетки, а (G) MuSC идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-интегрин+клетки. (H) Изоляция ФАПов у мышей PDGFRα-EGFP с использованием репортера GFP. (И-М) Профиль FACS для элементов управления «Флуоресценция минус один» (FMO) для демонстрации надлежащей компенсации и гастировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Количественная оценка ФАП и MUSC в невозмутимых и поврежденных ТА. Количественная оценка ФАПов и MuSC в неповрежденных и через 7 дней после травмы ТА мышц. Подсчет клеток выполняли путем деления количества клеток, отсортированных на мг собранной мышцы. ** P < 0,01 между неповрежденными и травмированными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| 7-ААД (мкг/мл) |
CD31/CD45-APC (мкг/мл) |
Sca1-Тихоокеанский синий (мкг/мл) |
α 7-Интегрин-ПЭ (мкг/мл) |
ВКАМ-1-Биотин (мкг/мл) |
PE-Cy7 Стрептавидин (мкг/мл) |
||
| Незапятнанный контроль | |||||||
| Элементы управления с одним окрашиванием | |||||||
| 7-AAD (Контроль жизнеспособности) | 1 | ||||||
| СД31/СД45 | 2 | ||||||
| Ска1 | 5 | ||||||
| α7-Интегрин | 0.4 | ||||||
| ВЧАМ-1 | 5 | 2 | |||||
| Элементы управления FMO | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| ФМО CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| ФМО Ска1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Интегрин | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| ФМО ВЧАМ-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Экспериментальный образец | |||||||
| Полное пятно | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Таблица 1: Матрица окрашивания антителами. Перечень концентраций антител, используемых для окрашивания экспериментальных и контрольных образцов. При выделении FAP с помощью GFP окрашивание Sca1 может быть опущено. Вместо этого запустите управление GFP с одним окрашиванием и GFP FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Создание эффективных и воспроизводимых протоколов для идентификации и изоляции чистых популяций взрослых стволовых клеток является первым и наиболее важным шагом на пути к пониманию их функции. Изолированные FAP и MuSC могут быть использованы для проведения мультиомического анализа в экспериментах по трансплантации в качестве потенциального лечения мышечных заболеваний или могут быть генетически модифицированы для моделирования заболеваний в терапии стволовыми клетками.
Протокол, описанный здесь, предоставляет стандартизированные рекомендации по идентификации, изоляции и культивированию FAP и MUSC, полученных из мышц задних конечностей взрослых мышей. Чистые популяции FAP и MuSC были выделены с использованием метода на основе FACS, и их чистота впоследствии оценивалась иммуноокрашивающими клетками специфическими маркерами клеточной поверхности и генетическими средствами.
Протокол состоит из трех основных разделов, которые сильно влияют на выход FAP и MuSC: механическое и ферментативное мышечное пищеварение, генерация мононуклеированной клеточной суспензии через иглу 20 G и окончательная изоляция отдельных клеток через FACS.
Выполнение правильного измельчения мышц имеет решающее значение для высвобождения отдельных клеток. Акцент должен быть сделан на этом этапе, так как достижение оптимального размера мышечных кусочков после измельчения позволяет ферментам, используемым для пищеварения, работать лучше всего и предотвращает засорение иглы, используемой на этапе 4.1. С другой стороны, чрезмерное измельчение мышц может привести к плохому выходу клеток и снижению жизнеспособности клеток, поскольку MuSC быстро высвобождаются во время первого пищеварения и могут аспирироваться на стадии 3.7.2 или 3.8.214. Кроме того, эффективность ферментов, используемых для переваривания мышечного препарата, также влияет на качество ферментативной диссоциации, так как может наблюдаться вариабельность между различными партиями ферментов или снижение активности ферментов со временем23. Поэтому рекомендуется тестировать каждую партию ферментов для оптимизации сроков и концентрации пищеварения. Кроме того, концентрация и количество времени, необходимое для переваривания мышцы, также могут быть затронуты патологическими состояниями, которые влияют на жесткость мышц. Эти конкретные условия потребуют индивидуальной оптимизации.
Окончательная генерация мононуклеированных клеток происходит путем пропускания суспензии через шприц объемом 10 мл с иглой 20 Г. При выполнении этого шага следует проявлять особую осторожность, чтобы свести к минимуму количество образующихся пузырьков, поскольку их разрыв вызывает дополнительное повреждение клеток24.
Затем клеточная суспензия окрашивается коктейлем антител и приобретается с помощью клеточного сортировщика. Установка правильных ворот является еще одним важным шагом. При выполнении этих экспериментов настоятельно рекомендуется запускать перечисленные одиночные окрашенные элементы управления и FMO, чтобы должным образом компенсировать побочный эффект выбросов и учитывать фоновый сигнал из-за распространения побочных эффектов. Это особенно важно при работе с яркими флуоресцентными белками, такими как GFP, и непрямыми пятнами, такими как комплекс VCAM-1-biotin/ Stretpavidin-PE-Cy7.
Более того, прежде чем проводить этот эксперимент в первый раз, хорошей практикой является выполнение титрования антител, используемых для обнаружения интересующих популяций. Определение оптимальной концентрации антител является критическим шагом к обеспечению наиболее яркого сигнала положительной популяции и предотвращению увеличения фонового окрашивания.
После завершения сортировки важно выполнить послесортировочный анализ отсортированных ячеек, чтобы определить их чистоту и жизнеспособность. Выход и жизнеспособность отсортированных клеток сильно зависят от количества времени, необходимого для обработки образца, и должны учитываться при планировании обработки нескольких мышей. Кроме того, хранение отсортированных клеток на льду в 2-кратной среде, обогащающей сыворотку, может помочь восстановлению клеток и улучшить их жизнеспособность.
В этом протоколе FAP и MuSC были выделены из передних мышц большеберцовой кости неповрежденных мышей, а также через 7 дней после инъекции Notexin. Сообщается, что после острой травмы различные субпопуляции FAP и MuSC временно экспрессируются в регенерирующей мышечной ткани. Малекова и его коллеги сообщили о наличии субпопуляции VCAM-1, экспрессирующей FAP, которая отсутствует в неповрежденных мышцах, достигла пика между 2 и 3 днями после травмы при остром воспалении и сохранялась у мышиных дистрофических мышей13. Аналогичным образом, Кафадар и его коллеги сообщили о временном увеличении экспрессии Sca1 на небольшом подмножестве миогенных предшественников через 2 дня после травмы25. Тем не менее, миогенные клетки Sca1+ были значительно уменьшены через 3 дня после травмы25. Наличие этих субпопуляций следует признать и учитывать при использовании этого протокола для изоляции FAP и MuSC на более ранних стадиях.
Таким образом, этот протокол описывает метод изоляции и культивирования чистой популяции FAP и MuSC, выделенных из здоровых или поврежденных мышц взрослых мышей. Высокая чистота и жизнеспособность ячеек делают этот протокол пригодным для дальнейших применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Тома Чунга (Гонконгский университет науки и технологии) за советы по изоляции MuSC. Эта работа финансировалась NIAMS-IRP через гранты NIH AR041126 и AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
