Summary
Den nøyaktige identifiseringen av fibro-adipogene stamceller (FAPs) og muskelstamceller (MuSCs) er avgjørende for å studere deres biologiske funksjon i fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokollen gir retningslinjer for isolering, rensing og kultur av FAPs og MuSCs fra voksne musemuskler.
Abstract
Fibro-adipogene stamceller (FAPs) er en populasjon av skjelettmuskulaturbosatte mesenkymale stromale celler (MSCs) som er i stand til å differensiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen avstamning. Sammen med muskelstamceller (MuSCs) spiller FAPs en kritisk rolle i muskelhomeostase, reparasjon og regenerering, samtidig som de aktivt opprettholder og ombygger den ekstracellulære matrisen (ECM). Under patologiske forhold, som kronisk skade og muskeldystrofier, gjennomgår FAPs avvikende aktivering og skiller seg ut i kollagenproduserende fibroblaster og adipocytter, noe som fører til fibrose og intramuskulær fettinfiltrasjon. Dermed spiller FAPs en dobbel rolle i muskelregenerering, enten ved å opprettholde MuSC-omsetning og fremme vevsreparasjon eller bidra til fibrotisk arrdannelse og ektopisk fettinfiltrater, noe som kompromitterer integriteten og funksjonen til skjelettmuskelvevet. En riktig rensing av FAPs og MuSCs er en forutsetning for å forstå den biologiske rollen til disse cellene i fysiologiske så vel som under patologiske forhold. Her beskriver vi en standardisert metode for samtidig isolering av FAPs og MuSCs fra lemmuskler hos voksne mus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Protokollen beskriver i detalj den mekaniske og enzymatiske dissosiasjonen av mononukleerte celler fra hele lemmuskler og skadede tibialis anterior (TA) muskler. FAPs og MuSCs blir deretter isolert ved hjelp av en halvautomatisert cellesorterer for å oppnå rene cellepopulasjoner. Vi beskriver i tillegg en optimalisert metode for dyrking av hvilende og aktiverte FAPs og MuSCs, enten alene eller i kokulturforhold.
Introduction
Skjelettmuskulaturen er det største vevet i kroppen, og står for ~ 40% av voksen menneskelig vekt, og er ansvarlig for å opprettholde holdning, generere bevegelse, regulere basal energimetabolisme og kroppstemperatur1. Skjelettmuskulatur er et svært dynamisk vev og har en bemerkelsesverdig evne til å tilpasse seg en rekke stimuli, for eksempel mekanisk stress, metabolske endringer og daglige miljøfaktorer. I tillegg regenererer skjelettmuskulaturen som svar på akutt skade, noe som fører til fullstendig restaurering av morfologi og funksjoner2. Skjelettmuskulaturens plastisitet er hovedsakelig avhengig av en populasjon av bosatte muskelstamceller (MuSCs), også kalt satellittceller, som ligger mellom myofiberplasmamembranen og basal lamina 2,3. Under normale forhold bor MuSCs i muskelnisjen i hvilemodus, med bare noen få divisjoner for å kompensere for cellulær omsetning og for å fylle opp stamcellebassenget4. Som svar på skade går MuSCs inn i cellesyklusen, sprer seg og bidrar enten til dannelsen av nye muskelfibre eller går tilbake til nisje i en selvfornyelsesprosess 2,3. I tillegg til MuSCs, homeostatisk vedlikehold og regenerering av skjelettmuskulaturen stole på støtte fra en populasjon av muskel bosatt celler kalt fibro-adipogenic forfedre (FAPs) 5,6,7. FAPs er mesenkymale stromale celler innebygd i muskelbindevevet og i stand til å differensiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen avstamning 5,8,9,10. FAPs gir strukturell støtte til MuSCs, da de er en kilde til ekstracellulære matriksproteiner i muskelstamcellenisjen. FAPs fremmer også langsiktig vedlikehold av skjelettmuskulaturen ved å utskille cytokiner og vekstfaktorer som gir trofisk støtte til myogenese og muskelvekst 6,11. Ved akutt muskelskade sprer FAPs seg raskt for å produsere en forbigående nisje som støtter den strukturelle integriteten til den regenererende muskelen og gir et gunstig miljø for å opprettholde MuSCs spredning og differensiering på en parakrin måte5. Etter hvert som regenerering fortsetter, blir FAPs fjernet fra den regenerative muskelen ved apoptose, og deres tall går gradvis tilbake til basalt nivå12. Imidlertid, under forhold som favoriserer kronisk muskelskade, overstyrer FAPs pro-apoptotisk signalering og akkumuleres i muskelnisjen, hvor de skiller seg ut i kollagenproduserende fibroblaster og adipocytter, noe som fører til ektopiske fettinfiltrater og fibrotisk arrdannelse12,13.
På grunn av deres multipotens og deres regenerative evner, har FAPs og MuSCs blitt identifisert som potensielle mål i regenerativ medisin for behandling av skjelettmuskulaturforstyrrelser. Derfor, for å undersøke deres funksjon og terapeutiske potensial, er det viktig å etablere effektive og reproduserbare protokoller for isolasjon og kultur av FAPs og MuSCs.
Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan identifisere forskjellige cellepopulasjoner basert på morfologiske egenskaper som størrelse og granularitet, og tillater cellespesifikk isolasjon basert på bruk av antistoffer rettet mot celleoverflatemarkører. Hos voksne mus uttrykker MuSCs det vaskulære celleadhesjonsmolekylet 1 (VCAM-1, også kjent som CD106) 14,15 og α7-Integrin15, mens FAPs uttrykker blodplateavledet vekstfaktorreseptor α (PDGFRα) og stamcelleantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . I protokollen beskrevet her ble MuSCs identifisert som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mens FAPs ble identifisert som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt ble PDGFRαEGFP-mus brukt til å isolere FAPer som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-hendelser18,19. Videre sammenlignet vi overlappingen mellom det fluorescerende signalet til PDGFRα-GFP + -celler til celler identifisert av overflatemarkøren Sca1. Vår analyse viste at alle GFP-uttrykkende celler også var positive for Sca1, noe som indikerer at begge tilnærmingene kan brukes til identifisering og isolering av FAPs. Til slutt bekreftet farging med spesifikke markørantistoffer renheten til hver cellepopulasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk som ble utført ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer godkjent av Animal Care and Use Committee (ACUC) ved National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Etterforskere som utfører denne protokollen må overholde sine lokale dyreetiske retningslinjer.
MERK: Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man isolerer FAPs og MuSCs fra bakre lemmer og skadede tibialis anterior (TA) muskler hos voksne mannlige og kvinnelige mus (3-6 måneder) og gir retningslinjer for kokulturering av FAPs og MuSCs. En oversikt over forsøksprosedyren er vist i figur 1. Alle trinn i denne protokollen skal utføres under sterile forhold og ved romtemperatur (RT), med mindre annet er spesifisert.
1. Oppsett av reagens
- Wash Medium (WM): Forbered denne løsningen ved å tilsette 10% (vol / vol) hesteserum og 1x penicillin / streptomycin til Hams F-10 Nutrient Mix cellemedier. WM kan klargjøres på forhånd og oppbevares ved 4 °C.
- Muskeldissosiasjonsbuffer (MDB): Klargjør denne bufferen ved å løse opp kollagenase II i WM. Hvis du samler hele bakre lemmer, oppløs 1000 U / ml kollagenase II i 10 ml WM for hver mus (som skal tilberedes i et 50 ml konisk rør). Hvis du samler TA-muskler, oppløs 800 U / ml kollagenase II i 7 ml WM for hver mus (som skal tilberedes i et 15 ml konisk rør). For TA-muskler vil dette bidra til å bedre visualisere cellepellets og oppnå et høyere utbytte av FAPs og MuSCs. Forbered MDB frisk før du samler musklene og hold den på is til det trengs.
- Lager av kollagenase II-oppløsning: Klargjør denne oppløsningen ved å oppløse Kollagenase II i steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS) til en endelig konsentrasjon på 1000 U/ml. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,45 μm sprøytefilter og aliquot i 1 ml lager. Oppbevar oppløsningen ved -20 °C.
- Lager av dispaseoppløsning: klargjør denne oppløsningen ved å oppløse Dispase i steril 1x PBS til en endelig konsentrasjon på 11 U/ml. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,45 μm sprøytefilter og aliquot i 1 ml lager. Oppbevar oppløsningen ved -20 °C.
- Forbered FAPs kulturmedium ved å supplere DMEM med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum, 1x penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml FGF. Oppbevar mediet ved 4 °C.
- Forbered MuSCs kulturmedium som supplerer F10 med 10% (vol / vol) hesteserum, 1x penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml FGF. Oppbevar mediet ved 4 °C.
- Forbered kokulturmediet ved å supplere DMEM med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum, 10% (vol / vol) hesteserum, 1x penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml FGF. Oppbevar mediet ved 4 °C.
2. Høsting av muskler i bakre lemmer
- Tilsett 2-3 ml WM i en 6 cm tallerken (en tallerken per mus) og legg den på is.
- Utfør eutanasi ved kvelning: plasser musen i et CO 2 kammer og introduser 100% CO2. Bruk cervical dislokasjon for å bekrefte døden.
- Plasser musen liggende på en disseksjonspute og spray den med 70% (vol / vol) etanol for å unngå forurensning.
- Bruk tang til å klemme midten av musens magehud og kutte en ~ 1 cm åpning horisontalt. Ta tak i sårkantene og pulten i musen ved å trekke åpningen i motsatt retning for å avdekke musklene under. Utsett den ene siden av musens bakre lem om gangen.
- Før du samler muskler, fjern intermuskulært fett mellom hamstrings og den proksimale enden av quadriceps. Dette vil forbedre isoleringen av FAPs og MuSCs.
- Uten å skade vevet, bruk skarpe tang for å bryte og skrelle av fascia for å eksponere under TA- og extensor digitorum longus (EDL) musklene. Kjør den skarpe tuppen av tangen under TA/EDL-musklene for å løsne musklene fra tibia.
- Klipp av senene som fester TA/EDL til ankelen, og mens du holder den med tang, trim musklene med saks langs lengdelinjen til TA/EDL. Klipp senene rundt kneet for å løsne hele TA/EDL-musklene. Legg musklene i en 6 cm tallerken som holdes på is.
- Fortsett å isolere gastrocnemius og soleus muskler ved å kutte alle sener ved ankelen og løsne musklene fra tibia og fibula. Skjær rundt kneet og overfør musklene til 6 cm parabolen.
- Skrell av fascia rundt quadriceps og skille den fra lårbenet ved å kjøre den skarpe spissen av tangen mellom muskelen og beinet. Klipp senene rundt kneet, og mens du holder quadriceps med tang i den distale enden, trimmer du resten av muskelen ved å kutte langs lårbenet. Plasser musklene i 6 cm parabolen.
- Ta av hamstrings og gjenværende muskler rundt lårbenet og overfør dem til 6 cm parabolen. Samle bakre lemmer muskler i en 6 cm tallerken holdt på is.
MERK: Unngå å skade blodårene, når det er mulig, for å forhindre dannelse av blodklumper som kan forstyrre isolasjonen nedstrøms. Hvis blødning oppstår, fjern det utskårne karet umiddelbart med en steril gasbind for å absorbere blodet. - Samle TA, EDL, gastrocnemius, soleus, quadricep og hamstring muskler fra kontralateral lem.
MERK: Når du isolerer hele bakre lemmer, må du ikke samle to eller flere mus. Hvis du isolerer TA-muskler, kan opptil tre TA-muskler samles.
3. Mekanisk og enzymatisk muskelfordøyelse
- Aspirer WM fra 6 cm parabolen og tilsett 1-2 ml MDB for å holde musklene fuktige.
- Hakk musklene grundig til du får en slurrypasta av godt hakket vev. For å gjøre det, bruk tang for å holde den ene enden av et stykke muskel, og bruk deretter en skalpell til å rive og skjære muskelen til den er mindre stram.
- Bruk saks, fortsett å kutte muskelen i små biter i 1-2 min. Gjenta dette trinnet for hver gruppe muskler til du får et godt hakket muskelslam.
MERK: Dette er et svært kritisk skritt for å maksimere utbyttet av FAPs og MuSCs. Det anbefales å bruke 8-10 min (4-5 min hvis du bare isolerer TA-muskler) i dette trinnet for å sikre riktig muskelhakking. - Overfør hakkede muskler fra hver mus til det koniske røret som inneholder MDB.
- Forsegl rørene med laboratoriefilm og inkuber i et 37 ° C vannbad med omrøring (75 o / min) i 1 time. Plasser rørene horisontalt langs ristebanen og bruk vekter for å holde rørene nedsenket i vann.
- Tin 1 ml kollagenase II-lager og 1 ml dispaselager per mus. Før bruk, spinn dispasemassen i en svingende bøtterotor ved 10 000 x g i 1 min ved 4 ° C. Bruk bare supernatanten.
- Hvis hele bakre lemmer muskler ble samlet, fortsett som følger:
- Etter 1 time, fjern røret fra shakeren og fyll det til 50 ml med WM. Vend forsiktig et par ganger for å sikre blanding.
- Sentrifuge cellene i en svingende bøtterotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør 42 ml supernatant til to nye rør (~ 21 ml i hvert rør) og la ~ 8 ml i det opprinnelige røret.
- Fyll de nye rørene som inneholder 21 ml supernatant opp til 50 ml med WM. Sentrifuge cellene igjen i en svingende bøtterotor ved 350 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Aspirer alle supernatantene og hold pellets på is.
- Tilsett 1 ml kollagenase II-lager og 1 ml dispasemasse i det originale røret som inneholder ~ 8 ml MDB.
- Bruk en 5 ml serologisk pipette til å resuspendere pelleten 10 ganger uten tilstopping. Løs ut løsningen mot rørets vegg, unngå dannelse av bobler. Hvis det oppstår tilstopping under resuspendering, skyv pipettespissen mot bunnen av røret for å forstyrre muskelbitene mekanisk. Fortsett til trinn 3.9.
- Hvis TA-muskler ble samlet, fortsett som følger:
- Etter 1 time, fjern røret fra shakeren og fyll dem til 15 ml med WM. Vend forsiktig et par ganger for å sikre blanding.
- Sentrifuge cellene i en svingende bøtterotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør 13 ml supernatant til ett nytt 15 ml rør og la ~ 2 ml være i det opprinnelige røret.
- Fyll det nye røret som inneholder 13 ml supernatant opp til 15 ml med WM. Sentrifuge cellene igjen i en svingende bøtterotor ved 350 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Aspirer all supernatanten og hold pelleten på is.
- Bruk en pipettespiss på 1000 μL til å resuspendere pelletsen i det opprinnelige røret opp og ned uten tilstopping.
- Tilsett 1 ml kollagenase II-lager og 1 ml dispasemasse i originalrøret som inneholder 2 ml MDB og fyll opptil 10 ml med WM. Fortsett til trinn 3.9.
- Forsegl rørene med laboratoriefilm og inkuber i et 37 ° C vannbad med omrøring (75 o / min) i 30 minutter. Plasser rørene som i trinn 3.5.
4. Generering av mononukleerte celler
MERK: Hvis du arbeider med TA-muskler samlet i et 15 ml konisk rør, overfør suspensjonen til et 50 ml konisk rør før du fortsetter med trinn 4.1.
- Etter 30 minutter, fjern røret fra shakeren. Aspirer og kast ut muskelsuspensjonen gjennom en 10 ml sprøyte med en 20 G nål vellykket 10 ganger.
MERK: Løs ut muskeloppheng mot rørveggen for å unngå bobler og skumdannelse. Små biter av ufordøyd sener eller brusk kan tette nålen i løpet av de første rundene av aspirasjon. Hvis det oppstår tilstopping, bruk steril tang for å fjerne treskoen fra spissen av nålen. - Fyll hvert rør opp til 50 ml med WM og snu forsiktig et par ganger for å sikre blanding.
- Sentrifuge cellene i en svingende bøtterotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør supernatant til et nytt rør (~ 42 ml) og la ~ 8 ml være i det originale røret.
- Fyll det nye røret som inneholder 42 ml supernatant opp til 50 ml med WM. Sentrifuge cellene igjen i en svingende bøtterotor ved 350 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Aspirer all supernatanten og hold pelleten på is.
- Plasser en 40 μm nyloncellesil i det originale 50 ml koniske røret som inneholder 8 ml WM og for-våt cellesilen med 1-2 ml WM.
- Mens du holder 40 μm nyloncellesilen, bruk en 10 ml pipette for å forsiktig resuspendere pelleten 5-10 ganger. Filtrer pellets gjennom cellesilen tilbake i samme rør for å minimere celletap.
- På dette trinnet må du sørge for at det er flere rør med cellepellets på is. Filtrer pellets tilbake i det opprinnelige røret ved å legge til 4-5 ml WM til hvert rør for å resuspendere pellets og overføre løsningen til cellesilen plassert i det opprinnelige røret. Tillat filtrering etter tyngdekraften.
- Etter å ha samlet alle pellets i det originale 50 ml koniske røret, skyll cellesilen med ytterligere 4-5 ml WM. Bruk en 1000 μL pipette for å samle all væsken fra undersiden av cellesilen.
- Fyll hvert rør med WM opptil 50 ml og snu forsiktig et par ganger for å sikre blanding.
- Sentrifuge cellene i en svingende bøtterotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer umiddelbart all supernatanten etter sentrifugering uten å forstyrre pelleten.
- Resuspender pelleten i 600 μL WM og overfør den til et 2 ml mikrosentrifugerør.
5. Antistofffarging for flowcytometri
MERK: For hvert eksperiment setter du opp følgende kontroller: i) ufarget kontroll, ii) levedyktighetskontroll for å velge for den levende cellepopulasjonen, iii) enkeltfargede kompensasjonskontroller for å korrigere for fluorokrom utslippsutslipp, og iv) fluorescens minus en (FMO) kontroller for å sette gatinggrenser ved å ta hensyn til spilloverspredning. Se tabell 1 for en fullstendig liste over fargestoffer.
- For å forberede ufarget kontroll, overfør 10 μL av cellesuspensjonen til et 2 ml mikrosentrifugerør som inneholder 190 μL WM. Resuspender cellesuspensjonen og filtrer gjennom et 5 ml polystyren rundbunnsrør med en 35 μm celle-silhette. La suspensjonen filtrere etter tyngdekraften.
- Bruk en 200 μL pipette for å samle all væske fra undersiden av cellesilen. Forsegl med en hette og la den stå på is, beskyttet mot lys.
- Forbered levedyktighet, FMO og enkeltfargede kontroller: merk 10 2 ml mikrosentrifugerør og tilsett 190 μL WM i hvert rør og 10 μL cellesuspensjon. Se tabell 1 for en fullstendig liste over kontroller. Tilsett antistoffer til riktig rør avhengig av eksperimentell kontroll. Se tabell 1 for informasjon om antistoffkombinasjon og konsentrasjon.
- Overfør resten av cellesuspensjonen (500 μL) til et 2 ml mikrosentrifugerør (eksperimentelt rør) og tilsett følgende antistoffer: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotin og α7-Integrin-PE. Se tabell 1 for informasjon om antistoffkombinasjon og konsentrasjon.
- Bland forsiktig godt hvert rør for å sikre jevn fordeling og inkuber cellene i en roterende shaker ved 4 °C i 45 minutter beskyttet mot lys.
- Etter 45 min, fyll alle mikrosentrifugerør opp til 2 ml med WM. Vend rørene forsiktig et par ganger for å sikre fullstendig blanding. Sentrifuge rørene i en nedkjølt sentrifuge med en fast vinkelrotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatanten uten å forstyrre pelleten.
- Resuspender cellene i alle mikrosentrifugerør i 300 μL WM.
- Tilsett streptavidinantistoff i passende rør. Se tabell 1 for informasjon om antistoffkombinasjon og konsentrasjon. Bland forsiktig godt hvert rør for å sikre jevn fordeling og inkuber cellene i en roterende shaker ved 4 °C i 20 minutter beskyttet mot lys. La de resterende rørene ligge på is, beskyttet mot lyset.
- Etter 20 min, fyll mikrosentrifugerør som inneholder streptavidinantistoff til 2 ml med WM. Vend rørene forsiktig noen ganger for å sikre fullstendig blanding. Sentrifuge rørene i en nedkjølt sentrifuge med en fast vinkelrotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatanten helt og resuspender celler i 300 μL WM.
- Forvåt 35 μm cellesilhette på 10 5 ml polystyren rundbunnsrør med 200 μL WM. Filtrer celler fra kontrollrør gjennom passende 5 ml polystyren rundbunnsrør. Bruk en 200 μL pipette for å samle all væske fra undersiden av cellesilen. Forsegl med hetter, la rørene ligge på is, og beskytt dem mot lys.
- Resuspender cellene i forsøksrøret med ytterligere 200 μL WM for totalt 500 μL WM. Pre-våt en celle silhette av et 5 ml polystyren rundbunnsrør med 200 μL WM. Overfør cellesuspensjonen fra forsøksrøret til 5 ml polystyren rundbunnsrør og la den filtrere etter tyngdekraften.
- Skyll 2 ml mikrosentrifugerøret som inneholder den eksperimentelle prøvesuspensjonen med 300 μL WM og før den gjennom samme sillokk. Bruk en 200 μL pipette for å samle all væske fra undersiden av cellesilen. Forsegl med en hette, la rør ligge på is, og beskytt dem mot lys.
MERK: Hvis det oppstår tilstopping av 35 μm cellesilhetten, bank forsiktig på røret på benken for å lette gjennomstrømningen. - Forbered og merk oppsamlingsrørene for FAPs og MuSCs. Hvis du isolerer celler fra hele bakre lemmermuskler, sorter cellene i 5 ml polypropylen rundbunnsrør med opptil 1 ml av enten FAPs eller MuSCs kulturmedium supplert med 2x serum. Hvis du isolerer celler fra TA-muskler, sorterer du FAPs og MuSCs i 2 ml mikrosentrifugerør som inneholder opptil 400 μL kulturmedium supplert med 2x serum.
6. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
MERK: Denne protokollen benytter et kompakt benchtop forskningsstrømningscytometer utstyrt med en 100 μm dyse og med en tre-laserkonfigurasjon (488 nm, 640 nm, 405 nm) med muligheten til å analysere opptil ni forskjellige fluorokromer (11 parametere inkludert fremover- og sidespredning). Fluorokromene som brukes i denne protokollen og deres tilhørende detektorbåndpassfiltre er som følger: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Stillehavsblå 448/45; 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Cellene sorteres ved 4 °C og blir liggende på is etter sorteringen. Før du bruker dette instrumentet, må du sørge for at brukeren er riktig opplært av en teknisk applikasjonsspesialist.
- Definer og ytelseskontroller cellesorteringen i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Sett opp en hierarkisk gatingstrategi for å identifisere FAPs og MuSCs (figur 2).
- Isoler FAP-er basert på følgende skjema: i) fremovercellespredningsområde vs sidecellespredningsområde (FSC-A vs. SSC-A) for å skille celler versus rusk, ii) sidecellespredningshøyde vs sidecellespredningsbredde (SSC-H vs. SSC-W) for å diskriminere singleter fra dubletter i SSC-området, iii) fremovercellespredningshøyde vs fremovercellespredningsbredde (FSC-H vs. FSC-W) for å diskriminere singleter fra dubletter i FSC-området, og iv) 7-AAD-område vs SSC-A for å skille levende versus døde celler.
- Hvis du isolerer FAPs gjennom antistoffbasert metode, bruk følgende skjema: v) APC-CD45 / CD31-området vs Pacific Blue-Ly-6A / E (Sca1) -området for å ekskludere CD31+ og CD45+ celler fra videre analyse, og vi) PE-Cy7-VCAM-1-området vs PE-α7-Integrin-området fra CD31-/CD45-/Sca1+-populasjonen for å skille FAPs. FAPer er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-hendelser.
- Hvis du isolerer FAPs gjennom endogen GFP-reportermetode, bruk følgende skjema: v) APC-CD45/CD31-området vs GFP-PDGFRα-området for å ekskludere CD31+ og CD45+-celler fra videre analyse og isolere GFP + -celler. FAPer er identifisert som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-hendelser.
- Isoler MuSC-er basert på følgende skjema: i) fremovercellespredningsområde vs sidecellespredningsområde (FSC-A vs. SSC-A) for å skille celler mot rusk, ii) sidecellespredningshøyde vs sidecellespredningsbredde (SSC-H vs. SSC-W) for å diskriminere singleter fra dubletter i SSC-området, iii) fremovercellespredningshøyde vs fremovercellespredningsbredde (FSC-H vs. FSC-W) for å diskriminere singleter fra dubletter i FSC-området, iv) 7-AAD-område vs SSC-A for å skille levende vs døde celler, v) APC-CD45/CD31-område vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1)-område for å ekskludere CD31+ og CD45+-celler fra videre analyse, og vi) PE-Cy7-VCAM-1-område vs PE-α7-Integrin-område fra CD31-/CD45-/Sca1-populasjonen for å skille MuSCs. MuSC-er er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-hendelser.
- Isoler FAP-er basert på følgende skjema: i) fremovercellespredningsområde vs sidecellespredningsområde (FSC-A vs. SSC-A) for å skille celler versus rusk, ii) sidecellespredningshøyde vs sidecellespredningsbredde (SSC-H vs. SSC-W) for å diskriminere singleter fra dubletter i SSC-området, iii) fremovercellespredningshøyde vs fremovercellespredningsbredde (FSC-H vs. FSC-W) for å diskriminere singleter fra dubletter i FSC-området, og iv) 7-AAD-område vs SSC-A for å skille levende versus døde celler.
- Kjør den uberørte kontroll- og levedyktighetskontrollen for å sikre at cellepopulasjonen er riktig plassert i SSC-A vs FSC-A-plottet og for å riktig gate på levende enkeltceller.
- Skaff deg alle enkeltfargede kontroller og generer spilloverkompensasjonsmatrisen.
- Kjør alle FMO-kontroller og bestem avskjæringspunktet mellom bakgrunnsfluorescensspredning og den positivt fargede befolkningen.
- Omtrent 5-10 minutter før innsamling av den eksperimentelle prøven, tilsett 7-AAD levedyktighetsvæske og bland forsiktig.
- Når alle kontrollene er behandlet, stiller du sorteringsportene i samsvar med FMO-kontrollene; tilegne seg og sortere de eksperimentelle prøvene.
- Etter at alle prøver er behandlet, rengjør cytometeret i henhold til produsentens spesifikasjon. Eksporter alle FCS-data for analyse.
7. Kultur av FAPs og MuSCs
MERK: Sorterte celler skal dyrkes umiddelbart etter sortering, i et passende medium på kollagen jeg belagte plater.
- Sentrifuge oppsamlingsrørene i en fast vinkelrotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- For MuSCs kultur, resuspender cellene i et passende volum av MuSC-kulturmedium og inkuberer dem under standardforhold ved 37 ° C og 5% CO2.
- Plate nyisolerte MuSCs med en tetthet på 20.000 celler / cm 2 og aktiverte MuSCs med en tetthet på 15.000 celler / cm2.
- Etter plating vises celler små, sfæriske og gjennomsiktige. Innen 36 timer holder MuSCs seg til overflaten av platen og øker sakte størrelsen de første 48 timene.
- Bytt ut mediet hver 2.
MERK: MuSCs er svært følsomme for celletetthet. For å holde MuSCs i sin spredningstilstand, vokse dem til de er 60% -70% sammenflytende. Passasje cellene inn i nytt kollagen jeg belagte retter eller tallerkener og tilsett nytt friskt medium hver 2. Hvis MuSCs holdes i samme tallerken eller tallerken i mer enn 3-4 dager, vil de få en langstrakt form og vil justere seg med naboceller til de smelter sammen.
- For FAPs kultur, resuspender cellene i et passende volum av MuSC-kulturmedium og inkuberer dem under standardforhold ved 37 ° C og 5% CO2.
- Plate FAPs isolert fra uforstyrret muskel med en tetthet på 15.000 celler / cm 2 og FAPs isolert fra skadet muskel ved 9.000 celler / cm2.
MERK: Etter plating fester FAPs helt til overflaten av platen innen 48 timer, mens aktiverte FAPs festes til platen innen få timer. Når de er festet, får FAPs sin karakteristiske form, med en liten cellekropp og langstrakte celleprosesser, og de sprer seg raskt. - Bytt ut mediet hver 2.
MERK: FAPs er svært følsomme for celletetthet. Seeding FAPs ved lave tettheter kan føre til dårlig cellevekst og celledød. Tvert imot vil plating av FAPs ved høy såingstetthet øke celleoverlevelsen og forbedre ekspansjonen. FAPs som kommer fra skadet muskel krever vanligvis lavere celletetthet enn uskadet muskel, da de allerede er aktivert. Det anbefales å justere FAP plating tetthet basert på ens eksperimentelle forhold og på kilden til prøvene.
- Plate FAPs isolert fra uforstyrret muskel med en tetthet på 15.000 celler / cm 2 og FAPs isolert fra skadet muskel ved 9.000 celler / cm2.
- For kokultur, resuspender FAPs og MuSCs i kokulturmediet i forholdet 1: 1 og inkuberer de i standardforhold ved 37 ° C og 5% CO2. La cellene feste seg i 48 timer og erstatt mediet hver 2.
8. Immunfluorescensanalyse av dyrkede FAPs og MuSCs
- Aspirer cellemediet og utfør to eller tre vasker med 1x PBS.
- Fest cellene med 2% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 15 minutter ved RT.
- Aspirer 2% PFA og vask cellene raskt to eller tre ganger med 1x PBS.
- Utfør cellepermeabilisering og blokkering:
- For immunostaining av nyisolerte FAPs, utfør cellepermeabilisering og blokkering ved å inkubere celler med 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% bovint serumalbumin (BSA) + 5% Normalt eselserum (NDS) i 30 minutter ved RT.
- For immunostaining av nyisolerte MuSCs, utfør cellepermeabilisering og blokkering ved å inkubere celler med PBST + 1% BSA + 5% Normalt geitserum (NGS) i 30 minutter ved RT.
- Påfør primære antistoffer:
- For immunfarging av nyisolerte FAPs, bruk geitanti PDGFRα primært antistoff (1:300) fortynnet i PBST + 1% BSA + 5% NDS over natten ved 4 ° C.
- For immunostaining av nyisolerte MuSCs, bruk mus anti Pax7 primært antistoff (1:10) fortynnet i PBST + 1% BSA + 5% NGS i 45 min ved RT.
- Vask cellene to eller tre ganger med 1x PBS for å fjerne den primære antistoffløsningen.
- Påfør sekundære antistoffer:
- For immunostaining av nyisolerte FAPs, bruk esel anti-geit IgG (H + L) Alexa Fluor 488 sekundært antistoff (1:500) fortynnet i PBST + 1% BSA i 1 time ved RT.
- For immunostaining av nyisolerte MuSCs, bruk geit anti-mus IgG 1 Alexa Fluor 555 sekundært antistoff (1:500) fortynnet i PBST +1 % BSA i 45 minutter ved RT.
- Vask cellene to eller tre ganger med 1x PBS for å fjerne den primære antistoffløsningen.
- Utfør kjernefysisk motfarging ved å inkubere celler med DAPI i PBST (1:1000) i 5 minutter ved RT.
- Vask cellene tre ganger med 1x PBS for å fjerne DAPI-løsningen.
FORSIKTIG: DAPI er giftig og farlig; Håndter det med forsiktighet og kast det i farlig avfallsflaske. - Oppbevar cellene ved 4 °C beskyttet mot lyset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tillater isolering av omtrent en million FAPs og opptil 350 000 MuSCs fra ubesudlede bakre lemmer av villtype voksne mus (3-6 måneder), tilsvarende et utbytte på 8% for FAPs og 3% for MuSCs av totale hendelser. Ved sortering av celler fra skadet TA 7 dager etter skade, samles to til tre TA-muskler for å oppnå opptil 300 000 FAPs og 120 000 MuSCs, noe som tilsvarer et utbytte på henholdsvis 11% og 4%. Renhetsverdier etter sortering er vanligvis over 95 % for FAPs og MuSCs.
Gating-strategien som er vedtatt for å isolere FAPs og MuSCs er illustrert i figur 2. For det første identifiseres cellepopulasjoner av interesse ved å skape et fremoverspredning (FSC) versus sidespredning (SSC) tetthetsplott, noe som muliggjør en viss grad av cellulær identifikasjon basert på cellemorfologiske egenskaper. Denne gating-strategien brukes også til å utelukke små cellulære rusk, som vanligvis ligger nederst til venstre i FSC vs SSC-plottet. Celler er videre inngjerdet for å ekskludere dubletter basert på FSC- og SSC-høyde- og breddesignaler, og de resulterende singletcellene blir deretter farget med 7-AAD for å evaluere deres levedyktighet. Levende celler vurderes videre for Sca1 og CD31/CD45 ekspresjon for å ekskludere Lineage positive celler fra videre analyse. Lineage negative Sca1 negative singleter blir deretter farget for VCAM-1 og α7-Integrin for å skille FAPs og MuSCs. FAPer er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler og MuSC-er er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-celler. Alternativt er levende celler også gated for CD31 / CD45 og GFP-PDGFRα for å skille FAPs. FAPer er identifisert som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler.
Denne protokollen presenterer to gating-strategier for å isolere FAP-populasjonen: enten ved å bruke en endogen PDGFRα-EGFP-reporter eller ved å utføre cellefarging med et Sca1-antistoff. PDGFRα-EGFP knock-in reportermus (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 uttrykker H2B-eGFP-fusjonsgenet fra det endogene PDGFRα-lokuset, noe som muliggjør effektiv og spesifikk merking av PDGFRα-linjen (figur 3A). Denne muselinjen ble tidligere brukt til å isolere Pdgfrα + FAPs og er faktisk veldig nyttig for isolering av FAPs, da GFP-reporteren gir et svært synlig og spesifikt signal19. Alternativt beskriver denne protokollen en Sca1-basert isolasjonsmetode for identifisering av FAPer. Sca1 (Ly-6A / E) brukes ofte til å identifisere og isolere FAPs i muskelpreparasjon13,16,17. Sca1 er et 18-kDa glykosylfosfatidylinositol (GPI)-bundet proteinmedlem i Ly-6-familien20. I tillegg til å bli uttrykt på celleoverflaten av mesenkymale stamceller, observeres imidlertid Sca1-ekspresjon også i hematopoietiske stamceller (HSC) samt modne leukocytter og T-celler. I denne protokollen bekreftet vi egnetheten til Sca1 som FAPs markør ved å utføre FACS-baserte avstamningssporingsstudier. Spesielt ble PDGFRα-EGFP-mus ansatt for å isolere Sca1 + / GFP-uttrykkende FAPs blant populasjoner av mononukleerte celler. Vi fant at alle GFP-uttrykkende celler også var positive for Sca1 og negative for CD31, CD45, VCAM-1 og α7-Integrin (figur 4). Denne analysen bekreftet bruken av Sca1 antistoff som en markør for FAPs i både hvilende og aktiverte FAPs og gir midler for utydelig bruk av enten strategi for å isolere FAPs.
I denne protokollen ble FAPs og MuSCs også isolert fra voksne mus skadet med intramuskulære injeksjoner av Notexin, 7 dager etter skade (figur 5). Etter skade aktiverer og sprer MuSCs og FAPs in vivo, og når toppen av spredning mellom dag 3 og 4 2,3. Disse endringene i spredning gjenspeiles av en økning i prosentandelen av Sca1 / PDFGRα samt VCAM-1 / α7-Integrin positive celler. Figur 6 representerer kvantifiseringen av FAPs og MuSCs i uninjured og 7 dager etter skade TAs; Selv om toppen i spredning observeres mellom dag 2 og 3 etter skade, er en lav frekvens av prolifererende celler fortsatt merkbar 7 dager etter skade. Når MuSC-er aktiveres, er det en markant økning i deres cellulære størrelse21,22. Derfor, mens du isolerer disse cellene ved FACS, er det av kritisk betydning å justere FSC-A- og SSC-A-parametere og utvide porten for å inkludere disse cellene i midten (figur 5A).
Renheten til de isolerte cellepopulasjonene ble bekreftet ved immunostaining av kokulturerte GFP + FAPs og MuSCs med Pax7 antistoffer. Nyisolerte GFP + FAPs og MuSCs ble kokulturert i 48 timer i forholdet 1: 1 (figur 3B). GFP + FAPs uttrykte ikke Pax7-markør, mens MuSCs reagerte med dette antistoffet. Dermed er Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- og Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ gating-strategien effektiv for å isolere rene populasjoner av henholdsvis FAPs og MuSCs.
Figur 1: Grafisk oversikt over FAP- og MuSC-isolasjon. Grafisk oversikt som viser FAP og MuSC isolasjon fra bakre lemmer muskler. Protokollen gjelder også celler isolert fra TA-muskler. Først blir muskler samlet og mekanisk hakket før de gjennomgår enzymatisk fordøyelse. Muskelblandingen behandles deretter gjennom en 20 G nål og filtreres for å oppnå en suspensjon av mononukleerte celler. Celler blir deretter inkubert med en cocktail av fluoroforkonjugerte antistoffer og til slutt kjører gjennom en cellesortering for å isolere en ren populasjon av FAPs og MuSCs. Rene cellepopulasjoner blir deretter behandlet for nedstrøms applikasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representativ FACS-profil for hvilende FAPs og MuSCs. (AH) Gating-strategi for isolering av FAPs og MuSCs. (A) Først blir prøver gated for å utelukke cellulært rusk og (B, C) dubletter basert på SSC- og FSC-egenskaper. (D) De resulterende enkeltcellene blir deretter farget med 7-AAD for å evaluere deres levedyktighet. (E) 7-AAD negative enkeltceller blir deretter vurdert for APC-CD31 / CD45 og Pacific Blue-Sca1 for å ekskludere Lineage positive celler fra videre analyse. (F,G) Avstamningsnegative singleter blir deretter farget for PE-Cy7-VCAM-1 og PE-α7-Integrin. (F) FAPer er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler og (G) MuSC-er er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-celler. (H) FAPs-isolasjon i PDGFRα-EGFP-mus ved hjelp av en GFP-reporter. (IM) FACS-profil for Fluorescence Minus One (FMO) kontroller for å demonstrere riktig kompensasjon og gating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Validering av FAP- og MuSC-cellekultur. (A) Nyisolerte FAPer som uttrykker GFP ble belagt og farget sammen med et PDGFRα-antistoff. Kjerner ble farget med DAPI. Sammenslåtte bilder av GFP (grønn), PDGFRα (rød) og DAPI (blå) farging vises. Skala barer, 25 μm. (B) Nyisolerte FAPs (grønn) og MuSCs ble cocultured i 48 timer og farget med Pax7 (rød). Kjerner ble farget med DAPI. GFP-uttrykkende FAPer uttrykker ikke Pax7, mens MuSCs utelukkende uttrykker Pax7 og er ikke positive for GFP, noe som bekrefter renheten til begge sorterte populasjoner. Skala barer, 75 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: PDGFRα-EGFP-mus og Sca1-uttrykk merker spesifikt FAPs hos voksne mus. FAP-er isoleres som GFP+/Sca1+-celler. 7-AAD negative enkeltceller vurderes for APC-CD31/CD45 og GFP-PDGFRα for å ekskludere Lineage positive celler og skille FAPs. Lineage negative / Sca1 positive celler er farget for PE-Cy7-VCAM-1 og PE-α7-Integrin for å utelukke MuSCs. FAPer er identifisert som CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representativ FACS-profil for aktiverte FAPer og MuSCs. (AH) Gating-strategi for isolering av aktiverte FAPer og MuSCs. (A) Prøver er inngjerdet for å utelukke cellulært rusk ved å lage FSC-A vs SSC-A tetthetsplott. Legg merke til den forstørrede porten for å imøtekomme befolkningen av interesse. (B,C) Prøver er videre inngjerdet for å eliminere dubletter basert på SSC- og FSC-egenskaper. (D) De resulterende enkeltcellene blir deretter farget med 7-AAD for å evaluere deres levedyktighet. (E) 7-AAD negative enkeltceller blir deretter vurdert for APC-CD31 / CD45 og Pacific Blue-Sca1 for å ekskludere Lineage positive celler fra videre analyse. (F,G) Avstamningsnegative singler blir deretter farget for PE-Cy7-VCAM-1 og PE-α7-integrin. (F) FAPer er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin-celler og (G) MuSC-er er identifisert som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+-celler. (H) FAPs-isolasjon i PDGFRα-EGFP-mus ved hjelp av en GFP-reporter. (IM) FACS-profil for Fluorescence Minus One (FMO) kontroller for å demonstrere riktig kompensasjon og gating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Kvantifisering av FAPs og MuSCs i uforstyrrede og skadede TAer. Kvantifisering av FAPs og MuSCs i uninjured og 7 dager etter skade TA muskler. Celletelling ble utført ved å dele antall celler sortert per mg muskel samlet. ** P < 0,01 mellom ubesudlede vs skadde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 7-AAD (μg/ml) |
CD31/CD45-APC (μg/ml) |
Sca1-Pacific Blå (μg/ml) |
α 7-Integrin-PE (μg/ml) |
VCAM-1-Biotin (μg/ml) |
PE-Cy7 Streptavidin (μg/ml) |
||
| Unstained Control | |||||||
| Enkle fargede kontroller | |||||||
| 7-AAD (levedyktighetskontroll) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| SCA1 | 5 | ||||||
| α7-Integrin | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMO-kontroller | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Eksperimentell prøve | |||||||
| Full flekk | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tabell 1: Antistofffargingsmatrise. Liste over antistoffkonsentrasjoner som brukes til farging av eksperimentelle prøver og kontrollprøver. Hvis FAPs isoleres av GFP, kan Sca1-farging utelates. Kjør i stedet GFP enkeltfarget kontroll og GFP FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etablering av effektive og reproduserbare protokoller for identifisering og isolering av rene voksne stamcellepopulasjoner er det første og mest kritiske skrittet mot å forstå deres funksjon. Isolerte FAPs og MuSCs kan brukes til å gjennomføre multiomics analyse i transplantasjonseksperimenter som en potensiell behandling for muskelsykdommer eller kan genmodifiseres for sykdomsmodellering i stamcelleterapi.
Protokollen beskrevet her gir standardiserte retningslinjer for identifisering, isolasjon og kultur av FAPs og MuSCs oppnådd fra bakre lemmer muskler hos voksne mus. Rene populasjoner av FAPs og MuSCs ble isolert ved hjelp av en FACS-basert teknikk, og deres renhet ble deretter vurdert ved immunostaining celler med spesifikke celleoverflatemarkører og genetiske midler.
Protokollen består av tre hoveddeler som i stor grad påvirker utbyttet av FAPs og MuSCs: den mekaniske og enzymatiske muskelfordøyelsen, genereringen av en mononukleert cellesuspensjon gjennom 20 G-nålen og den endelige isoleringen av enkeltceller gjennom FACS.
Å utføre riktig muskelhakking er av kritisk betydning for å frigjøre enkeltceller. Det bør legges vekt på dette trinnet, da det å nå den optimale størrelsen på muskelbitene etter hakking gjør at enzymene som brukes til fordøyelsen kan fungere best og forhindrer tilstopping av nålen som brukes i trinn 4.1. På den annen side kan overhakking av muskelen føre til dårlig celleutbytte og redusert celle levedyktighet, da MuSCs raskt frigjøres under den første fordøyelsen og kan aspireres i trinn 3.7.2 eller 3.8.214. I tillegg påvirker effektiviteten til enzymene som brukes til fordøyelsen av muskelpreparatet også kvaliteten på den enzymatiske dissosiasjonen, da det kan være variasjon mellom forskjellige enzympartier eller en reduksjon i enzymers aktivitet med tiden23. Derfor anbefales det å teste hver batch av enzymer for å optimalisere fordøyelsestidspunktet og konsentrasjonen. Videre kan konsentrasjonen og tiden som kreves for å fordøye muskelen også påvirkes av patologiske forhold som påvirker muskelstivheten. Disse spesielle forholdene vil kreve individuell optimalisering.
Den endelige generasjonen av mononukleerte celler skjer ved å kjøre suspensjonen gjennom en 10 ml sprøyte med en 20 G nål. Spesiell forsiktighet bør utvises når du utfører dette trinnet for å minimere antall bobler som dannes, da deres sprengning forårsaker ytterligere celleskade24.
Cellesuspensjonen blir deretter farget med en antistoffcocktail og anskaffet med en cellesorterer. Å sette de riktige portene er et annet kritisk trinn. Når du utfører disse eksperimentene, anbefales det sterkt å kjøre de listede enkeltfargede kontrollene og FMO-kontrollene for å kompensere for utslippsoverføring på riktig måte og ta hensyn til bakgrunnssignalet på grunn av spilloverspredning. Dette er spesielt viktig når det gjelder lyse fluorescerende proteiner som GFP og indirekte flekker som VCAM-1-biotin / Stretpavidin-PE-Cy7-komplekset.
Før du utfører dette eksperimentet for første gang, er det dessuten god praksis å utføre en titrering av antistoffene som brukes til å oppdage populasjoner av interesse. Å bestemme den optimale konsentrasjonen av antistoffene er et kritisk skritt for å sikre det lyseste signalet fra den positive befolkningen og unngå økningen i bakgrunnsfarging.
Når sorteringen er fullført, er det viktig å utføre en ettersorteringsanalyse på de sorterte cellene for å bestemme renhet og levedyktighet. Utbyttet og levedyktigheten til de sorterte cellene påvirkes sterkt av hvor lang tid som kreves for å behandle prøven, og bør tas i betraktning når du planlegger å behandle flere mus. Videre kan det å holde de sorterte cellene på is i 2x serumberikende medier hjelpe celleutvinning og forbedre deres levedyktighet.
I denne protokollen ble FAPs og MuSCs isolert fra tibialis fremre muskler hos ubesudlede mus, samt 7 dager etter Notexin-injeksjon. Etter en akutt skade er forskjellige FAP- og MuSC-underpopulasjoner rapportert å være forbigående uttrykt i det regenererende muskelvevet. Malecova og kolleger har rapportert tilstedeværelsen av en underpopulasjon av VCAM-1 som uttrykker FAPs som er fraværende i uskadet muskel, toppet mellom dag 2 og 3 etter skade ved akutt betennelse, og vedvarte i murine dystrofiske mus13. Tilsvarende har Kafadar og kolleger rapportert en forbigående økning i uttrykket av Sca1 på en liten delmengde av myogene forfedre 2 dager etter skade25. Imidlertid ble Sca1+ myogene celler sterkt redusert 3 dager etter skade25. Tilstedeværelsen av disse underpopulasjonene bør anerkjennes og vurderes ved bruk av denne protokollen for å isolere FAPs og MuSCs på tidligere stadier.
Oppsummert beskriver denne protokollen en metode for isolasjon og kultur av en ren populasjon av FAPs og MuSCs isolert fra enten sunne eller skadede voksne musemuskler. Den høye renheten og levedyktigheten til cellene gjør denne protokollen egnet for videre nedstrøms applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil takke Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) for råd om MuSC-isolasjon. Dette arbeidet ble finansiert av NIAMS-IRP gjennom NIH-tilskudd AR041126 og AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
