Summary
Den præcise identifikation af fibro-adipogene stamceller (FAP'er) og muskelstamceller (MuSC'er) er afgørende for at studere deres biologiske funktion under fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokol giver retningslinjer for isolering, rensning og kultur af FAP'er og MuSC'er fra voksne musemuskler.
Abstract
Fibro-adipogene stamceller (FAP'er) er en population af skeletmuskulaturboende mesenkymale stromale celler (MSC'er), der er i stand til at differentiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller chondrogen afstamning. Sammen med muskelstamceller (MuSC'er) spiller FAP'er en kritisk rolle i muskelhomeostase, reparation og regenerering, samtidig med at de aktivt vedligeholder og ombygger den ekstracellulære matrix (ECM). Under patologiske tilstande, såsom kronisk skade og muskeldystrofier, gennemgår FAP'er afvigende aktivering og differentierer sig til kollagenproducerende fibroblaster og adipocytter, hvilket fører til fibrose og intramuskulær fedtinfiltration. FAP'er spiller således en dobbelt rolle i muskelregenerering, enten ved at opretholde MuSC-omsætning og fremme vævsreparation eller bidrage til fibrotisk ardannelse og ektopiske fedtinfiltrater, som kompromitterer skeletmuskelvævets integritet og funktion. En korrekt rensning af FAP'er og MuSC'er er en forudsætning for at forstå disse cellers biologiske rolle under fysiologiske såvel som patologiske forhold. Her beskriver vi en standardiseret metode til samtidig isolering af FAP'er og MuSC'er fra lemmermuskler hos voksne mus ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Protokollen beskriver detaljeret den mekaniske og enzymatiske dissociation af mononukleerede celler fra hele lemmer muskler og skadet tibialis anterior (TA) muskler. FAP'er og MuSC'er isoleres efterfølgende ved hjælp af en halvautomatisk cellesorterer for at opnå rene cellepopulationer. Vi beskriver desuden en optimeret metode til dyrkning af hvilende og aktiverede FAP'er og MuSC'er, enten alene eller under samkulturforhold.
Introduction
Skeletmuskulaturen er det største væv i kroppen, der tegner sig for ~ 40% af voksen menneskelig vægt, og er ansvarlig for at opretholde kropsholdning, generere bevægelse, regulere basal energimetabolisme og kropstemperatur1. Skeletmuskulatur er et meget dynamisk væv og besidder en bemærkelsesværdig evne til at tilpasse sig en række stimuli, såsom mekanisk stress, metaboliske ændringer og daglige miljøfaktorer. Derudover regenererer skeletmuskulaturen som reaktion på akut skade, hvilket fører til fuldstændig restaurering af dets morfologi og funktioner2. Skeletmuskulaturens plasticitet er hovedsageligt afhængig af en population af hjemmehørende muskelstamceller (MuSC'er), også kaldet satellitceller, som er placeret mellem myofiberplasmamembranen og den basale lamina 2,3. Under normale forhold befinder MuSC'er sig i muskelnichen i en hvilende tilstand med kun få divisioner for at kompensere for cellulær omsætning og for at genopbygge stamcellepuljen4. Som reaktion på skade går MuSC'er ind i cellecyklussen, spredes og bidrager enten til dannelsen af nye muskelfibre eller vender tilbage til nichen i en selvfornyelsesproces 2,3. Ud over MuSC'er er homeostatisk vedligeholdelse og regenerering af skeletmusklen afhængig af støtte fra en population af muskelboende celler ved navn fibro-adipogene forfædre (FAP'er)5,6,7. FAP'er er mesenkymale stromale celler indlejret i muskelbindevævet og i stand til at differentiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller chondrogen afstamning 5,8,9,10. FAP'er yder strukturel støtte til MuSC'er, da de er en kilde til ekstracellulære matrixproteiner i muskelstamcelleniche. FAP'er fremmer også langsigtet vedligeholdelse af skeletmuskulaturen ved at udskille cytokiner og vækstfaktorer, der giver trofisk støtte til myogenese og muskelvækst 6,11. Ved akut muskelskade spredes FAP'er hurtigt for at producere en forbigående niche, der understøtter den regenererende muskels strukturelle integritet og giver et gunstigt miljø til at opretholde MuSCs spredning og differentiering på en parakrin måde5. Efterhånden som regenerering fortsætter, ryddes FAP'er fra den regenerative muskel ved apoptose, og deres antal vender gradvist tilbage til basalniveau12. Under forhold, der favoriserer kronisk muskelskade, tilsidesætter FAP'er imidlertid pro-apoptotisk signalering og akkumuleres i muskelnichen, hvor de differentierer sig til kollagenproducerende fibroblaster og adipocytter, hvilket fører til ektopiske fedtinfiltrater og fibrotisk ardannelse12,13.
På grund af deres multipotens og deres regenerative evner er FAP'er og MuSC'er blevet identificeret som potentielle mål inden for regenerativ medicin til behandling af skeletmuskelforstyrrelser. For at undersøge deres funktion og terapeutiske potentiale er det derfor vigtigt at etablere effektive og reproducerbare protokoller til isolering og kultur af FAP'er og MuSC'er.
Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) kan identificere forskellige cellepopulationer baseret på morfologiske egenskaber såsom størrelse og granularitet og tillader cellespecifik isolering baseret på brug af antistoffer rettet mod celleoverflademarkører. Hos voksne mus udtrykker MuSC'er vaskulære celleadhæsionsmolekyle 1 (VCAM-1, også kendt som CD106)14,15 og α7-Integrin 15, mens FAP'er udtrykker den blodpladeafledte vækstfaktorreceptor α (PDGFRα) og stamcelleantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . I protokollen beskrevet her blev MuSC'er identificeret som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mens FAP'er blev identificeret som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt blev PDGFRαEGFP-mus anvendt til at isolere FAP'er som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- events18,19. Desuden sammenlignede vi overlapningen mellem det fluorescerende signal fra PDGFRα-GFP+ celler med celler identificeret ved overflademarkøren Sca1. Vores analyse viste, at alle GFP-ekspressive celler også var positive for Sca1, hvilket indikerer, at begge tilgange kan anvendes til identifikation og isolering af FAP'er. Endelig bekræftede farvning med specifikke markørantistoffer renheden af hver cellepopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle udførte dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer godkendt af Animal Care and Use Committee (ACUC) ved National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Forskere, der udfører denne protokol, skal overholde deres lokale dyreetiske retningslinjer.
BEMÆRK: Denne protokol beskriver detaljeret, hvordan man isolerer FAP'er og MuSC'er fra bagben og skadede tibialis anterior (TA) muskler hos voksne han- og hunmus (3-6 måneder) og giver retningslinjer for kokulturering af FAP'er og MuSC'er. En oversigt over forsøgsproceduren er vist i figur 1. Alle trin i denne protokol skal udføres under sterile forhold og ved stuetemperatur (RT), medmindre andet er angivet.
1. Reagensopsætning
- Wash Medium (WM): Forbered denne opløsning ved at tilsætte 10% (vol/vol) hesteserum og 1x penicillin/streptomycin til skinkens F-10 Nutrient Mix-cellemedie. WM kan klargøres på forhånd og opbevares ved 4 °C.
- Muscle Dissociation Buffer (MDB): Forbered denne buffer ved at opløse Collagenase II i WM. Hvis der samles hele bagbensmuskler, opløses 1000 U / ml Collagenase II i 10 ml WM for hver mus (skal forberedes i et 50 ml konisk rør). Hvis der opsamles TA-muskler, opløses 800 U/ml Collagenase II i 7 ml WM for hver mus (skal tilberedes i et 15 ml konisk rør). For TA-muskler vil dette bidrage til bedre at visualisere cellepiller og opnå et højere udbytte af FAP'er og MuSC'er. Forbered MDB frisk, før du samler musklerne, og hold den på is, indtil det er nødvendigt.
- Collagenase II-opløsningslager: Denne opløsning fremstilles ved at opløse Collagenase II i sterilt 1x phosphatbufferet saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 1000 E/ml. Opløsningen filtreres gennem et sprøjtefilter på 0,45 μm og aliquot i 1 ml lagre. Opløsningen opbevares ved -20 °C.
- Dispase-opløsningsmateriale: Denne opløsning fremstilles ved at opløse Dispase i steril 1x PBS til en slutkoncentration på 11 E/ml. Opløsningen filtreres gennem et sprøjtefilter på 0,45 μm og aliquot i 1 ml lagre. Opløsningen opbevares ved -20 °C.
- Forbered FAP's kulturmedium ved at supplere DMEM med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum, 1x penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml FGF. Mediet opbevares ved 4 °C.
- Forbered MuSC's kulturmedium, der supplerer F10 med 10% (vol / vol) hesteserum, 1x penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml FGF. Mediet opbevares ved 4 °C.
- Forbered cokulturmediet ved at supplere DMEM med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum, 10% (vol / vol) hesteserum, 1x penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml FGF. Mediet opbevares ved 4 °C.
2. Høst af bagbensmuskel
- Tilsæt 2-3 ml WM i en 6 cm skål (en skål pr. Mus) og læg den på is.
- Udfør eutanasi ved kvælning: Placer musen i et CO 2 -kammer og introducer 100% CO2. Brug cervikal dislokation til at bekræfte døden.
- Placer musen liggende på en dissektionspude og sprøjt den med 70% (vol / vol) ethanol for at undgå forurening.
- Brug tang til at klemme midten af musemaveskindet og skære en ~ 1 cm åbning vandret. Tag fat i sårkanterne og træk musen i hver sin retning for at afdække musklerne nedenunder. Udsæt den ene side af musens bagben ad gangen.
- Før du samler muskler, skal du fjerne intermuskulært fedt mellem hamstrings og den proksimale ende af quadriceps. Dette vil forbedre isolationen af FAP'er og MuSC'er.
- Uden at beskadige vævet skal du bruge skarpe tang til at bryde og skrælle fasciaen af for at udsætte de underliggende TA- og extensor digitorum longus (EDL) muskler. Kør den skarpe spids af tangen under TA / EDL-musklerne for at løsne musklerne fra skinnebenet.
- Skær senerne, der fastgør TA / EDL til anklen, af, og trim musklerne med en saks langs TA/EDL's længdelinje, mens du holder den med tang. Klip senerne omkring knæet for at løsne hele TA / EDL-musklerne. Placer musklerne i en 6 cm skål, der holdes på is.
- Fortsæt med at isolere gastrocnemius og soleus musklerne ved at skære alle sener ved anklen og løsne musklerne fra skinnebenet og fibulaen. Skær rundt om knæet og overfør musklerne til 6 cm skålen.
- Skræl fasciaen omkring quadriceps af og adskil den fra lårbenet ved at køre den skarpe spids af tangen mellem musklen og knoglen. Skær senerne rundt om knæet, og mens du holder quadriceps med tang i den distale ende, skal du trimme resten af musklen ved at skære langs lårbenet. Placer musklerne i 6 cm skålen.
- Fjern hamstrings og resterende muskler omkring lårbenet og overfør dem til 6 cm skålen. Saml bagbensmusklerne i en 6 cm skål, der holdes på is.
BEMÆRK: Undgå at beskadige blodkar, når det er muligt, for at forhindre dannelse af blodklumper, der kan forstyrre nedstrøms isolering. Hvis der opstår blødning, skal du straks tørre den udskårne beholder med en steril gasbind for at absorbere blodet. - Saml TA, EDL, gastrocnemius, soleus, quadricep og hamstring muskler fra det kontralaterale lem.
BEMÆRK: Når du isolerer hele bagbensmusklerne, må du ikke samle to eller flere mus. Hvis man isolerer TA-muskler, kan op til tre TA-muskler samles.
3. Mekanisk og enzymatisk muskelfordøjelse
- Aspirer WM fra 6 cm skålen og tilsæt 1-2 ml MDB for at holde musklerne fugtige.
- Hak musklerne grundigt, indtil du får en gyllepasta af godt hakket væv. For at gøre det skal du bruge tang til at holde den ene ende af et stykke muskel og derefter bruge en skalpel til at rive og skære musklen, indtil den er mindre stram.
- Brug en saks til at klippe musklen i små stykker i 1-2 min. Gentag dette trin for hver gruppe muskler, indtil du får et godt hakket muskelslam.
BEMÆRK: Dette er et meget kritisk skridt for at maksimere udbyttet af FAP'er og MuSC'er. Det anbefales at bruge 8-10 minutter (4-5 minutter, hvis du kun isolerer TA-muskler) i dette trin for at sikre en ordentlig muskelhakning. - Overfør de hakkede muskler fra hver mus til det koniske rør, der indeholder MDB.
- Rørene forsegles med laboratoriefilm og inkuberes i et 37 °C vandbad med omrøring (75 o / min) i 1 time. Placer rørene vandret langs rystebanen og brug vægte til at holde rørene nedsænket i vand.
- Optø 1 ml Collagenase II-bestand og 1 ml dispase-bestand pr. mus. Før brug drejes dispase-lageret i en svingende spandrotor ved 10.000 x g i 1 minut ved 4 °C. Brug kun supernatanten.
- Hvis hele bagbensmuskler blev samlet, skal du fortsætte som følger:
- Efter 1 time skal du fjerne røret fra rysteren og fylde det til 50 ml med WM. Vend forsigtigt et par gange for at sikre blanding.
- Centrifuger cellerne i en svingende spandrotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør 42 ml supernatant til to nye rør (~ 21 ml i hvert rør) og efterlad ~ 8 ml i det originale rør.
- Fyld de nye rør, der indeholder 21 ml supernatant op til 50 ml med WM. Centrifuge cellerne igen i en svingende spandrotor ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Aspirer alle supernatanten og hold pellets på is.
- Tilsæt 1 ml collagenase II-lager og 1 ml dispase-lager i det originale rør indeholdende ~ 8 ml MDB.
- Brug en 5 ml serologisk pipette til at suspendere pelleten 10 gange uden tilstopning. Skub opløsningen ud mod rørets væg, og undgå dannelse af bobler. Hvis tilstopning sker under resuspension, skal du skubbe pipettens spids mod bunden af røret for mekanisk at forstyrre muskelstykkerne. Fortsæt til trin 3.9.
- Hvis TA-muskler blev indsamlet, skal du fortsætte som følger:
- Efter 1 time skal du fjerne røret fra rysteren og fylde dem til 15 ml med WM. Vend forsigtigt et par gange for at sikre blanding.
- Centrifuger cellerne i en svingende spandrotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør 13 ml supernatant til et nyt 15 ml rør og efterlad ~ 2 ml i det originale rør.
- Fyld det nye rør, der indeholder 13 ml supernatant op til 15 ml med WM. Centrifuge cellerne igen i en svingende spandrotor ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Aspirer alle supernatanten og hold pelleten på is.
- Ved hjælp af en 1000 μL pipettespids skal pelleten i det originale rør genoptages uden tilstopning.
- Tilsæt 1 ml Collagenase II-lager og 1 ml dispase-lager i det originale rør indeholdende 2 ml MDB og fyld op til 10 ml med WM. Fortsæt til trin 3.9.
- Rørene forsegles med laboratoriefilm og inkuberes i et 37 °C vandbad med omrøring (75 o / min) i 30 min. Rørene anbringes som i trin 3.5.
4. Generering af mononukleerede celler
BEMÆRK: Hvis du arbejder med TA-muskler samlet i et 15 ml konisk rør, overføres suspensionen til et 50 ml konisk rør, inden du fortsætter med trin 4.1.
- Efter 30 minutter fjernes røret fra rysteren. Aspirer og skub muskelsuspensionen ud gennem en 10 ml sprøjte med en 20 G nål med succes 10 gange.
BEMÆRK: Skub muskelophæng ud mod rørets væg for at undgå bobler og skumdannelse. Små stykker ufordøjede sener eller brusk kan tilstoppe nålen under de første runder af aspiration. Hvis tilstopning opstår, skal du bruge sterile tang til at fjerne tilstopningen fra nålens spids. - Fyld hvert rør op til 50 ml med WM og vend forsigtigt et par gange for at sikre blanding.
- Centrifuger cellerne i en svingende spandrotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør supernatant til et nyt rør (~ 42 ml) og lad ~ 8 ml være i det originale rør.
- Fyld det nye rør, der indeholder 42 ml supernatant op til 50 ml med WM. Centrifuge cellerne igen i en svingende spandrotor ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Aspirer alle supernatanten og hold pelleten på is.
- Placer en 40 μm nyloncellesi i det originale 50 ml koniske rør indeholdende 8 ml WM og forvæd cellesilen med 1-2 ml WM.
- Mens du holder 40 μm nyloncellesi, skal du bruge en 10 ml pipette til forsigtigt at resuspendere pelleten 5-10 gange. Filtrer pellets gennem cellesilen tilbage i det samme rør for at minimere celletab.
- På dette trin skal du sikre dig, at der er yderligere rør med cellepiller på is. Filtrer disse pellets tilbage i det originale rør ved at tilføje 4-5 ml WM til hvert rør for at resuspendere pellets og overføre opløsningen til cellesien placeret i det originale rør. Tillad filtrering efter tyngdekraften.
- Efter at have samlet alle pellets i det originale 50 ml koniske rør, skylles cellesilen med yderligere 4-5 ml WM. Brug en 1000 μL pipette til at opsamle al væsken fra undersiden af cellesilen.
- Fyld hvert rør med WM op til 50 ml og vend forsigtigt et par gange for at sikre blanding.
- Centrifuger cellerne i en svingende spandrotor ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Opsæt straks al supernatanten efter centrifugering uden at forstyrre pelleten.
- Resuspender pelleten i 600 μL WM og overfør den til et 2 ml mikrocentrifugerør.
5. Antistoffarvning til flowcytometri
BEMÆRK: For hvert eksperiment skal du oprette følgende kontroller: i) ufarvet kontrol, ii) levedygtighedskontrol for at vælge for populationen af levende celler, iii) enkeltfarvede kompensationskontroller for at korrigere for fluorokromemissionsafsmitning og iv) fluorescens minus en (FMO) kontrol for at indstille gatinggrænser ved at tage højde for spilloverspredning. Se tabel 1 for en komplet liste over farvningskontroller.
- For at forberede ufarvet kontrol overføres 10 μL af cellesuspensionen til et 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende 190 μL WM. Resuspender cellesuspensionen og filtrer gennem et 5 ml polystyren rundtbundet rør med en 35 μm celle-silhætte. Lad suspensionen filtrere efter tyngdekraften.
- Brug en 200 μL pipette til at opsamle al væsken fra undersiden af cellesilen. Forsegl med en hætte og lad den ligge på is, beskyttet mod lys.
- Forbered levedygtighed, FMO og enkeltfarvede kontroller: Mærk 10 2 ml mikrocentrifugerør, og tilsæt 190 μL WM i hvert rør og 10 μL cellesuspension. Se tabel 1 for en fuldstændig liste over kontrolelementer. Tilsæt antistoffer til det passende rør afhængigt af den eksperimentelle kontrol. Se tabel 1 for oplysninger om antistofkombination og koncentration.
- Resten af cellesuspensionen (500 μL) overføres til et 2 ml mikrocentrifugerør (eksperimentelt rør), og der tilsættes følgende antistoffer: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotin og α7-Integrin-PE. Se tabel 1 for oplysninger om antistofkombination og koncentration.
- Bland forsigtigt hvert rør godt for at sikre ensartet fordeling og inkuber cellerne i en roterende ryster ved 4 °C i 45 minutter beskyttet mod lys.
- Efter 45 minutter fyldes alle mikrocentrifugerør op til 2 ml med WM. Vend forsigtigt rørene et par gange for at sikre fuldstændig blanding. Centrifuge rørene i en kølecentrifuge med en rotor med fast vinkel ved 250 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirer supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Resuspender cellerne i alle mikrocentrifugerør i 300 μL WM.
- Tilsæt streptavidinantistof i passende rør. Se tabel 1 for oplysninger om antistofkombination og koncentration. Bland forsigtigt hvert rør godt for at sikre ensartet fordeling og inkuber cellerne i en roterende ryster ved 4 °C i 20 minutter beskyttet mod lys. Lad de resterende rør være på is, beskyttet mod lyset.
- Efter 20 minutter fyldes mikrocentrifugerør indeholdende streptavidinantistof til 2 ml med WM. Vend forsigtigt rørene et par gange for at sikre fuldstændig blanding. Centrifuge rørene i en kølecentrifuge med en rotor med fast vinkel ved 250 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirer supernatanten fuldstændigt og resuspenderer celler i 300 μL WM.
- Forvåd 35 μm celle silhætte på 10 5 ml polystyren rundbundede rør med 200 μL WM. Filtrer celler fra kontrolrør gennem de passende 5 ml polystyren rundbundede rør. Brug en 200 μL pipette til at opsamle al væsken fra undersiden af cellesilen. Forsegl med hætter, lad rørene ligge på is, og beskyt dem mod lys.
- Resuspender cellerne i forsøgsrøret med yderligere 200 μL WM i alt 500 μL WM. Forvåd en cellesihætte af et 5 ml polystyren rundbundet rør med 200 μL WM. Overfør cellesuspensionen fra forsøgsrøret til 5 ml polystyren rundbundsrøret og lad det filtrere efter tyngdekraften.
- Skyl 2 ml mikrocentrifugerøret indeholdende den eksperimentelle prøvesuspension med 300 μL WM og før det gennem den samme silhætte. Brug en 200 μL pipette til at opsamle al væsken fra undersiden af cellesilen. Forsegl med en hætte, lad rør ligge på is, og beskyt dem mod lys.
BEMÆRK: Hvis der sker tilstopning af 35 μm celle-silhætten, skal du forsigtigt banke røret på bænken for at lette gennemstrømningen. - Forbered og mærk opsamlingsrørene til FAP'er og MuSC'er. Hvis du isolerer celler fra hele bagbensmuskler, skal du sortere cellerne i 5 ml polypropylen rundbundsrør med op til 1 ml enten FAPs eller MuSCs kulturmedium suppleret med 2x serum. Hvis du isolerer celler fra TA-muskler, skal du sortere FAP'er og MuSC'er i 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende op til 400 μL kulturmedium suppleret med 2x serum.
6. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
BEMÆRK: Denne protokol anvender et kompakt benchtop-forskningsflowcytometer udstyret med en 100 μm dyse og med en tre-laserkonfiguration (488 nm, 640 nm, 405 nm) med evnen til at analysere op til ni forskellige fluorkromer (11 parametre inklusive fremad- og sidespredning). De fluorkromer, der anvendes i denne protokol, og deres tilhørende detektorbåndpasfiltre er som følger: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Stillehavsblå 448/45; 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Cellerne sorteres ved 4 °C og forbliver på is efter sorteringen. Før du betjener dette instrument, skal du sikre dig, at brugeren er ordentligt uddannet af en teknisk applikationsspecialist.
- Opsætning og ydeevne kontrollerer cellesorteringen i henhold til producentens specifikationer.
- Opsæt en hierarkisk gatingstrategi for at identificere FAP'er og MuSC'er (figur 2).
- Isoler FAP'er baseret på følgende skema: i) fremadrettet cellespredningsområde vs sidecellespredningsområde (FSC-A vs. SSC-A) for at adskille celler versus snavs, ii) sidecellespredningshøjde vs sidecellespredningsbredde (SSC-H vs. SSC-W) for at skelne singler fra dubletter i SSC-området, iii) fremadgående cellespredningshøjde vs fremadgående cellespredningsbredde (FSC-H vs. FSC-W) for at skelne singler fra dubletter i FSC-området, og iv) 7-AAD-område vs SSC-A for at skelne mellem levende versus døde celler.
- Hvis du isolerer FAP'er gennem den antistofbaserede metode, skal du bruge følgende skema: v) APC-CD45/CD31-området vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1)-området for at udelukke CD31+- og CD45+-celler fra yderligere analyse, og vi) PE-Cy7-VCAM-1-området vs PE-α7-Integrin-området fra CD31-/CD45-/Sca1+-populationen for at skelne mellem PAP'er. FAP'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-events.
- Hvis du isolerer FAP'er gennem endogen GFP-reportermetode, skal du bruge følgende skema: v) APC-CD45/CD31-område vs GFP-PDGFRα-område for at udelukke CD31+ og CD45+ celler fra yderligere analyse og isolere GFP+ celler. FAP'er identificeres som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events.
- Isoler MuSC'er baseret på følgende skema: i) fremadrettet cellespredningsområde vs sidecellespredningsområde (FSC-A vs. SSC-A) for at adskille celler versus snavs, ii) sidecellespredningshøjde vs sidecellespredningsbredde (SSC-H vs. SSC-W) for at skelne singler fra dubletter i SSC-området, iii) fremadgående cellespredningshøjde vs fremadgående cellespredningsbredde (FSC-H vs. FSC-W) for at skelne singler fra dubletter i FSC-området, iv) 7-AAD-område vs SSC-A for at skelne levende vs døde celler, v) APC-CD45/CD31-område vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) område for at udelukke CD31+ og CD45+ celler fra yderligere analyse, og vi) PE-Cy7-VCAM-1 område vs PE-α7-Integrin område fra CD31-/CD45-/Sca1-populationen for at skelne mellem MuSC'er. MuSC'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-hændelser.
- Isoler FAP'er baseret på følgende skema: i) fremadrettet cellespredningsområde vs sidecellespredningsområde (FSC-A vs. SSC-A) for at adskille celler versus snavs, ii) sidecellespredningshøjde vs sidecellespredningsbredde (SSC-H vs. SSC-W) for at skelne singler fra dubletter i SSC-området, iii) fremadgående cellespredningshøjde vs fremadgående cellespredningsbredde (FSC-H vs. FSC-W) for at skelne singler fra dubletter i FSC-området, og iv) 7-AAD-område vs SSC-A for at skelne mellem levende versus døde celler.
- Kør den ufarvede kontrol- og levedygtighedskontrol for at sikre, at cellepopulationen er korrekt placeret i SSC-A vs FSC-A-plottet og for korrekt at gate på levende enkeltceller.
- Anskaf alle enkeltfarvede kontroller, og generer spilloverkompensationsmatrixen.
- Kør alle FMO-kontroller, og bestem skæringspunktet mellem baggrundsfluorescensspredning og den positivt farvede befolkning.
- Ca. 5-10 minutter før erhvervelse af den eksperimentelle prøve tilsættes 7-AAD levedygtighedsfarvestof og blandes forsigtigt.
- Når alle kontroller er blevet behandlet, skal du indstille sorteringsportene i overensstemmelse med FMO-kontrollerne; erhverve og sortere de eksperimentelle prøver.
- Når alle prøver er behandlet, skal du rengøre cytometeret i henhold til producentens specifikationer. Eksporter alle .fcs-data til analyse.
7. Kultur af FAP'er og MuSC'er
BEMÆRK: Sorterede celler skal dyrkes umiddelbart efter sortering i et passende medium på kollagen I belagte plader.
- Opsamlingsrørene centrifugeres i en rotor med fast vinkel ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten uden at forstyrre cellepellet.
- For MuSC's dyrkning resuspenderes cellerne i et passende volumen MuSC-kulturmedium og inkuberes under standardbetingelser ved 37 °C og 5 % CO2.
- Plade friskisolerede MuSC'er ved en tæthed på 20.000 celler / cm 2 og aktiverede MuSC'er ved en densitet på 15.000 celler / cm2.
- Efter plettering forekommer cellerne små, sfæriske og gennemskinnelige. Inden for 36 timer klæber MuSC'er til pladens overflade og øger langsomt deres størrelse i de første 48 timer.
- Udskift mediet hver 2. dag.
BEMÆRK: MuSC'er er meget følsomme over for celletæthed. For at holde MuSC'er i deres voksende tilstand skal du dyrke dem, indtil de er 60% -70% sammenflydende. Passage cellerne i nyt kollagen Jeg belagte retter eller tallerkener og tilsæt nyt frisk medium hver 2. dag. Hvis MuSC'er opbevares i samme skål eller tallerken i mere end 3-4 dage, får de en langstrakt form og vil tilpasse sig naboceller, indtil de smelter sammen.
- For FAP's dyrkning resuspenderes cellerne i et passende volumen MuSC-kulturmedium, og de inkuberes under standardbetingelser ved 37 °C og 5 % CO2.
- Plade FAP'erne isoleret fra uforstyrret muskel ved en tæthed på 15.000 celler / cm 2 og FAP'er isoleret fra skadet muskel ved 9.000 celler / cm2.
BEMÆRK: Efter plettering klæber FAP'er fuldstændigt til pladens overflade inden for 48 timer, mens aktiverede FAP'er fastgøres til pladen inden for få timer. Når de er fastgjort, får FAP'er deres karakteristiske form med en lille cellekrop og aflange celleprocesser, og de spredes hurtigt. - Udskift mediet hver 2. dag.
BEMÆRK: FAT'er er meget følsomme over for celletæthed. Såning af FAP'er ved lave tætheder kan føre til dårlig cellevækst og celledød. Tværtimod vil plettering af FAP'er ved høj såtæthed øge celleoverlevelsen og forbedre deres ekspansion. FAP'er, der stammer fra beskadiget muskel, kræver normalt lavere celletæthed end ubeskadiget muskel, da de allerede er aktiveret. Det anbefales at justere FAP-belægningstætheden baseret på ens eksperimentelle betingelser og på kilden til prøverne.
- Plade FAP'erne isoleret fra uforstyrret muskel ved en tæthed på 15.000 celler / cm 2 og FAP'er isoleret fra skadet muskel ved 9.000 celler / cm2.
- For samdyrkning resuspenderes FAP'er og MuSC'er i kokulturmediet i forholdet 1:1, og de inkuberes under standardbetingelser ved 37 °C og 5 % CO2. Lad cellerne fastgøre i 48 timer og udskift mediet hver 2. dag.
8. Immunofluorescensanalyse af dyrkede FAP'er og MuSC'er
- Aspirer cellemediet og udfør to eller tre vaske med 1x PBS.
- Fix cellerne med 2% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 15 minutter ved RT.
- Aspirer 2% PFA og vask hurtigt cellerne to eller tre gange med 1x PBS.
- Udfør cellepermeabilisering og blokering:
- Til immunfarvning af frisk isolerede FAP'er udføres cellepermeabilisering og blokering ved at inkubere celler med 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% bovin serumalbumin (BSA) + 5% Normal Donkey Serum (NDS) i 30 minutter ved RT.
- Til immunfarvning af frisk isolerede MuSC'er udføres cellepermeabilisering og blokering ved at inkubere celler med PBST + 1% BSA + 5% Normal Goat Serum (NGS) i 30 minutter ved RT.
- Anvend primære antistoffer:
- Til immunfarvning af friskisolerede FAP'er påføres gedeanti PDGFRα primært antistof (1:300) fortyndet i PBST + 1% BSA + 5% NDS natten over ved 4 °C.
- Til immunfarvning af friskisolerede MuSC'er påføres museanti Pax7 primært antistof (1:10) fortyndet i PBST + 1% BSA + 5% NGS i 45 minutter ved RT.
- Cellerne vaskes to eller tre gange med 1x PBS for at fjerne den primære antistofopløsning.
- Påfør sekundære antistoffer:
- Til immunfarvning af frisk isolerede FAP'er påføres æsel-anti-ged IgG (H + L) Alexa Fluor 488 sekundært antistof (1:500) fortyndet i PBST + 1% BSA i 1 time ved RT.
- Til immunfarvning af friskisolerede MuSC'er påføres gedeantimus IgG 1 Alexa Fluor 555 sekundært antistof (1:500) fortyndet i PBST +1 % BSA i 45 minutter ved RT.
- Cellerne vaskes to eller tre gange med 1x PBS for at fjerne den primære antistofopløsning.
- Udfør nuklear modfarvning ved at inkubere celler med DAPI i PBST (1:1000) i 5 minutter ved RT.
- Cellerne vaskes tre gange med 1x PBS for at fjerne DAPI-opløsningen.
FORSIGTIG: DAPI er giftig og farlig; Håndter det med omhu og bortskaf det i flasken med farligt affald. - Cellerne opbevares ved 4 °C beskyttet mod lyset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol tillader isolering af ca. en million FAP'er og op til 350.000 MuSC'er fra uskadte bagben af voksne vildtypemus (3-6 måneder), svarende til et udbytte på 8% for FAP'er og 3% for MuSC'er af samlede begivenheder. Ved sortering af celler fra beskadiget TA 7 dage efter skade samles to til tre TA-muskler for at opnå op til 300.000 FAPs og 120.000 MuSC'er, hvilket svarer til et udbytte på henholdsvis 11% og 4%. Renhedsværdier efter sortering er normalt over 95% for FAP'er og MuSC'er.
Den gatingstrategi, der er vedtaget for at isolere FAP'er og MuSC'er, er illustreret i figur 2. For det første identificeres cellepopulationer af interesse ved at skabe et fremadrettet scatter (FSC) versus side scatter (SSC) tæthedsplot, hvilket giver mulighed for en vis grad af cellulær identifikation baseret på cellemorfologiske egenskaber. Denne gating-strategi bruges også til at udelukke små cellulære affald, som normalt er placeret i nederste venstre hjørne af FSC vs SSC-plottet. Celler er yderligere gated for at udelukke dubletter baseret på FSC og SSC højde og bredde signaler, og de resulterende singlet celler farves derefter med 7-AAD for at evaluere deres levedygtighed. Levende celler vurderes yderligere for Sca1- og CD31/CD45-ekspression for at udelukke afstamningspositive celler fra yderligere analyse. Afstamningsnegative Sca1-negative singlets farves derefter til VCAM-1 og α7-Integrin for at skelne mellem FAP'er og MuSC'er. FAP'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler, og MuSC'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-celler. Alternativt er levende celler også gated for CD31 / CD45 og GFP-PDGFRα for at skelne FAP'er. FAP'er identificeres som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler.
Denne protokol præsenterer to gatingstrategier til isolering af FAP-populationen: enten ved hjælp af en endogen PDGFRα-EGFP-reporter eller ved at udføre cellefarvning med et Sca1-antistof. PDGFRα-EGFP knock-in reportermus (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 udtrykker H2B-eGFP-fusionsgenet fra det endogene PDGFRα-sted, hvilket muliggør effektiv og specifik mærkning af PDGFRα-afstamningen (figur 3A). Denne muselinje blev tidligere brugt til at isolere Pdgfrα+ FAP'er og er faktisk meget nyttig til isolering af FAP'er, da GFP-reporteren giver et meget synligt og specifikt signal19. Alternativt beskriver denne protokol en Sca1-baseret isolationsmetode til identifikation af FAP'er. Sca1 (Ly-6A / E) er almindeligt anvendt til at identificere og isolere FAPs i muskelpræparat13,16,17. Sca1 er et 18-kDa glycosylphosphatidylinositol (GPI) -bundet proteinmedlem af Ly-6-familien20. Udover at blive udtrykt på celleoverfladen af mesenkymale stamceller, observeres Sca1-ekspression også i hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) såvel som modne leukocytter og T-celler. I denne protokol bekræftede vi egnetheden af Sca1 som FAPs markør ved at udføre FACS-baserede afstamningssporingsundersøgelser. Specifikt blev PDGFRα-EGFP-mus anvendt til at isolere Sca1 + / GFP-ekspressive FAP'er blandt populationer af mononukleerede celler. Vi konstaterede, at alle GFP-ekspressive celler også var positive for Sca1 og negative for CD31, CD45, VCAM-1 og α7-Integrin (figur 4). Denne analyse bekræftede brugen af Sca1-antistof som markør for FAP'er i både hvilende og aktiverede FAP'er og giver mulighed for utydelig brug af begge strategier til at isolere FAP'er.
I denne protokol blev FAP'er og MuSC'er også isoleret fra voksne mus, der blev skadet med intramuskulære injektioner af Notexin, 7 dage efter skaden (figur 5). Efter skader aktiveres og spredes MuSC'er og FAP'er in vivo og når toppen af spredning mellem dag 3 og 4 2,3. Disse ændringer i proliferation afspejles af en stigning i procentdelen af Sca1/PDFGRα samt VCAM-1/α7-Integrin positive celler. Figur 6 viser kvantificeringen af FAP'er og MuSC'er i uskadte og 7 dage efter skades-TA'er; Selvom toppen i spredning observeres mellem dag 2 og 3 efter skade, er en lav grad af prolifererende celler stadig mærkbar 7 dage efter skade. Da MuSC'er aktiveres, er der en markant stigning i deres cellulære størrelse21,22. Derfor, mens du isolerer disse celler af FACS, er det af afgørende betydning at justere FSC-A og SSC-A parametre og udvide porten til at omfatte disse celler i midten (figur 5A).
Renheden af de isolerede cellepopulationer blev bekræftet ved immunfarvning af kokulturerede GFP + FAP'er og MuSC'er med Pax7-antistoffer. Friskisolerede GFP+ FAP'er og MuSC'er blev samdyrket i 48 timer i forholdet 1:1 (figur 3B). GFP + FAP'er udtrykte ikke Pax7-markør, mens MuSC'er reagerede med dette antistof. Således er Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- og Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ gating-strategi effektiv til at isolere rene populationer af henholdsvis FAP'er og MuSC'er.
Figur 1: Grafisk oversigt over FAP- og MuSC-isolering. Grafisk oversigt, der viser FAP og MuSC isolering fra bagbensmuskler. Protokollen gælder også for celler isoleret fra TA-muskler. For det første opsamles musklerne og hakkes mekanisk, inden de gennemgår enzymatisk fordøjelse. Muskelblandingen behandles derefter gennem en 20 G nål og filtreres for at opnå en suspension af mononukleerede celler. Celler inkuberes derefter med en cocktail af fluorophorekonjugerede antistoffer og løber i sidste ende gennem en cellesorterer for at isolere en ren population af FAP'er og MuSC'er. Rene cellepopulationer behandles derefter til downstream-anvendelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ FACS-profil for hvilende FAP'er og MuSC'er. (A-H) Gating-strategi for isolering af FAP'er og MuSC'er. (A) For det første er prøver gated for at udelukke cellulært affald og (B, C) dubletter baseret på SSC- og FSC-egenskaber. (D) De resulterende enkeltceller farves derefter med 7-AAD for at evaluere deres levedygtighed. (E) 7-AAD negative enkeltceller vurderes derefter for APC-CD31/CD45 og Pacific Blue-Sca1 for at udelukke afstamningspositive celler fra yderligere analyse. (F,G) Afstamningsnegative singlets farves derefter til PE-Cy7-VCAM-1 og PE-α7-Integrin. (F) FAP'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler, og (G) MuSC'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-celler. H) FAPs isolation i PDGFRα-EGFP mus ved hjælp af en GFP reporter. (I-M) FACS-profil for Fluorescence Minus One (FMO) kontroller for at demonstrere korrekt kompensation og gating. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering af FAP- og MuSC-cellekultur. (A) Nyligt isolerede FAP'er, der udtrykker GFP, blev belagt og co-farvet med et PDGFRα-antistof. Kerner blev farvet med DAPI. Flettede billeder af GFP (grøn), PDGFRα (rød) og DAPI (blå) farvning vises. Skalastænger, 25 μm. (B) Friskisolerede FAP'er (grøn) og MuSC'er blev cokultureret i 48 timer og farvet med Pax7 (rød). Kerner blev farvet med DAPI. GFP-udtrykkende FAP'er udtrykker ikke Pax7, mens MuSC'er udelukkende udtrykker Pax7 og ikke er positive for GFP, hvilket bekræfter renheden af begge sorterede populationer. Skala stænger, 75 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: PDGFRα-EGFP-mus og Sca1-ekspression mærker specifikt FAP'er hos voksne mus. FAPs isoleres som GFP + / Sca1 + celler. 7-AAD-negative enkeltceller vurderes for APC-CD31/CD45 og GFP-PDGFRα for at udelukke afstamningspositive celler og skelne mellem FAP'er. Afstamningsnegative/Sca1-positive celler farves til PE-Cy7-VCAM-1 og PE-α7-Integrin for at udelukke MuSC'er. FAP'er identificeres som CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentativ FACS-profil for aktiverede FAP'er og MuSC'er. (A-H) Gating-strategi til isolering af aktiverede FAP'er og MuSC'er. (A) Prøver er gated for at udelukke cellulært affald ved at skabe FSC-A vs SSC-A tæthedsplot. Bemærk den udvidede port for at imødekomme befolkningen af interesse. (B,C) Prøver er yderligere gated for at eliminere dubletter baseret på SSC- og FSC-egenskaber. (D) De resulterende enkeltceller farves derefter med 7-AAD for at evaluere deres levedygtighed. (E) 7-AAD negative enkeltceller vurderes derefter for APC-CD31/CD45 og Pacific Blue-Sca1 for at udelukke afstamningspositive celler fra yderligere analyse. (F,G) Afstamningsnegative singlets farves derefter til PE-Cy7-VCAM-1 og PE-α7-integrin. (F) FAP'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin-celler, og (G) MuSC'er identificeres som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+-celler. H) FAPs isolation i PDGFRα-EGFP mus ved hjælp af en GFP reporter. (I-M) FACS-profil for Fluorescence Minus One (FMO) kontroller for at demonstrere korrekt kompensation og gating. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kvantificering af FAP'er og MuSC'er i uforstyrrede og skadede TA'er. Kvantificering af FAP'er og MuSC'er i uskadte og 7 dage efter skade TA-muskler. Celletælling blev udført ved at dividere antallet af celler sorteret pr. mg muskel opsamlet. ** P < 0,01 mellem uskadt og tilskadekomne. Klik her for at se en større version af denne figur.
| 7-AAD (μg/ml) |
CD31/CD45-APC (μg/ml) |
Sca1-Pacific Blå (μg/ml) |
α 7-Integrin-PE (μg/ml) |
VCAM-1-Biotin (μg/ml) |
PE-Cy7 Streptavidin (μg/ml) |
||
| Ufarvet kontrol | |||||||
| Enkelt farvede kontroller | |||||||
| 7-AAD (levedygtighedskontrol) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| Sca1 | 5 | ||||||
| α7-Integrin | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMO-kontroller | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Eksperimentel prøve | |||||||
| Fuld plet | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tabel 1: Matrix til farvning af antistoffer. Liste over antistofkoncentrationer, der anvendes til farvning af forsøgs- og kontrolprøverne. Hvis FAP'er isoleres af GFP, kan Sca1-farvning udelades. Kør i stedet GFP single stained control og GFP FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etablering af effektive og reproducerbare protokoller til identifikation og isolering af rene voksne stamcellepopulationer er det første og mest kritiske skridt i retning af at forstå deres funktion. Isolerede FAP'er og MuSC'er kan bruges til at udføre multiomics-analyse i transplantationseksperimenter som en potentiel behandling af muskelsygdomme eller kan genetisk modificeres til sygdomsmodellering i stamcelleterapi.
Protokollen, der er beskrevet her, giver standardiserede retningslinjer for identifikation, isolering og kultur af FAP'er og MuSC'er opnået fra bagbensmuskler hos voksne mus. Rene populationer af FAP'er og MuSC'er blev isoleret ved hjælp af en FACS-baseret teknik, og deres renhed blev efterfølgende vurderet ved immunfarvningsceller med specifikke celleoverflademarkører og genetiske midler.
Protokollen består af tre hovedafsnit, der i høj grad påvirker udbyttet af FAP'er og MuSC'er: den mekaniske og enzymatiske muskelfordøjelse, dannelsen af en mononukleeret cellesuspension gennem 20 G-nålen og den endelige isolering af enkeltceller gennem FACS.
Udførelse af korrekt muskelhakning er af afgørende betydning for at frigive enkeltceller. Der skal lægges vægt på dette trin, da det at nå den optimale størrelse af muskelstykkerne efter hakning gør det muligt for de enzymer, der anvendes til fordøjelsen, at fungere bedst og forhindrer tilstopning af nålen, der blev brugt i trin 4.1. På den anden side kan overhakning af musklen resultere i dårligt celleudbytte og nedsat cellelevedygtighed, da MuSC'er hurtigt frigives under den første fordøjelse og kan aspireres i trin 3.7.2 eller 3.8.214. Derudover påvirker effektiviteten af de enzymer, der anvendes til fordøjelsen af muskelpræparatet, også kvaliteten af den enzymatiske dissociation, da der kan være variation mellem forskellige enzympartier eller et fald i enzymernes aktivitet med tiden23. Derfor anbefales det at teste hvert parti enzymer for at optimere fordøjelsestidspunktet og koncentrationen. Desuden kan koncentrationen og den tid, der kræves for at fordøje musklen, også påvirkes af patologiske tilstande, der påvirker muskelstivhed. Disse særlige forhold vil kræve individuel optimering.
Den sidste generation af mononukleerede celler sker ved at køre suspensionen gennem en 10 ml sprøjte med en 20 G nål. Der skal udvises særlig omhu, når du udfører dette trin for at minimere antallet af bobler, der dannes, da deres sprængning forårsager yderligere celleskader24.
Cellesuspensionen farves derefter med en antistofcocktail og erhverves med en cellesorterer. At indstille de rigtige porte er et andet kritisk skridt. Når du udfører disse eksperimenter, anbefales det kraftigt at køre de anførte enkeltfarvede kontroller og FMO-kontroller for korrekt at kompensere for emissionsafsmitning og tage højde for baggrundssignalet på grund af spilloverspredning. Dette er især vigtigt, når man beskæftiger sig med lyse fluorescerende proteiner som GFP og indirekte pletter som VCAM-1-biotin / Stretpavidin-PE-Cy7-komplekset.
Desuden er det god praksis at udføre en titrering af de antistoffer, der anvendes til at detektere populationer af interesse, inden dette eksperiment udføres for første gang. Bestemmelse af den optimale koncentration af antistofferne er et kritisk skridt for at sikre det lyseste signal fra den positive befolkning og undgå stigningen i baggrundsfarvning.
Når sorteringen er afsluttet, er det vigtigt at udføre en eftersorteringsanalyse på de sorterede celler for at bestemme deres renhed og levedygtighed. Udbyttet og levedygtigheden af de sorterede celler påvirkes i høj grad af den tid, der kræves for at behandle prøven, og bør tages i betragtning, når man planlægger at behandle flere mus. Desuden kan opbevaring af de sorterede celler på is i 2x serumberigede medier hjælpe cellegendannelse og forbedre deres levedygtighed.
I denne protokol blev FAP'er og MuSC'er isoleret fra tibialis forreste muskler hos uskadte mus samt 7 dage efter Notexin-injektion. Efter en akut skade er forskellige FAP- og MuSC-underpopulationer blevet rapporteret at være forbigående udtrykt i det regenererende muskelvæv. Malecova og kolleger har rapporteret tilstedeværelsen af en underpopulation af VCAM-1, der udtrykker FAP'er, der er fraværende i ubeskadiget muskel, toppede mellem dag 2 og 3 efter skade ved akut betændelse og vedvarede i murine dystrofiske mus13. Tilsvarende har Kafadar og kolleger rapporteret en forbigående stigning i ekspressionen af Sca1 på en lille delmængde af myogene forfædre 2 dage efter skade25. Imidlertid blev Sca1+ myogene celler kraftigt nedsat 3 dage efter skade25. Tilstedeværelsen af disse delpopulationer bør anerkendes og overvejes, når denne protokol anvendes til at isolere FAP'er og MuSC'er på tidligere stadier.
Sammenfattende beskriver denne protokol en metode til isolering og dyrkning af en ren population af FAP'er og MuSC'er isoleret fra enten sunde eller skadede voksne musemuskler. Cellernes høje renhed og levedygtighed gør denne protokol velegnet til yderligere downstream-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology) for råd om MuSC-isolation. Dette arbejde blev finansieret af NIAMS-IRP gennem NIH-tilskud AR041126 og AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
