Summary
הזיהוי המדויק של תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ותאי גזע של שרירים (MuSCs) הוא קריטי לחקר תפקודם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מספק הנחיות לבידוד, לטיהור ולתרבות של FAPs ו-MuSCs משרירי עכברים בוגרים.
Abstract
תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם אוכלוסייה של תאים סטרומליים מזנכימליים (MSCs) המתגוררים בשרירי השלד, המסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית. יחד עם תאי גזע של שרירים (MuSCs), FAPs ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס שרירים, בשיקום ובהתחדשות, תוך שמירה פעילה ועיצוב מחדש של המטריצה החוץ-תאית (ECM). במצבים פתולוגיים, כגון נזק כרוני ודיסטרופיות שרירים, FAPs עוברים הפעלה חריגה ומתמיינים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לפיברוזיס ולחדירת שומן תוך שרירית. לפיכך, FAPs ממלאים תפקיד כפול בהתחדשות שרירים, בין אם על ידי שמירה על תחלופת MuSC וקידום תיקון רקמות או תרומה ליצירת צלקות פיברוטיות וחדירת שומן חוץ רחמי, הפוגעים בשלמות ובתפקוד של רקמת שריר השלד. טיהור נכון של FAPs ו- MuSCs הוא תנאי מוקדם להבנת התפקיד הביולוגי של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים כמו גם בתנאים פתולוגיים. במאמר זה נתאר שיטה מתוקננת לבידוד סימולטני של FAPs ו-MuSCs משרירי גפיים של עכברים בוגרים באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS). הפרוטוקול מתאר בפירוט את הדיסוציאציה המכנית והאנזימטית של תאים חד-גרעיניים משרירי גפיים שלמות ומשרירי טיביאליס קדמיים (TA) פצועים. FAPs ו-MuSCs מבודדים לאחר מכן באמצעות סדרן תאים אוטומטי למחצה כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהורות. בנוסף, אנו מתארים שיטה אופטימלית לגידול FAPs ו-MuSCs שקטים ומופעלים, לבד או בתנאי קולקולטורה.
Introduction
שריר השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף, המהווה ~ 40% ממשקל האדם הבוגר, והוא אחראי על שמירה על יציבה, יצירת תנועה, ויסות חילוף החומרים של האנרגיה הבסיסית וטמפרטורת הגוף1. שרירי השלד הם רקמה דינמית מאוד ובעלת יכולת יוצאת דופן להסתגל למגוון גירויים, כגון לחץ מכני, שינויים מטבוליים וגורמים סביבתיים יומיומיים. בנוסף, שריר השלד מתחדש בתגובה לפגיעה חריפה, מה שמוביל לשיקום מלא של המורפולוגיה והתפקודים שלו2. פלסטיות שרירי השלד מסתמכת בעיקר על אוכלוסייה של תאי גזע שריריים תושבים (MuSCs), המכונים גם תאי לוויין, הממוקמים בין קרום הפלזמה של מיופייבר לבין הלמינההבסיסית 2,3. בתנאים רגילים, MuSCs שוכנים בנישת השרירים במצב שקט, עם חלוקות מעטות בלבד כדי לפצות על תחלופת התאים ולחדש את מאגר תאי הגזע4. בתגובה לפציעה, MuSCs נכנסים למחזור התא, מתרבים, ותורמים ליצירת סיבי שריר חדשים או חוזרים לנישה בתהליך התחדשות עצמית 2,3. בנוסף ל-MuSCs, תחזוקה הומאוסטטית והתחדשות של שרירי השלד מסתמכים על תמיכתה של אוכלוסייה של תאי שריר מקומיים הנקראים אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs)5,6,7. FAPs הם תאים סטרומליים מזנכימליים המוטבעים ברקמת החיבור לשריר ומסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית 5,8,9,10. FAPs מספקים תמיכה מבנית ל-MuSCs מכיוון שהם מקור לחלבוני מטריצה חוץ-תאית בנישת תאי הגזע של השריר. FAPs גם מקדמים תחזוקה ארוכת טווח של שרירי השלד על ידי הפרשת ציטוקינים וגורמי גדילה המספקים תמיכה טרופית למיוגנזה ולצמיחת שרירים 6,11. לאחר פגיעה חריפה בשריר, FAPs מתרבים במהירות כדי לייצר נישה חולפת התומכת בשלמות המבנית של השריר המתחדש ומספקת סביבה חיובית לקיום התפשטות והתמיינות של MuSCs באופן פרקריני5. עם התקדמות ההתחדשות, FAPs מנוקים מהשריר הרגנרטיבי על ידי אפופטוזיס, ומספרם חוזר בהדרגה לרמה בסיסית12. עם זאת, בתנאים המעדיפים פגיעה כרונית בשרירים, FAPs גוברים על איתות פרו-אפופטוטי ומצטברים בנישת השרירים, שם הם מתבדלים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לחדירת שומן חוץ רחמי וליצירת צלקת פיברוטית12,13.
בשל הרב-פוטנטיות שלהם ויכולות ההתחדשות שלהם, FAPs ו- MuSCs זוהו כמטרות פוטנציאליות ברפואה רגנרטיבית לטיפול בהפרעות בשרירי השלד. לכן, כדי לחקור את תפקודם ואת הפוטנציאל הטיפולי שלהם, חשוב ליצור פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור עבור בידוד ותרבות של FAPs ו- MuSCs.
מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) יכול לזהות אוכלוסיות תאים שונות על סמך מאפיינים מורפולוגיים כגון גודל וגרעיניות, ומאפשר בידוד ספציפי לתא בהתבסס על שימוש בנוגדנים המכוונים נגד סמני פני השטח של התא. בעכברים בוגרים, MuSCs מבטאים את מולקולת הידבקות תאי כלי הדם 1 (VCAM-1, הידועה גם בשם CD106)14,15 ו-α7-Integrin15, בעוד ש-FAPs מבטאים את α הקולטן של גורם הגדילה שמקורו בטסיות (PDGFRα) ואת האנטיגן של תאי הגזע 1 (Sca1 או Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . בפרוטוקול המתואר כאן, MuSCs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, בעוד ש-FAPs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. לחלופין, נעשה שימוש בעכברי PDGFRαEGFP כדי לבודד FAPs כ-CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- אירועים18,19. יתר על כן, השווינו את החפיפה בין האות הפלואורסצנטי של תאי PDGFRα-GFP+ לתאים שזוהו על ידי סמן פני השטח Sca1. הניתוח שלנו הראה כי כל התאים המבטאים GFP היו חיוביים גם עבור Sca1, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בכל אחת מהגישות לזיהוי ובידוד של FAPs. לבסוף, צביעה עם נוגדנים סמנים ספציפיים אישרה את הטוהר של כל אוכלוסיית תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים שבוצעו נערכו בהתאם להנחיות מוסדיות שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים (ACUC) של המכון הלאומי לדלקת פרקים, שלד-שריר ומחלות עור (NIAMS). חוקרים המבצעים פרוטוקול זה חייבים לציית להנחיות האתיקה המקומיות שלהם לגבי בעלי חיים.
הערה: פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לבודד FAPs ו- MuSCs משרירי הגפיים האחוריות והשרירים הקדמיים (TA) של עכברים זכרים ונקבות בוגרים (3-6 חודשים) ומספק הנחיות לשילוב FAPs ו- MuSCs. סקירה כללית של הליך הניסוי מוצגת באיור 1. כל השלבים של פרוטוקול זה צריכים להתבצע בתנאים סטריליים ובטמפרטורת החדר (RT) אלא אם צוין אחרת.
1. הגדרת מגיב
- Wash Medium (WM): הכן פתרון זה על-ידי הוספת סרום סוסים 10% (vol/vol) ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין למדיית התאים המזינים F-10 של Ham. WM יכול להיות מוכן מראש ומאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- מאגר דיסוציאציה לשרירים (MDB): הכינו את המאגר הזה על ידי המסת קולגן II בזיכרון העבודה. אם אתם אוספים שרירי גפיים אחוריות שלמות, יש להמיס 1000 U/mL Collagenase II ב-10 מ"ל של זיכרון עבודה עבור כל עכבר (כדי להכין אותו לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל). אם אתם אוספים שרירי TA, יש להמיס 800 U/mL Collagenase II ב-7 מ"ל של זיכרון עבודה עבור כל עכבר (כדי להכין אותו לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל). עבור שרירי TA, זה יעזור לדמיין טוב יותר כדורי תאים ולקבל תשואה גבוהה יותר של FAPs ו- MuSCs. הכינו MDB טרי לפני איסוף השרירים ושמרו אותו על הקרח עד הצורך.
- מלאי תמיסות קולגןאז II: הכן תמיסה זו על-ידי המסת קולגןאז II בתמיסת תמיסת מלח סטרילית 1x עם פוספט (PBS) לריכוז סופי של 1000 U/mL. סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ו aliquot לתוך 1 מ"ל מניות. אחסן את הפתרון ב-20°C-.
- מלאי תמיסות Dispase: הכן תמיסה זו על-ידי המסת Dispase ב-PBS סטרילי 1x לריכוז סופי של 11 U/mL. סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ו aliquot לתוך 1 מ"ל מניות. אחסן את הפתרון ב-20°C-.
- הכינו את מדיום התרבית של FAP על ידי מתן תוסף DMEM עם סרום בקר עוברי 10% (vol/vol), פניצילין/סטרפטומיצין אחד ו-FGF של 2.5 ננוגרם/מ"ל. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו את תוסף התרבית הבינוני F10 של MuSC עם סרום סוסים בנפח 10% (vol/vol), פניצילין/סטרפטומיצין אחד ו-2.5 ננוגרם/מ"ל FGF. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו את מדיום החקלאות על ידי תוספת DMEM עם 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי, 10% (vol/vol) סרום סוס, 1x פניצילין/סטרפטומיצין, ו-2.5 ng/mL FGF. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C.
2. קצירת שרירי גפיים אחוריות
- מוסיפים 2-3 מ"ל של זיכרון עבודה בכלי בקוטר 6 ס"מ (מנה אחת לכל עכבר) ומניחים על קרח.
- בצע המתת חסד על ידי חנק: הנח את העכבר בתא CO 2 והצג 100% CO2. השתמש נקע צוואר הרחם כדי לאשר מוות.
- הניחו את שכיבה של העכבר על משטח דיסקציה וריססו אותו ב-70% אתנול (vol/vol) כדי למנוע זיהום.
- השתמש במלקחיים כדי לצבוט את מרכז עור בטן העכבר ולחתוך פתח ~ 1 ס"מ אופקית. תפסו את קצוות הפצע והניחו את העכבר על ידי משיכת הפתח בכיוונים מנוגדים כדי לחשוף את השרירים שמתחת. חשוף צד אחד של הגפה האחורית של העכבר באותו זמן.
- לפני איסוף השרירים, להסיר שומן intermuscular בין hamstrings ואת הקצה הפרוקסימלי של quadriceps. זה ישפר את הבידוד של FAPs ו- MuSCs.
- מבלי לפגוע ברקמה, השתמש במלקחיים חדים כדי לשבור ולקלף את החיתולית כדי לחשוף את שרירי ה-TA וה-extensor digitorum longus (EDL). הפעל את הקצה החד של המלקחיים מתחת לשרירי ה- TA/EDL כדי לנתק את השרירים מהשוקה.
- חתכו את הגידים המחברים את ה-TA/EDL לקרסול, ותוך כדי החזקתו במלקחיים, חתכו את השרירים בעזרת מספריים לאורך קו האורך של ה-TA/EDL. חתכו את הגידים סביב הברך כדי לנתק את כל שרירי ה-TA/EDL. מניחים את השרירים בצלחת באורך 6 ס"מ שנשמרת על קרח.
- המשך לבודד את שרירי הגסטרוקנמיוס והסולאוס על ידי חיתוך כל הגידים בקרסול וניתוק השרירים מהטיביה והפיבולה. חותכים סביב הברך ומעבירים את השרירים לצלחת 6 ס"מ.
- מקלפים את החיתולית סביב הארבע ראשי ומפרידים אותה מעצם הירך על ידי הפעלת הקצה החד של המלקחיים בין השריר לעצם. חותכים את הגידים סביב הברך, ותוך כדי החזקת הארבע ראשי עם מלקחיים בקצה הדיסטלי, חותכים את שאר השריר על ידי חיתוך לאורך עצם הירך. מניחים את השרירים בצלחת 6 ס"מ.
- מנתקים את שרירי ההמסטרינג והשרירים הנותרים סביב עצם הירך ומעבירים אותם לצלחת שאורכה 6 ס"מ. לאסוף את שרירי הגפיים האחוריות בצלחת 6 ס"מ נשמר על קרח.
הערה: הימנעו מפגיעה בכלי הדם, במידת האפשר, כדי למנוע היווצרות של גושים בדם שעלולים להפריע לבידוד במורד הזרם. אם דימום מתרחשת, כתם כלי נכרת מיד עם גזה סטרילית כדי לספוג את הדם. - לאסוף TA, EDL, gastrocnemius, סולאוס, quadricep, ושרירי hamstring מן האיבר contralateral.
הערה: בעת בידוד כל שרירי הגפיים האחוריות, אין לאגד שני עכברים או יותר. אם מבודדים שרירי TA, ניתן לאגד עד שלושה שרירי TA.
3. עיכול שרירים מכני ואנזימטי
- שאפו WM מהמנה שגודלה 6 ס"מ והוסיפו 1-2 מ"ל של MDB כדי לשמור על לחות השרירים.
- טחנו את השרירים ביסודיות עד לקבלת משחה של רקמה טחונה היטב. כדי לעשות זאת, השתמש מלקחיים כדי להחזיק קצה אחד של חתיכת שריר, ולאחר מכן להשתמש באזמל כדי לקרוע ולחתוך את השריר עד פחות חזק.
- באמצעות מספריים, ממשיכים לחתוך את השריר לחתיכות קטנות למשך 1-2 דקות. חזור על שלב זה עבור כל קבוצת שרירים עד לקבלת בוצה שריר טחון היטב.
הערה: זהו צעד קריטי מאוד כדי למקסם את התשואה של FAPs ו- MuSCs. מומלץ להקדיש 8-10 דקות (4-5 דקות אם מבודדים את שרירי TA בלבד) בשלב זה כדי להבטיח טחינת שרירים תקינה. - העבירו את השרירים הטחונים מכל עכבר לצינור החרוטי המכיל MDB.
- אטמו את הצינורות עם סרט מעבדה ודגרו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה (75 סל"ד) למשך שעה. הנח את הצינורות אופקית לאורך נתיב הרעד והשתמש במשקולות כדי לשמור על הצינורות שקועים במים.
- הפשרה של 1 מ"ל של מלאי קולגןאז II ו-1 מ"ל של מלאי נפרד לכל עכבר. לפני השימוש, סובב את מלאי הפסולת ברוטור דלי מתנדנד ב 10,000 x g במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש רק בסופרנטנט.
- אם נאספו שרירי גפיים אחוריות שלמות, המשך באופן הבא:
- לאחר שעה אחת, הסר את הצינור מהשייקר ומלא אותו ל -50 מ"ל עם WM. הפוך בעדינות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב.
- צנטריפוגה של התאים ברוטור דלי מתנדנד ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו 42 מ"ל של סופרנטנט לשני צינורות חדשים (~ 21 מ"ל בכל צינור) והשאירו ~ 8 מ"ל בצינור המקורי.
- מלא את הצינורות החדשים המכילים 21 מ"ל של supernatant עד 50 מ"ל עם WM. צנטריפוגה את התאים שוב ברוטור דלי מתנדנד ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו את כל הסופר-נטנט ושמרו את הכדורים על הקרח.
- הוסף 1 מ"ל של מלאי collagenase II ו 1 מ"ל של מלאי dispase בצינור המקורי המכיל ~ 8 מ"ל של MDB.
- באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, יש להשעות את הכדור 10 פעמים ללא סתימה. להוציא את הפתרון לכיוון הקיר של הצינור, הימנעות היווצרות של בועות. אם מתרחשת סתימה במהלך ההדחה, דחפו את קצה הפיפטה כנגד תחתית הצינור כדי לשבש מכנית את גושי השריר. המשך לשלב 3.9.
- אם נאספו שרירי TA, בצע את הפעולות הבאות:
- לאחר שעה, הסר את הצינור מהשייקר ומלא אותם ל -15 מ"ל עם WM. הפוך בעדינות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב.
- צנטריפוגה של התאים ברוטור דלי מתנדנד ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר 13 מ"ל של supernatant לתוך צינור אחד חדש 15 מ"ל ולהשאיר ~ 2 מ"ל בצינור המקורי.
- מלא את הצינור החדש המכיל 13 מ"ל של supernatant עד 15 מ"ל עם WM. צנטריפוגה את התאים שוב ברוטור דלי מתנדנד ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו את כל הסופר-נטנט ושמרו את הכדור על הקרח.
- באמצעות קצה פיפטה של 1000 μL, יש לתלות מחדש את הכדור בצינור המקורי למעלה ולמטה מבלי לסתום.
- הוסף 1 מ"ל של מלאי Collagenase II ו- 1 מ"ל של מלאי dispase בצינור המקורי המכיל 2 מ"ל של MDB ומלא עד 10 מ"ל עם WM. המשך לשלב 3.9.
- אטמו את הצינורות עם סרט מעבדה ודגרו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה (75 סל"ד) למשך 30 דקות. מניחים את הצינורות כמו בשלב 3.5.
4. דור של תאים חד-גרעיניים
הערה: אם עובדים עם שרירי TA שנאספו בצינור חרוטי של 15 מ"ל, העבירו את המתלה לצינור חרוטי של 50 מ"ל לפני שתמשיכו לשלב 4.1.
- לאחר 30 דקות, הסר את הצינור מהשייקר. לשאוף ולהוציא את השעיית השריר באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 20 גרם בהצלחה 10 פעמים.
הערה: יש להוציא את מתלי השרירים לכיוון דופן הצינור כדי למנוע בועות וקצף. חתיכות קטנות של גידים או סחוסים לא מעוכלים עלולות לסתום את המחט במהלך הסיבובים הראשונים של השאיפה. אם מתרחשת סתימה, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר את הסתימה מקצה המחט. - מלא כל צינור עד 50 מ"ל עם WM והפוך בעדינות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב.
- צנטריפוגה של התאים ברוטור דלי מתנדנד ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו סופרנטנט לצינור חדש (~42 מ"ל) והשאירו ~8 מ"ל בצינור המקורי.
- מלא את הצינור החדש המכיל 42 מ"ל של supernatant עד 50 מ"ל עם WM. צנטריפוגה את התאים שוב ברוטור דלי מתנדנד ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו את כל הסופר-נטנט ושמרו את הכדור על הקרח.
- יש להניח מסננת תאי ניילון בקוטר 40 מ"ל בצינור החרוטי המקורי בגודל 50 מ"ל המכילה 8 מ"ל של זיכרון עבודה ולהרטיב מראש את מסננת התא ב-1-2 מ"ל של זיכרון עבודה.
- בעת החזקת מסננת תאי ניילון בגודל 40 מיקרומטר, השתמש בפיפטה של 10 מ"ל כדי להשהות בעדינות את הכדור 5-10 פעמים. סנן את הכדורים דרך מסננת התא בחזרה לאותה צינור כדי למזער את אובדן התאים.
- בשלב זה, ודא כי ישנם צינורות נוספים עם כדורי תאים על קרח. סנן את הכדורים האלה בחזרה לצינור המקורי על ידי הוספת 4-5 מ"ל של זיכרון עבודה לכל צינור כדי להשעות מחדש את הכדורים ולהעביר את התמיסה למסננת התא הממוקמת בצינור המקורי. אפשר סינון לפי כוח הכבידה.
- לאחר איסוף כל הכדורים לתוך הצינור החרוטי המקורי של 50 מ"ל, שטפו את מסננת התא עם עוד 4-5 מ"ל של זיכרון עבודה.
- מלאו כל צינור בזיכרון עבודה של עד 50 מ"ל והפכו בעדינות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב.
- צנטריפוגה של התאים ברוטור דלי מתנדנד ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מיד לשאוף את כל supernatant לאחר צנטריפוגה מבלי להפריע את הכדור.
- השהה את הכדור ב-600 μL של זיכרון עבודה והעבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל.
5. צביעת נוגדנים לציטומטריה של זרימה
הערה: עבור כל ניסוי, הגדר את הפקדים הבאים: i) בקרה לא מוכתמת, ii) בקרת כדאיות לבחירה עבור אוכלוסיית התאים החיים, iii) בקרות פיצוי מוכתמות בודדות לתיקון עבור זליגת פליטת פלואורוכרום, ו- iv) פלואורסצנציה פחות בקרות אחת (FMO) כדי לקבוע גבולות על ידי התחשבות בהתפשטות הזליגה. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה מלאה של פקדי צביעה.
- כדי להכין בקרה לא מוכתמת, העבר 10 μL של מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל המכיל 190 μL של WM. להשעות את מתלה התא ולסנן דרך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול התחתון עם מכסה מסננת תא 35 מיקרומטר. אפשרו למתלה לסנן לפי כוח הכבידה.
- השתמש פיפטה 200 μL כדי לאסוף את כל הנוזל מהחלק התחתון של מסננת התא. אטמו עם כובע והשאירו אותו על קרח, מוגן מפני אור.
- הכן בקרות כדאיות, FMO ופקדים מוכתמים יחידים: תייג 10 צינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 2 מ"ל והוסף 190 μL של זיכרון עבודה לכל צינור ו- 10 μL של תרחיף תאים. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה מלאה של פקדים. הוסף נוגדנים לצינור המתאים בהתאם לבקרת הניסוי. עיין בטבלה 1 לקבלת מידע לגבי שילוב וריכוז הנוגדנים.
- העבירו את שאר מתלי התא (500 μL) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל (צינור ניסוי) והוסיפו את הנוגדנים הבאים: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-ביוטין ו-α7-Integrin-PE. עיין בטבלה 1 לקבלת מידע לגבי שילוב וריכוז הנוגדנים.
- מערבבים היטב כל צינור כדי להבטיח פיזור אחיד ודוגרים את התאים בשייקר מסתובב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות מוגן מפני אור.
- לאחר 45 דקות, מלא את כל צינורות microcentrifuge עד 2 מ"ל עם WM. בעדינות להפוך את הצינורות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב מלא. צנטריפוגה הצינורות בצנטריפוגה מקוררת עם רוטור זווית קבועה ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופר-נאטנט מבלי להפריע לכדור.
- השהה את התאים בכל צינורות המיקרוצנטריפוגה ב-300 μL של זיכרון העבודה.
- יש להוסיף נוגדן סטרפטווידין לצינורות המתאימים. עיין בטבלה 1 לקבלת מידע לגבי שילוב וריכוז הנוגדנים. מערבבים היטב כל צינור כדי להבטיח פיזור אחיד ודוגרים את התאים בשייקר מסתובב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות המוגן מפני אור. השאירו את הצינורות הנותרים על קרח, מוגנים מפני האור.
- לאחר 20 דקות, מלאו צינורות מיקרוצנטריפוגה המכילים נוגדן סטרפטאבידין ל-2 מ"ל עם WM. הפכו בעדינות את הצינורות מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב מלא. צנטריפוגה הצינורות בצנטריפוגה מקוררת עם רוטור זווית קבועה ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופר-נאטנט לחלוטין והחזירו את התאים ל-300 μL של זיכרון העבודה.
- יש להרטיב מראש את מכסה המסננת של 35 מיקרומטר של 10 צינורות פוליסטירן בעלי תחתית עגולה של 5 מ"ל עם 200 מיקרוגרם של זיכרון עבודה (WM. סנן תאים מצינורות בקרה דרך צינורות הפוליסטירן העגולים-תחתונים המתאימים. השתמש פיפטה 200 μL כדי לאסוף את כל הנוזל מהחלק התחתון של מסננת התא. לאטום עם כובעים, להשאיר את הצינורות על קרח, ולהגן עליהם מפני אור.
- השהה את התאים בצינור הניסוי עם 200 μL נוספים של זיכרון עבודה עבור סך של 500 μL של WM. יש להרטיב מראש מכסה מסננת תאים של שפופרת בעלת תחתית עגולה של 5 מ"ל פוליסטירן עם 200 μL של זיכרון עבודה. העבירו את מתלה התא מצינור הניסוי לצינור בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל פוליסטירן ואפשרו לו לסנן לפי כוח הכבידה.
- שטפו את צינור המיקרוצנטריפוגה בגודל 2 מ"ל המכיל את מתלה הדגימה הניסיוני עם 300 μL של זיכרון עבודה והעבירו אותו דרך אותו מכסה מסננת. השתמש פיפטה 200 μL כדי לאסוף את כל הנוזל מהחלק התחתון של מסננת התא. אטמו עם כובע, השאירו צינורות על קרח והגנו עליהם מפני אור.
הערה: אם מתרחשת סתימה של מכסה המסננת של תא בגודל 35 מיקרומטר, הקש בעדינות על הצינור שעל הספסל כדי להקל על הזרימה. - הכן ותייג את צינורות האיסוף עבור FAPs ו- MuSCs. אם מבודדים תאים משרירי גפיים אחוריות שלמות, ממיינים את התאים בצינורות פוליפרופילן בעלי תחתית עגולה של 5 מ"ל עם עד 1 מ"ל של תרבית FAPs או MuSCs עם תוספת לסרום 2x. אם מבודדים תאים משרירי TA, ממיינים FAPs ו-MuSCs בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל המכילים עד 400 μL של מדיום תרבית בתוספת סרום 2x.
6. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)
הערה: פרוטוקול זה משתמש בציטומטר זרימה קומפקטי המצויד בזרבובית 100 מיקרומטר וכולל תצורה של שלושה לייזרים (488 ננומטר, 640 ננומטר, 405 ננומטר) עם יכולת לנתח עד תשעה פלואורוכרומים שונים (11 פרמטרים כולל פיזור קדימה וצד). הפלואורוכרומים המשמשים בפרוטוקול זה ומסנני פס הגלאי הקשורים אליהם הם כדלקמן: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; נגמ"ש 660/10; כחול פסיפיק 448/45; 7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. התאים ממוינים ב-4 מעלות צלזיוס ונשארים על קרח לאחר המיון. לפני הפעלת מכשיר זה, ודא שהמשתמש מאומן כראוי על ידי מומחה יישומים טכניים.
- הגדר וביצועים לבדוק את סדרן התאים בהתאם למפרט היצרן.
- הגדירו אסטרטגיית חיזוי היררכית כדי לזהות FAPs ו-MuSCs (איור 2).
- לבודד FAPs בהתבסס על הסכימה הבאה: i) אזור פיזור תא קדימה לעומת אזור פיזור תא צדדי (FSC-A לעומת SSC-A) כדי להפריד תאים לעומת פסולת, ii) גובה פיזור תא צדדי לעומת רוחב פיזור תא צדדי (SSC-H לעומת SSC-W) כדי להבחין בין סינגלטים לכפילים בטווח SSC, iii) גובה פיזור תא קדימה לעומת רוחב פיזור תא קדימה (FSC-H לעומת FSC-W) כדי להבחין בין סינגלטים לכפילים בטווח FSC, ו-4) אזור 7-AAD לעומת SSC-A כדי להבחין בין תאים חיים לעומת תאים מתים.
- אם אתה מבודד FAPs באמצעות השיטה המבוססת על נוגדנים, השתמש בסכימה הבאה: v) אזור APC-CD45/CD31 לעומת אזור פסיפיק כחול-Ly-6A/E (Sca1) כדי לא לכלול תאי CD31+ ו-CD45+ מניתוח נוסף, ו-vi) אזור PE-Cy7-VCAM-1 לעומת אזור PE-α7-Integrin מאוכלוסיית CD31-/CD45-/Sca1+ כדי להבחין בין FAPs. FAPs מזוהים כאירועי CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin.
- אם מבודדים FAPs באמצעות שיטת דיווח GFP אנדוגנית, השתמש בסכימה הבאה: v) אזור APC-CD45/CD31 לעומת אזור GFP-PDGFRα כדי לא לכלול תאי CD31+ ו- CD45+ מניתוח נוסף ולבודד תאי GFP+ . FAPs מזוהים כאירועי CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin.
- בידוד MuSCs בהתבסס על הסכימה הבאה: i) אזור פיזור תאים קדימה לעומת אזור פיזור תאים צדדיים (FSC-A לעומת SSC-A) כדי להפריד תאים לעומת פסולת, ii) גובה פיזור תא צדדי לעומת רוחב פיזור תא צדדי (SSC-H לעומת SSC-W) כדי להבחין בין סינגלטים לכפילים בטווח SSC, iii) גובה פיזור תא קדימה לעומת רוחב פיזור תא קדימה (FSC-H לעומת FSC-W) כדי להבחין בין סינגלטים לכפילים בטווח FSC, iv) אזור 7-AAD לעומת SSC-A כדי להבחין בין תאים חיים לעומת תאים מתים, v) אזור APC-CD45/CD31 לעומת אזור פסיפיק כחול-Ly-6A/E (Sca1) כדי לא לכלול תאי CD31+ ו-CD45+ מניתוח נוסף, ו-vi) אזור PE-Cy7-VCAM-1 לעומת אזור PE-α7-Integrin מאוכלוסיית CD31-/CD45-/Sca1- כדי להבחין בין MuSCs. MuSCs מזוהים כאירועי CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
- לבודד FAPs בהתבסס על הסכימה הבאה: i) אזור פיזור תא קדימה לעומת אזור פיזור תא צדדי (FSC-A לעומת SSC-A) כדי להפריד תאים לעומת פסולת, ii) גובה פיזור תא צדדי לעומת רוחב פיזור תא צדדי (SSC-H לעומת SSC-W) כדי להבחין בין סינגלטים לכפילים בטווח SSC, iii) גובה פיזור תא קדימה לעומת רוחב פיזור תא קדימה (FSC-H לעומת FSC-W) כדי להבחין בין סינגלטים לכפילים בטווח FSC, ו-4) אזור 7-AAD לעומת SSC-A כדי להבחין בין תאים חיים לעומת תאים מתים.
- הפעל את בקרת הבקרה והכדאיות הבלתי מוכתמת כדי להבטיח שאוכלוסיית התאים ממוקמת כראוי בחלקת SSC-A לעומת FSC-A וכדי לשער כראוי על תאים בודדים חיים.
- רכוש את כל הפקדים המוכתמים הבודדים וצור את מטריצת הפיצוי הנשפכת.
- הפעל את כל פקדי ה- FMO וקבע את נקודת החיתוך בין התפשטות פלואורסצנטיות ברקע לבין האוכלוסייה המוכתמת באופן חיובי.
- כ-5-10 דקות לפני רכישת הדגימה הניסיונית, מוסיפים צבע כדאיות 7-AAD ומערבבים בעדינות.
- לאחר עיבוד כל הבקרות, הגדר את שערי המיון בהתאם לפקדי ה- FMO; לרכוש ולמיין את דגימות הניסוי.
- לאחר עיבוד כל הדגימות, נקו את הציטומטר בהתאם למפרט היצרן. ייצא את כל נתוני .fcs לניתוח.
7. תרבות של FAPs ו- MuSCs
הערה: תאים ממוינים צריכים לעבור תרבית מיד לאחר המיון, במדיום מתאים על צלחות מצופות קולגן I.
- צנטריפוגה צינורות האיסוף ברוטור זווית קבועה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (60 °F).
- שאפו את הסופר-נטנט מבלי להפריע לכדור התא.
- עבור התרבית של MuSC, יש להשעות את התאים בנפח מתאים של תרבית MuSC ולדגור עליהם בתנאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
- צלחת MuSCs מבודדים טריים בצפיפות של 20,000 תאים לס"מ 2 ו- MuSCs מופעלים בצפיפות של 15,000 תאים לס"מ2.
- לאחר הציפוי, התאים נראים קטנים, כדוריים ושקופים. תוך 36 שעות, MuSCs נדבקים לפני השטח של הצלחת ומגדילים לאט את גודלם במשך 48 השעות הראשונות.
- החלף את המדיום כל יומיים.
הערה: MuSCs רגישים מאוד לצפיפות התאים. כדי לשמור על MuSCs במצב ההתרבות שלהם, לגדל אותם עד שהם 60%-70% נפגשו. מעבירים את התאים לקולגן חדש שציפיתי כלים או צלחות ומוסיפים מדיום טרי חדש כל יומיים. אם MuSCs נשמרים באותה צלחת או צלחת במשך יותר מ 3-4 ימים, הם יקבלו צורה מוארכת יתיישרו עם תאים שכנים עד להתמזגות יחד.
- עבור התרבית של FAP, יש להשעות את התאים בנפח מתאים של תרבית MuSC ולדגור עליהם בתנאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
- צלחת FAPs שבודדו משריר לא מבודד בצפיפות של 15,000 תאים לס"מ 2 ו- FAPs שבודדו משריר פצוע ב-9,000 תאים לס"מ2.
הערה: לאחר הציפוי, FAPs נדבקים לחלוטין לפני השטח של הצלחת תוך 48 שעות, בעוד FAPs מופעלים מתחברים לצלחת תוך מספר שעות. ברגע שהם מחוברים, FAPs לרכוש את הצורה האופיינית שלהם, עם גוף תא קטן ותהליכים תאים מוארכים, והם מתרבים במהירות. - החלף את המדיום כל יומיים.
הערה: FAPs רגישים מאוד לצפיפות התאים. זריעת FAPs בצפיפות נמוכה עלולה להוביל לצמיחת תאים לקויה ולמוות של תאים. להיפך, ציפוי FAPs בצפיפות זריעה גבוהה יגביר את הישרדות התאים וישפר את התפשטותם. FAPs הנובעים משריר פגום דורשים בדרך כלל צפיפות תאים נמוכה יותר מאשר שריר שלא ניזוק, מכיוון שהם כבר מופעלים. מומלץ להתאים את צפיפות ציפוי ה-FAP בהתאם לתנאי הניסוי ולמקור הדגימות.
- צלחת FAPs שבודדו משריר לא מבודד בצפיפות של 15,000 תאים לס"מ 2 ו- FAPs שבודדו משריר פצוע ב-9,000 תאים לס"מ2.
- עבור קולקולטורה, יש להשעות FAPs ו-MuSCs במדיום התרבות ביחס של 1:1 ולדגור על אלה בתנאים סטנדרטיים ב-37 °C ו-5% CO2. אפשר לתאים להתחבר במשך 48 שעות ולהחליף את המדיום כל יומיים.
8. ניתוח אימונופלואורסצנציה של FAPs ו- MuSCs מתורבתים
- שאפו את המדיום התאי ובצעו שתיים או שלוש שטיפות עם PBS אחד.
- תקן את התאים עם 2% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS אחד למשך 15 דקות ב-RT.
- שאפו 2% PFA ושטפו במהירות את התאים פעמיים או שלוש עם PBS אחד.
- בצע חדירה וחסימה של תאים:
- עבור חיזוק חיסוני של FAPs שבודדו זה עתה, בצע חדירה וחסימה של תאים על ידי דגירה של תאים עם 1x PBS + 0.1% Triton X-100 (PBST) + 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) + 5% סרום חמורים רגיל (NDS) למשך 30 דקות ב- RT.
- לחיזוק חיסוני של MuSCs שבודדו זה עתה, בצעו חלחול וחסימה של תאים על ידי דגירה של תאים עם PBST + 1% BSA + 5% סרום עיזים רגיל (NGS) למשך 30 דקות ב-RT.
- החלת נוגדנים ראשוניים:
- עבור חיסון של FAPs מבודדים טריים, יש למרוח נוגדן עיזים נגד PDGFRα ראשוני (1:300) מדולל ב- PBST + 1% BSA + 5% NDS למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- לחיזוק חיסוני של MuSCs שבודדו זה עתה, יש למרוח נוגדן ראשוני נגד Pax7 לעכבר (1:10) המדולל ב-PBST + 1% BSA + 5% NGS למשך 45 דקות ב-RT.
- לשטוף את התאים פעמיים או שלוש עם 1x PBS כדי להסיר את תמיסת הנוגדנים העיקרית.
- החל נוגדנים משניים:
- לחיזוק חיסוני של FAPs שבודדו זה עתה, יש למרוח נוגדן משני נגד עזים נגד עזים (H+L) אלקסה פלואור 488 (1:500) מדולל ב-PBST + 1% BSA למשך שעה אחת ב-RT.
- לחיזוק חיסוני של MuSCs שבודדו זה עתה, יש למרוח נוגדן משני נגד עכברים מסוג IgG 1 Alexa Fluor 555 (1:500) מדולל ב-PBST +1 % BSA למשך 45 דקות ב-RT.
- לשטוף את התאים פעמיים או שלוש עם 1x PBS כדי להסיר את תמיסת הנוגדנים העיקרית.
- בצע צביעה נגדית גרעינית על ידי דגירה של תאים עם DAPI ב- PBST (1:1000) למשך 5 דקות ב- RT.
- שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS אחד כדי להסיר את תמיסת ה- DAPI.
אזהרה: DAPI רעיל ומסוכן; טפלו בו בזהירות והשליכו אותו לבקבוק הפסולת המסוכנת. - אחסן את התאים בטמפרטורה של 4 °C מוגנים מפני האור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר בידוד של כמיליון FAPs ועד 350,000 MuSCs מגפיים אחוריות לא מרוטשות של עכברים בוגרים מסוג בר (3-6 חודשים), המקביל לתשואה של 8% עבור FAPs ו-3% עבור MuSCs של סך האירועים. בעת מיון תאים מת"א פגום 7 ימים לאחר הפציעה, שניים עד שלושה שרירי TA מאוגדים כדי לקבל עד 300,000 FAPs ו-120,000 MuSCs, התואמים לתשואה של 11% ו-4%, בהתאמה. ערכי טוהר לאחר מיון הם בדרך כלל מעל 95% עבור FAPs ו- MuSCs.
אסטרטגיית ה-gating שאומצה כדי לבודד FAPs ו-MuSCs מודגמת באיור 2. ראשית, אוכלוסיות תאים מעניינות מזוהות על ידי יצירת פיזור קדימה (FSC) לעומת צפיפות פיזור צד (SSC), המאפשרת מידה מסוימת של זיהוי תאי בהתבסס על תכונות מורפולוגיות של התא. אסטרטגיה זו משמשת גם כדי למנוע פסולת סלולרית קטנה, אשר ממוקם בדרך כלל בפינה השמאלית התחתונה של העלילה FSC לעומת SSC. התאים מגודרים עוד יותר כדי לא לכלול כפילים בהתבסס על אותות גובה ורוחב FSC ו- SSC, ותאי הסינגלט המתקבלים מוכתמים לאחר מכן ב- 7-AAD כדי להעריך את הכדאיות שלהם. תאים חיים מוערכים עוד יותר עבור ביטוי Sca1 ו- CD31/CD45 כדי לא לכלול תאים חיוביים לשושלת מניתוח נוסף. סינגלטים שליליים של Sca1 מוכתמים לאחר מכן עבור VCAM-1 ו- α7-Integrin כדי להבחין בין FAPs ו- MuSCs. FAPs מזוהים כתאי CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin, ותאי MuSC מזוהים כתאי CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. לחלופין, תאים חיים מגודרים גם עבור CD31/CD45 ו-GFP-PDGFRα כדי להבחין בין FAPs. FAPs מזוהים כתאי CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin.
פרוטוקול זה מציג שתי אסטרטגיות גידור לבידוד אוכלוסיית ה-FAP: או על ידי שימוש בדיווח PDGFRα-EGFP אנדוגני או על ידי ביצוע צביעת תאים עם נוגדן Sca1. עכברי הכתב PDGFRα-EGFP (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 מבטאים את גן ההיתוך H2B-eGFP מתוך מוקד PDGFRα האנדוגני, ומאפשרים תיוג יעיל וספציפי של שושלת PDGFRα (איור 3A). קו עכבר זה שימש בעבר לבידוד Pdgfrα+ FAPs והוא אכן מועיל מאוד לבידוד של FAPs, שכן כתב GFP מספק אות גלוי וספציפי מאוד19. לחלופין, פרוטוקול זה מתאר שיטת בידוד מבוססת Sca1 לזיהוי FAPs. Sca1 (Ly-6A/E) משמש בדרך כלל לזיהוי ובידוד FAPs בהכנת שרירים13,16,17. Sca1 הוא חלבון 18-kDa גליקוזילפוספטידילינוזיטול (GPI) המקושר לחלבון ממשפחת Ly-620. עם זאת, מלבד היותו בא לידי ביטוי על פני התא של תאי שריר אב mesenchymal, ביטוי Sca1 נצפה גם בתאי גזע hematopoietic (HSCs) כמו גם לויקוציטים בוגרים ותאי T. בפרוטוקול זה, אישרנו את ההתאמה של Sca1 כסמן FAPs על ידי ביצוע מחקרי מעקב שושלת מבוססי FACS. באופן ספציפי, נעשה שימוש בעכברי PDGFRα-EGFP כדי לבודד FAPs המבטאים Sca1+/GFP בקרב אוכלוסיות של תאים חד-גרעיניים. מצאנו שכל התאים המבטאים GFP היו חיוביים גם עבור Sca1 ושליליים עבור CD31, CD45, VCAM-1 ו-α7-Integrin (איור 4). ניתוח זה אישר את השימוש בנוגדן Sca1 כסמן ל-FAPs הן ב-FAPs שקטים והן ב-FAPs מופעלים, ומספק אמצעים לשימוש לא ברור בכל אחת מהאסטרטגיות לבידוד FAPs.
בפרוטוקול זה, FAPs ו-MuSCs בודדו גם מעכברים בוגרים שנפצעו בזריקות תוך שריריות של Notexin, 7 ימים לאחר הפציעה (איור 5). לאחר פציעה, MuSCs ו-FAPs מופעלים ומתרבים in vivo, ומגיעים לשיא ההתרבות בין היום השלישיל-4 2,3. שינויים אלה בשגשוג משתקפים על ידי עלייה באחוזים של Sca1/PDFGRα וכן של תאים חיוביים VCAM-1/α7-Integrin. איור 6 מייצג את הכימות של FAPs ו-MuSCs ב-TAs שלא נפגעו ו-7 ימים לאחר הפציעה; למרות ששיא ההתרבות נצפה בין הימים 2 ל -3 לאחר הפציעה, שיעור נמוך של תאים מתרבים עדיין ניכר 7 ימים לאחר הפציעה. כאשר MuSCs מופעלים, יש עלייה ניכרת בגודל הסלולר שלהם21,22. לכן, בעת בידוד התאים האלה על-ידי FACS, יש חשיבות קריטית להתאים את הפרמטרים FSC-A ו-SSC-A ולהרחיב את השער כך שיכלול את התאים האלה במרכז (איור 5A).
טוהר אוכלוסיות התאים המבודדים אושר על ידי חיסון של GFP+ FAPs ו-MuSCs שעברו כריתה עם נוגדנים ל-Pax7. GFP+ FAPs ו-MuSCs שבודדו זה עתה גודלו במשך 48 שעות ביחס של 1:1 (איור 3B). GFP+ FAPs לא ביטאו את הסמן Pax7, בעוד ש-MuSCs הגיבו עם נוגדן זה. לפיכך, Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- ו-Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ אסטרטגיית gating יעילה בבידוד אוכלוסיות טהורות של FAPs ו-MuSCs, בהתאמה.
איור 1: סקירה גרפית של בידוד FAP ו-MuSC. סקירה גרפית המציגה בידוד FAP ו-MuSC משרירי הגפיים האחוריות. הפרוטוקול חל גם על תאים שבודדו משרירי TA. ראשית, השרירים נאספים ונטחנים מכנית לפני שהם עוברים עיכול אנזימטי. תערובת השרירים מעובדת לאחר מכן באמצעות מחט של 20 גרם ומסוננת כדי לקבל תרחיף של תאים חד-גרעיניים. לאחר מכן התאים דוגרים עם קוקטייל של נוגדנים מצומדים לפלואורופור, ובסופו של דבר עוברים דרך סדרן תאים כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של FAPs ו-MuSCs. אוכלוסיות תאים טהורות מעובדות לאחר מכן ליישום במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פרופיל FACS מייצג של FAPs ו-MuSCs. (A-H) אסטרטגיית Gating לבידוד של FAPs ו-MuSCs. (A) ראשית, הדגימות מגודרות כך שלא יכללו פסולת תאית וכפילים (B,C) בהתבסס על תכונות SSC ו-FSC. (D) התאים הבודדים המתקבלים מוכתמים לאחר מכן ב-7-AAD כדי להעריך את הכדאיות שלהם. (E) תאים בודדים שליליים 7-AAD מוערכים לאחר מכן עבור APC-CD31/CD45 ופסיפיק בלו-Sca1 כדי לא לכלול תאים חיוביים לשושלת מניתוח נוסף. (ו,ז) לאחר מכן, סינגלטים שליליים של שושלת מוכתמים עבור PE-Cy7-VCAM-1 ו-PE-α7-Integrin. (F) FAPs מזוהים כתאי CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- ו-(G) MuSCs מזוהים כתאי CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. (H) בידוד FAPs בעכברי PDGFRα-EGFP באמצעות כתב GFP. (I-M) פרופיל FACS עבור פקדי פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) כדי להדגים פיצוי הולם וגאט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אימות של תרבית תאי FAP ו-MuSC . (A) FAPs שבודדו טריים המבטאים GFP היו מצופים ומוכתמים במשותף בנוגדן PDGFRα. גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI. מוצגות תמונות ממוזגות של צביעת GFP (ירוק), PDGFRα (אדום) ו- DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה, 25 מיקרומטר. (B) FAPs מבודדים טריים (ירוק) ו-MuSCs גודלו במשך 48 שעות והוכתמו ב-Pax7 (אדום). גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI. FAPs המבטאים GFP אינם מבטאים את Pax7, בעוד ש-MuSCs מבטאים באופן בלעדי את Pax7 ואינם חיוביים עבור GFP, מה שמאשר את הטוהר של שתי האוכלוסיות הממוינות. פסי גודל, 75 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: עכברי PDGFRα-EGFP וביטוי Sca1 מתייגים באופן ספציפי FAPs בעכברים בוגרים. FAPs מבודדים כתאי GFP+/Sca1+. תאים בודדים שליליים של 7-AAD מוערכים עבור APC-CD31/CD45 ו-GFP-PDGFRα כדי לא לכלול תאים חיוביים לשושלת ולהבחין בין FAPs. תאים שליליים/חיוביים ל-Sca1 מוכתמים עבור PE-Cy7-VCAM-1 ו-PE-α7-Integrin כדי לא לכלול MuSCs. FAPs מזוהים כתאי CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: פרופיל FACS מייצג של FAPs מופעלים ו- MuSCs. (A-H) אסטרטגיית Gating לבידוד של FAPs ו- MuSCs מופעלים. (A) דגימות מגודרות כך שלא יכללו פסולת תאית על ידי יצירת תרשים צפיפות FSC-A לעומת SSC-A. שימו לב לשער המוגדל כדי להכיל את האוכלוסייה המעניינת. (ב,ג) דוגמאות מגודרות עוד יותר כדי למנוע כפילים המבוססים על מאפייני SSC ו- FSC. (D) התאים הבודדים המתקבלים מוכתמים לאחר מכן ב-7-AAD כדי להעריך את הכדאיות שלהם. (E) תאים בודדים שליליים 7-AAD מוערכים לאחר מכן עבור APC-CD31/CD45 ופסיפיק בלו-Sca1 כדי לא לכלול תאים חיוביים לשושלת מניתוח נוסף. (ו,ז) לאחר מכן, סינגלטים שליליים של שושלת מוכתמים עבור PE-Cy7-VCAM-1 ו-PE-α7-integrin. (F) FAPs מזוהים כתאי CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin- ו-(G) MuSCs מזוהים כתאי CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+. (H) בידוד FAPs בעכברי PDGFRα-EGFP באמצעות כתב GFP. (I-M) פרופיל FACS עבור פקדי פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) כדי להדגים פיצוי הולם וגאט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: כימות של FAPs ו-MuSCs ב-TAs שלא נפגעו ונפצעו. כימות של FAPs ו- MuSCs בשרירי TA שלא נפגעו ו- 7 ימים לאחר הפציעה. ספירת התאים בוצעה על ידי חלוקת מספר התאים הממוינים לכל מ"ג של שריר שנאסף. ** P < 0.01 בין לא פצוע לפצוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| 7-AAD (מיקרוגרם/מ"ל) |
CD31/CD45-APC (מיקרוגרם/מ"ל) |
Sca1-פסיפיק כחול (מיקרוגרם/מ"ל) |
α 7-אינטגרין-PE (מיקרוגרם/מ"ל) |
VCAM-1-ביוטין (מיקרוגרם/מ"ל) |
PE-Cy7 סטרפטאבידין (מיקרוגרם/מ"ל) |
||
| שליטה לא מוכתמת | |||||||
| פקדים מוכתמים בודדים | |||||||
| 7-AAD (בקרת כדאיות) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| סקה1 | 5 | ||||||
| α7-אינטגרין | 0.4 | ||||||
| מצלמת VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| בקרות FMO | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| מדגם ניסיוני | |||||||
| כתם מלא | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
טבלה 1: מטריצת צביעת נוגדנים. רשימת ריכוזי הנוגדנים המשמשים להכתמת דגימות הניסוי והבקרה. אם מבודדים FAPs על ידי GFP, ניתן להשמיט את צביעת Sca1. במקום זאת, הפעל בקרת מוכתמת יחידה של GFP ו- GFP FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קביעת פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע בוגרים טהורים היא הצעד הראשון והקריטי ביותר לקראת הבנת תפקידם. ניתן להשתמש ב-FAPs וב-MuSCs מבודדים כדי לבצע ניתוח מולטיומיקה בניסויי השתלה כטיפול פוטנציאלי במחלות שרירים או שניתן להנדס גנטית עבור מודלים של מחלות בטיפול בתאי גזע.
הפרוטוקול המתואר כאן מספק הנחיות סטנדרטיות לזיהוי, בידוד ותרבות של FAPs ו- MuSCs המתקבלים משרירי גפיים אחוריות של עכברים בוגרים. אוכלוסיות טהורות של FAPs ו-MuSCs בודדו באמצעות טכניקה מבוססת FACS, והטוהר שלהם הוערך לאחר מכן על ידי תאים חיסוניים עם סמנים ספציפיים לפני השטח של התא ואמצעים גנטיים.
הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים עיקריים המשפיעים מאוד על התפוקה של FAPs ו- MuSCs: עיכול השרירים המכני והאנזימטי, יצירת תרחיף תאים חד-גרעיני באמצעות מחט 20 G, והבידוד הסופי של תאים בודדים באמצעות FACS.
ביצוע טחינת שרירים נכונה הוא בעל חשיבות קריטית לשחרור תאים בודדים. יש לשים דגש על שלב זה, שכן הגעה לגודל האופטימלי של חלקי השריר לאחר הכרייה מאפשרת לאנזימים המשמשים לעיכול לעבוד בצורה הטובה ביותר ומונעת סתימת המחט המשמשת בשלב 4.1. מצד שני, טחינת יתר של השריר עלולה לגרום לתפוקת תאים ירודה ולירידה בחיוניות התאים, שכן MuSCs משתחררים במהירות במהלך העיכול הראשון ועשויים להיות שאפתניים בשלב 3.7.2 או 3.8.214. בנוסף, היעילות של האנזימים המשמשים לעיכול הכנת השרירים משפיעה גם על איכות הדיסוציאציה האנזימטית, שכן תיתכן שונות בין אנזימים שונים או ירידה בפעילות האנזימים עם הזמן23. לכן, מומלץ לבדוק כל אצווה של אנזימים כדי לייעל את תזמון העיכול ואת הריכוז. יתר על כן, הריכוז ומשך הזמן הנדרשים לעיכול השריר עשויים להיות מושפעים גם מתנאים פתולוגיים המשפיעים על נוקשות השרירים. תנאים מסוימים אלה ידרשו אופטימיזציה אישית.
הדור הסופי של תאים חד-גרעיניים מתרחש על ידי הפעלת ההשעיה דרך מזרק 10 מ"ל עם מחט 20 גרם. יש לנקוט בזהירות ספציפית בעת ביצוע שלב זה כדי למזער את מספר הבועות הנוצרות מכיוון שהתפוצצותן גורמת לנזק נוסף לתאים24.
לאחר מכן מתלה התאים מוכתם בקוקטייל נוגדנים ונרכש באמצעות סדרן תאים. קביעת השערים הנכונים היא צעד קריטי נוסף. בעת ביצוע ניסויים אלה, מומלץ מאוד להפעיל את הפקדים המוכתמים הבודדים המפורטים ואת פקדי ה- FMO כדי לפצות כראוי על זליגת הפליטה ולקחת בחשבון את אות הרקע עקב התפשטות הזליגה. זה חשוב במיוחד כאשר מתמודדים עם חלבונים פלואורסצנטיים בהירים כמו GFP וכתמים עקיפים כמו קומפלקס VCAM-1-ביוטין/סטרטפאבידין-PE-Cy7.
יתר על כן, לפני ביצוע ניסוי זה בפעם הראשונה, כדאי לבצע טיטרציה של הנוגדנים המשמשים לאיתור אוכלוסיות מעניינות. קביעת הריכוז האופטימלי של הנוגדנים היא צעד קריטי להבטחת האות הבהיר ביותר של האוכלוסייה החיובית והימנעות מהעלייה בכתמי הרקע.
לאחר השלמת המיון, חשוב לבצע ניתוח לאחר המיון על התאים הממוינים כדי לקבוע את טוהר וכדאיותם. התפוקה והכדאיות של התאים הממוינים מושפעות מאוד ממשך הזמן הדרוש לעיבוד הדגימה ויש לקחת אותן בחשבון כאשר מתכננים לעבד עכברים מרובים. יתר על כן, שמירה על התאים הממוינים על הקרח במדיה מועשרת פי 2 בסרום יכולה לסייע להתאוששות התאים ולשפר את יכולת הקיום שלהם.
בפרוטוקול זה, FAPs ו-MuSCs בודדו מהשרירים הקדמיים של הטיביאליס של עכברים לא פגועים, כמו גם 7 ימים לאחר הזרקת Notexin. בעקבות פציעה חריפה, דווח כי תת-אוכלוסיות שונות של FAP ו-MuSC מתבטאות באופן חולף ברקמת השריר המתחדשת. מלקובה ועמיתיה דיווחו על נוכחות של תת-אוכלוסייה של VCAM-1 המבטאת FAPs שנעדרת בשריר לא פגום, הגיעה לשיאה בין הימים 2 ל-3 לאחר הפציעה בדלקת חריפה, ונמשכה בעכברים דיסטרופיים של מורין13. באופן דומה, קפדר ועמיתיו דיווחו על עלייה חולפת בביטוי של Sca1 על תת-קבוצה קטנה של אבות מיוגניים יומיים לאחר הפציעה25. עם זאת, תאים מיוגניים Sca1+ ירדו מאוד 3 ימים לאחר פציעה25. יש להכיר בנוכחותן של תת-אוכלוסיות אלה ולשקול אותן בעת שימוש בפרוטוקול זה כדי לבודד FAPs ו-MuSCs בשלבים מוקדמים יותר.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבות של אוכלוסייה טהורה של FAPs ו- MuSCs המבודדים משרירי עכברים בוגרים בריאים או פצועים. הטוהר הגבוה והכדאיות של התאים הופכים פרוטוקול זה למתאים ליישומים נוספים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לטום צ'אונג (אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה) על עצות בנושא בידוד MuSC. עבודה זו מומנה על ידי NIAMS-IRP באמצעות מענקי NIH AR041126 ו- AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
