Summary
線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。
Abstract
線維脂肪原性前駆細胞(FAP)は、線維形成、脂肪原性、骨形成性、または軟骨原性の系統に沿って分化することができる骨格筋に常在する間葉系間質細胞(MSC)の集団です。FAPは、筋幹細胞(MuSC)とともに、細胞外マトリックス(ECM)を積極的に維持およびリモデリングしながら、筋肉の恒常性、修復、および再生に重要な役割を果たします。慢性的な損傷や筋ジストロフィーなどの病的状態では、FAPは異常な活性化を受け、コラーゲン産生線維芽細胞と脂肪細胞に分化し、線維症と筋肉内脂肪浸潤を引き起こします。したがって、FAPは、MuSC代謝回転を維持し、組織修復を促進するか、骨格筋組織の完全性と機能を損なう線維性瘢痕形成と異所性脂肪浸潤に寄与することにより、筋肉の再生に二重の役割を果たします。FAPおよびMuSCの適切な精製は、生理学的および病理学的状態におけるこれらの細胞の生物学的役割を理解するための前提条件です。ここでは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を用いて成体マウスの四肢筋からFAPとMuSCを同時に単離するための標準化された方法について説明します。プロトコルは、四肢筋全体および損傷した前脛骨筋(TA)からの単核細胞の機械的および酵素的解離を詳細に説明しています。その後、FAPおよびMuSCを半自動セルソーターを使用して単離し、純粋な細胞集団を取得します。さらに、静止および活性化されたFAPおよびMuSCを単独または共存培養条件で培養するための最適化された方法について説明します。
Introduction
骨格筋は体内で最大の組織であり、成人の体重の~40%を占め、姿勢の維持、運動の生成、基礎エネルギー代謝の調節、および体温1を担っています。骨格筋は非常に動的な組織であり、機械的ストレス、代謝変化、日常の環境要因など、さまざまな刺激に適応する優れた能力を持っています。さらに、骨格筋は急性損傷に応じて再生し、その形態と機能の完全な回復につながります2。骨格筋の可塑性は、主に筋線維原形質膜と基底層の間に位置するサテライト細胞とも呼ばれる常在筋幹細胞(MuSC)の集団に依存しています2,3。通常の条件下では、MuSCは静止状態で筋肉ニッチに存在し、細胞の代謝回転を補い、幹細胞プールを補充するための分裂はわずかです4。損傷に応答して、MuSCは細胞周期に入り、増殖し、新しい筋線維の形成に寄与するか、自己複製プロセスでニッチに戻ります2,3。MuSCに加えて、骨格筋の恒常性維持と再生は、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)と呼ばれる筋肉常在細胞の集団のサポートに依存しています5,6,7。FAPは、筋肉結合組織に埋め込まれた間葉系間質細胞であり、線維形成、脂肪原性、骨形成性、または軟骨原性の系統に沿って分化することができます5、8、9、10。FAPは、筋幹細胞ニッチにおける細胞外マトリックスタンパク質の供給源であるため、MuSCの構造的サポートを提供します。FAPはまた、筋形成と筋肉成長の栄養サポートを提供するサイトカインと成長因子を分泌することにより、骨格筋の長期維持を促進します6,11。急性筋損傷時には、FAPは急速に増殖して、再生する筋肉の構造的完全性をサポートし、パラクリン様式でMuSCの増殖および分化を維持するための好ましい環境を提供する一過性のニッチを生成します5。再生が進むにつれて、FAPはアポトーシスによって再生筋から除去され、その数は徐々に基底レベル12に戻ります。しかし、慢性的な筋肉損傷に有利な状態では、FAPはアポトーシス促進シグナル伝達を無効にして筋肉ニッチに蓄積し、そこでコラーゲン産生線維芽細胞と脂肪細胞に分化し、異所性脂肪浸潤と線維性瘢痕形成を引き起こします12,13。
FAPとMuSCは、その多能性と再生能力により、骨格筋疾患の治療のための再生医療の有望な標的として特定されています。したがって、それらの機能と治療の可能性を調べるためには、FAPとMuSCの分離と培養のための効率的で再現性のあるプロトコルを確立することが重要です。
蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、サイズや粒度などの形態学的特性に基づいてさまざまな細胞集団を同定でき、細胞表面マーカーに対する抗体の使用に基づいて細胞特異的な分離を可能にします。成体マウスでは、MuSCは血管細胞接着分子1(VCAM-1、CD106としても知られる)14,15およびα7-インテグリン15を発現し、FAPは血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)および幹細胞抗原1(Sca1またはLy6A/E)5,6,9,12,16,17を発現します。.ここで説明したプロトコルでは、MuSCはCD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+として同定され、FAPはCD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-として同定された。あるいは、PDGFRαEGFPマウスを使用して、FAPをCD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-インテグリン-イベントとして単離した18,19。さらに、PDGFRα-GFP+細胞の蛍光シグナルと表面マーカーSca1で同定された細胞の重なりを比較しました。私たちの分析は、すべてのGFP発現細胞がSca1に対しても陽性であることを示し、FAPの同定と単離にどちらのアプローチも使用できることを示しています。最後に、特異的マーカー抗体による染色により、各細胞集団の純度を確認した。
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Protocol
実施されたすべての動物実験は、国立関節炎・筋骨格系・皮膚疾患研究所(NIAMS)の動物管理使用委員会(ACUC)によって承認された制度的ガイドラインに準拠して実施されました。このプロトコルを実行する研究者は、地域の動物倫理ガイドラインを遵守する必要があります。
注:このプロトコルでは、後肢および損傷した前脛骨筋からFAPおよびMuSCを分離する方法を詳細に説明しています 成体オスおよびメスマウス(3〜6か月)のマウスと共培養のためのガイドラインを提供します。実験手順の概要を 図1に示します。このプロトコルのすべてのステップは、特に指定がない限り、無菌状態および室温(RT)で実行する必要があります。
1. 試薬のセットアップ
- 洗浄培地(WM):ハムのF-10栄養ミックス細胞培地に10%(vol / vol)の馬血清と1xペニシリン/ストレプトマイシンを加えて、この溶液を調製します。WMは予め調製し、4°Cで保存することができる。
- 筋肉解離バッファー(MDB):コラゲナーゼIIをWMに溶解してこのバッファーを調製します。後肢全体の筋肉を採取する場合は、マウスごとに10 mLのWMに1000 U / mLのコラゲナーゼIIを溶解します(50 mLのコニカルチューブに調製します)。TA筋肉を収集する場合は、800 U / mLのコラゲナーゼIIを各マウスの7 mLのWMに溶解します(15 mLのコニカルチューブに調製します)。TA筋肉の場合、これは細胞ペレットをよりよく視覚化し、FAPとMuSCのより高い収量を得るのに役立ちます。筋肉を集める前にMDBを新鮮に準備し、必要になるまで氷の上に置いておきます。
- コラゲナーゼII溶液ストック:コラゲナーゼIIを滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に最終濃度1000 U/mLまで溶解して、この溶液を調製します。溶液を0.45 μmシリンジフィルターでろ過し、1 mLストックに分注します。溶液を-20°Cで保存します。
- ディスパーゼ溶液ストック:ディスパーゼを滅菌1x PBSに最終濃度11 U/mLまで溶解して、この溶液を調製します。溶液を0.45 μmシリンジフィルターでろ過し、1 mLストックに分注します。溶液を-20°Cで保存します。
- DMEMに10%(vol/vol)ウシ胎児血清、1xペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 ng/mL FGFを添加して、FAPの培地を調製します。培地を4°Cで保存します。
- F10に10%(vol/vol)ウマ血清、1xペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 ng/mL FGFを補給したMuSCの培地を調製します。培地を4°Cで保存します。
- DMEMに10%(vol/vol)ウシ胎児血清、10%(vol/vol)ウマ血清、1xペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 ng/mL FGFを添加して、共存培地を調製します。培地を4°Cで保存します。
2.後肢の筋肉収穫
- 6 cmディッシュ(マウス1枚につき1皿)に2〜3mLのWMを加え、氷の上に置きます。
- 窒息による安楽死を行う:マウスをCO 2チャンバーに入れ、100%CO2を導入する。頸部脱臼を使用して死亡を確認します。
- マウスの仰臥位を解剖パッドに置き、汚染を避けるために70%(vol / vol)エタノールをスプレーします。
- 鉗子を使用してマウスの腹の皮膚の中心をつまみ、水平方向に~1cmの開口部を切ります。傷の端をつかみ、開口部を反対方向に引っ張ってマウスに机を置き、下の筋肉を明らかにします。その時点でマウスの後肢の片側を露出させます。
- 筋肉を集める前に、ハムストリングスと大腿四頭筋の近位端の間の筋肉間脂肪を取り除きます。これにより、FAP と MuSC の分離が改善されます。
- 組織に損傷を与えることなく、鋭利な鉗子を使用して筋膜を壊して剥がし、TAの下と長指伸筋(EDL)を露出させます。TA / EDL筋肉の下に鉗子の鋭い先端を走らせて、脛骨から筋肉を切り離します。
- TA/EDLを足首に固定している腱を切り取り、鉗子で保持しながら、TA/EDLの縦線に沿ってハサミで筋肉を整えます。膝の周りの腱を切断して、TA / EDLの筋肉全体を切り離します。氷の上に置いた6 cmの皿に筋肉を入れます。
- 足首のすべての腱を切断し、脛骨と腓骨から筋肉を切り離すことによって、腓腹筋とヒラメ筋を分離します。膝の周りを切り、筋肉を6 cmの皿に移します。
- 大腿四頭筋の周りの筋膜をはがし、筋肉と骨の間に鉗子の鋭い先端を走らせて大腿骨から分離します。膝の周りの腱を切断し、遠位端で鉗子で大腿四頭筋を保持しながら、大腿骨に沿って切断することによって筋肉の残りの部分を整えます。筋肉を6 cmの皿に入れます。
- ハムストリングスと大腿骨周辺の残りの筋肉を切り離し、それらを6cmの皿に移します。氷の上に置いた6 cmの皿に後肢の筋肉を集めます。
注:下流の分離を妨げる可能性のある血液塊の形成を防ぐために、可能であれば血管の損傷を避けてください。出血が発生した場合は、直ちに滅菌ガーゼで切除した血管を吸い取って血液を吸収します。 - 対側肢からTA、EDL、腓腹筋、ヒラメ筋、大腿四頭筋、ハムストリング筋を収集します。
注:後肢の筋肉全体を隔離するときは、2匹以上のマウスをプールしないでください。TA筋肉を分離する場合、最大3つのTA筋肉をプールできます。
3.機械的および酵素的な筋肉消化
- 6 cmの皿からWMを吸引し、1〜2 mLのMDBを加えて筋肉を湿らせます。
- よく刻んだ組織のスラリーペーストが得られるまで、筋肉を完全にミンチします。これを行うには、鉗子を使用して筋肉片の一端を保持し、メスを使用して筋肉を引き裂き、きつくなくなるまでスライスします。
- はさみを使用して、筋肉を1〜2分間細かく切り続けます。よくミンチされた筋肉スラッジが得られるまで、筋肉のグループごとにこの手順を繰り返します。
注: これは、FAP と MuSC の歩留まりを最大化するための非常に重要なステップです。適切な筋肉のミンチを確実にするために、このステップで8〜10分(TA筋肉のみを分離する場合は4〜5分)を費やすことをお勧めします。 - ミンチした筋肉を各マウスからMDBを含む円錐管に移します。
- チューブを実験用フィルムで密封し、37°Cの水浴中で撹拌(75rpm)しながら1時間インキュベートします。チューブを振とう経路に沿って水平に置き、ウェイトを使用してチューブを水に沈めたままにします。
- マウスあたり1 mLのコラゲナーゼIIストックと1 mLのディスパーゼストックを解凍します。使用前に、ディスパーゼストックをスイングバケットローターで10,000 x g で4°Cで1分間回転させます。 上清のみを使用してください。
- 後肢全体の筋肉が収集された場合は、次の手順に従います。
- 1時間後、シェーカーからチューブを取り外し、WMで50mLまで満たします。
- スイングバケットローターで細胞を250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 42 mLの上清を2つの新しいチューブ(各チューブに~21 mL)に移し、元のチューブに~8 mLを残します。
- 21 mLの上清を含む新しいチューブに50 mLまでWMを満たします。 細胞をスイングバケットローターで350 x g で4°Cで8分間遠心分離します。 すべての上清を吸引し、ペレットを氷上に置きます。
- 1 mLのコラゲナーゼIIストックと1 mLのディスパーゼストックを、~8 mLのMDBを含む元のチューブに追加します。
- 5 mLの血清学的ピペットを使用して、目詰まりすることなくペレットを10回再懸濁します。気泡の形成を避けて、チューブの壁に向かって溶液を排出します。再懸濁中に目詰まりが発生した場合は、ピペットの先端をチューブの底に押し付けて、筋肉の塊を機械的に破壊します。手順 3.9 に進みます。
- TA筋肉が収集された場合は、次の手順に従います。
- 1時間後、シェーカーからチューブを取り外し、WMで15mLまで満たします。 混合を確実にするために、数回ゆっくりと反転させます。
- スイングバケットローターで細胞を250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 13 mLの上清を1つの新しい15 mLチューブに移し、~2 mLを元のチューブに残します。
- 15 mLまでの上清13 mLを含む新しいチューブにWMを満たします。 細胞をスイングバケットローターで350 x g で4°Cで8分間遠心分離します。 すべての上清を吸引し、ペレットを氷上に置きます。
- 1000 μLのピペットチップを使用して、ペレットを元のチューブに詰まらせることなく上下に再懸濁します。
- 2 mLのMDBを含む元のチューブに1 mLのコラゲナーゼIIストックと1 mLのディスパーゼストックを加え、WMを最大10 mLまで充填します。 手順 3.9 に進みます。
- チューブを実験用フィルムで密封し、37°Cの水浴中で撹拌(75rpm)しながら30分間インキュベートします。手順3.5のようにチューブを配置します。
4. 単核細胞の生成
注意: 15 mLのコニカルチューブに集められたTA筋肉を使用する場合は、手順4.1に進む前に、懸濁液を50 mLのコニカルチューブに移します。
- 30分後、シェーカーからチューブを取り外します。筋肉懸濁液を吸引し、20 G針を備えた10 mLシリンジを通して10回正常に排出します。
注意: 気泡や泡立ちを避けるために、筋肉の懸濁液をチューブの壁に向かって排出します。未消化の腱や軟骨の小片は、吸引の最初のラウンド中に針を詰まらせる可能性があります。目詰まりが発生した場合は、滅菌鉗子を使用して針の先端から目詰まりを取り除きます。 - 各チューブを最大50 mLでWMで満たし、混合を確実にするために数回静かに反転させます。
- スイングバケットローターで細胞を250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を新しいチューブ(~42 mL)に移し、~8 mLを元のチューブに残します。
- 42 mLの上清を含む新しいチューブに50 mLまでのWMを満たします。 細胞をスイングバケットローターで350 x g で4°Cで8分間遠心分離します。 すべての上清を吸引し、ペレットを氷上に置きます。
- 8 mLのWMを含む元の50 mLコニカルチューブに40 μmのナイロンセルストレーナーを置き、1〜2 mLのWMでセルストレーナーを事前に湿らせます。
- 40 μmのナイロン製セルストレーナーを保持しながら、10 mLピペットを使用してペレットを5〜10回静かに再懸濁します。セルストレーナーを通してペレットをろ過して同じチューブに戻して、細胞の損失を最小限に抑えます。
- このステップでは、氷上にセルペレットを備えた追加のチューブがあることを確認します。各チューブに4〜5 mLのWMを加えてペレットを再懸濁し、元のチューブに配置されたセルストレーナーに溶液を移して、これらのペレットを元のチューブに戻します。重力によるフィルタリングを許可します。
- すべてのペレットを元の50 mLコニカルチューブに集めた後、セルストレーナーをさらに4〜5 mLのWMですすぎます。 1000 μLピペットを使用して、セルストレーナーの下側からすべての液体を収集します。
- 各チューブに最大50 mLのWMを満たし、混合を確実にするために数回静かに反転させます。
- スイングバケットローターで細胞を250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 遠心分離後直ちにペレットを乱すことなく全ての上清を吸引する。
- ペレットを600 μLのWMに再懸濁し、2 mLの微量遠心チューブに移します。
5. フローサイトメトリーのための抗体染色
注:各実験について、次のコントロールを設定します:i)非染色コントロール、ii)生細胞集団に対して選択する生存率コントロール、iii)蛍光色素放出スピルオーバーを補正するための単一染色補償コントロール、およびiv)スピルオーバースプレッドを考慮してゲーティング境界を設定するための蛍光マイナス1(FMO)コントロール。染色コントロールの完全なリストについては、 表1 を参照してください。
- 染色されていないコントロールを調製するには、10 μLの細胞懸濁液を190 μLのWMを含む2 mLの微量遠心チューブに移します。 細胞懸濁液を再懸濁し、35 μmのセルストレーナーキャップ付きの5 mLポリスチレン丸底チューブを通してろ過します。サスペンションを重力でろ過できるようにします。
- 200 μLのピペットを使用して、セルストレーナーの下側からすべての液体を収集します。キャップで密封し、光から保護された氷の上に置いておきます。
- 生存率、FMO、および単一染色コントロールを調製します:10 2 mLマイクロ遠心チューブにラベルを付け、各チューブに190 μLのWMと10 μLの細胞懸濁液を追加します。コントロールの完全なリストについては、 表 1 を参照してください。実験コントロールに応じて、適切なチューブに抗体を追加します。抗体の組み合わせと濃度については 、表1 を参照してください。
- 残りの細胞懸濁液(500 μL)を2 mLの微量遠心チューブ(実験用チューブ)に移し、次の抗体を追加します:CD31-APC、CD45-APC、Sca1-パシフィックブルー、VCAM-1-ビオチン、およびα7-インテグリン-PE。抗体の組み合わせと濃度については 、表1 を参照してください。
- 均一な分布を確保するために各チューブを穏やかによく混合し、光から保護された4°Cの回転シェーカーで45分間細胞をインキュベートします。
- 45分後、2 mLまでのすべての微量遠心チューブにWMを満たします。 完全に混合されるように、チューブを数回静かに反転させます。固定角度ローターを備えた冷蔵遠心分離機で、250 x g で4°Cで5分間チューブを遠心分離します。 ペレットを乱すことなく上清を吸引する。
- すべてのマイクロ遠心チューブ内の細胞を300 μLのWMに再懸濁します。
- ストレプトアビジン抗体を適切なチューブに加えます。抗体の組み合わせと濃度については 、表1 を参照してください。均一な分布を確保するために各チューブを穏やかに混合し、光から保護された4°Cの回転シェーカーで20分間細胞をインキュベートします。残りのチューブを氷の上に置いておき、光から保護します。
- 20分後、ストレプトアビジン抗体を含む微量遠心チューブにWMを2mL充填します。 チューブを数回静かに反転させて、完全に混合されるようにします。固定角度ローターを備えた冷蔵遠心分離機で、250 x g で4°Cで5分間チューブを遠心分離します。 上清を完全に吸引し、細胞を300 μLのWMに再懸濁します。
- 10本の5 mLポリスチレン丸底チューブの35 μmセルストレーナーキャップを200 μLのWMで事前に濡らします。 コントロールチューブから適切な5 mLポリスチレン丸底チューブを通して細胞をろ過します。200 μLのピペットを使用して、セルストレーナーの下側からすべての液体を収集します。キャップで密封し、チューブを氷の上に置き、光から保護します。
- 実験用チューブに細胞を再懸濁し、さらに200 μLのWMを加えて合計500 μLのWMを入れます。 5 mLポリスチレン丸底チューブのセルストレーナーキャップを200 μLのWMで事前に濡らします。 細胞懸濁液を実験用チューブから5 mLポリスチレン丸底チューブに移し、重力でろ過します。
- 実験サンプル懸濁液が入った2 mLマイクロ遠心チューブを300 μLのWMですすぎ、同じストレーナーキャップに通します。200 μLのピペットを使用して、セルストレーナーの下側からすべての液体を収集します。キャップで密封し、チューブを氷の上に置き、光から保護します。
注意: 35μmのセルストレーナーキャップの目詰まりが発生した場合は、ベンチのチューブを軽くたたいて、フロースルーを促進します。 - FAPおよびMuSC用の収集チューブを準備してラベルを付けます。後肢筋全体から細胞を単離する場合は、2 x 血清を添加した最大 1 mL の FAP または MuSCs 培養培地を使用して、5 mL のポリプロピレン製丸底チューブで細胞を選別します。TA筋肉から細胞を単離する場合は、2 x血清を添加した最大400 μLの培養液を含む2 mLマイクロ遠心チューブでFAPとMuSCを選別します。
6. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)
注:このプロトコルは、100 μmノズルを装備し、3つのレーザー構成(488 nm、640 nm、405 nm)を備えたコンパクトなベンチトップリサーチフローサイトメーターを採用しており、最大9つの異なる蛍光色素(前方散乱と側方散乱を含む11のパラメータ)を分析することができます。このプロトコルで使用される蛍光色素とそれに関連する検出器バンドパスフィルターは次のとおりです:PE 586/42;PE-Cy7 783/56;APC 660/10;パシフィックブルー448/45;7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)700/54、GFP 527/32。細胞は4°Cで選別され、選別後も氷上に留まります。この機器を操作する前に、ユーザーが技術的なアプリケーションスペシャリストによって適切にトレーニングされていることを確認してください。
- メーカーの仕様に従ってセルソーターをセットアップし、性能チェックします。
- FAP と MuSC を識別するための階層型ゲーティング戦略を設定します (図 2)。
- 次のスキームに基づいてFAPを分離します:i)セルとデブリを分離するための順方向セル散乱面積対側セル散乱領域(FSC-A対SSC-A)、ii)SSC範囲のダブレットからシングレットを区別するためのサイドセル散乱高さ対サイドセル散乱幅(SSC-H対SSC-W)、iii)順方向セル散乱高さ対順方向セル散乱幅(FSC-H対FSC-W)FSC範囲のダブレットからシングレットを区別するため、 iv)生細胞と死細胞を区別するための7-AAD領域対SSC-A。
- 抗体ベースの方法でFAPを単離する場合は、次のスキームを使用します:v)APC-CD45 / CD31領域とパシフィックブルー-Ly-6A / E(Sca1)領域を使用して、CD31+およびCD45+細胞をさらなる分析から除外し、vi)FAPを区別するために、CD31-/CD45-/ Sca1+集団からPE-Cy7-VCAM-1領域とPE-α7-インテグリン領域。FAPは、CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-イベントとして識別されます。
- 内因性GFPレポーター法でFAPを単離する場合は、次のスキームを使用します:v)APC-CD45/CD31領域とGFP-PDGFRα領域を比較して、CD31+およびCD45+細胞をさらなる分析から除外し、GFP+細胞を単離します。FAPは、CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-インテグリン-イベントとして識別されます。
- 次のスキームに基づいてMuSCを分離します:i)細胞とデブリを分離するための順方向セル散乱面積対側細胞散乱面積(FSC-A対SSC-A)、ii)SSC範囲のシングレットとダブレットを区別するためのサイドセル散乱高さ対側細胞散乱幅(SSC-H対SSC-W)、iii)順方向セル散乱高さ対順方向セル散乱幅(FSC-H対FSC-W)FSC範囲のダブレットからシングレットを区別するため。 iv)生細胞と死細胞を区別するための7-AAD領域対SSC-A、v)CD31+およびCD45+細胞をさらなる分析から除外するためのAPC-CD45/CD31領域対パシフィックブルー-Ly-6A/E(Sca1)領域、およびvi)MuSCを区別するためのCD31-/CD45-/Sca1-集団からのPE-Cy7-VCAM-1領域対PE-α7-インテグリン領域。MuSCはCD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+イベントとして識別されます。
- 次のスキームに基づいてFAPを分離します:i)セルとデブリを分離するための順方向セル散乱面積対側セル散乱領域(FSC-A対SSC-A)、ii)SSC範囲のダブレットからシングレットを区別するためのサイドセル散乱高さ対サイドセル散乱幅(SSC-H対SSC-W)、iii)順方向セル散乱高さ対順方向セル散乱幅(FSC-H対FSC-W)FSC範囲のダブレットからシングレットを区別するため、 iv)生細胞と死細胞を区別するための7-AAD領域対SSC-A。
- 非染色コントロールと生存率コントロールを実行して、細胞集団がSSC-A対FSC-Aプロットに適切に配置され、生細胞を適切にゲートすることを確認します。
- すべての単一染色コントロールを取得し、スピルオーバー補償マトリックスを生成します。
- すべてのFMOコントロールを実行し、バックグラウンド蛍光スプレッドと陽性染色集団の間のカットオフポイントを決定します。
- 実験サンプルの取得の約5〜10分前に、7-AAD生存率色素を添加し、穏やかに混合します。
- すべてのコントロールが処理されたら、FMO コントロールに従ってソートゲートを設定します。実験サンプルを取得して分類します。
- すべてのサンプルが処理されたら、メーカーの仕様に従ってサイトメーターを洗浄します。分析のためにすべての .fcs データをエクスポートします。
7. FAPとMUSCの文化
注:選別された細胞は、選別後すぐに、コラーゲンIコーティングプレート上の適切な培地で培養する必要があります。
- 回収チューブを固定角度ローターで250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。
- MuSC培養の場合は、細胞を適量のMuSC培地に再懸濁し、37°C、5%CO2の標準条件でインキュベートします。
- 新たに単離したMuSCを20,000細胞/cm2の密度でプレート化し、活性化したMuSCを15,000細胞/cm2の密度でプレート化します。
- メッキ後、細胞は小さく、球形で、半透明に見えます。36時間以内に、MuSCはプレートの表面に付着し、最初の48時間の間ゆっくりとサイズを大きくします。
- 2日ごとに培地を交換してください。
注:MuSCは細胞密度に非常に敏感です。MuSCを増殖状態に保つには、60%〜70%コンフルエントになるまで増殖させます。細胞を新しいコラーゲンIコーティングディッシュまたはプレートに継代し、2日ごとに新しい新鮮な培地を追加します。MuSCを同じ皿またはプレートに3〜4日以上保持すると、それらは細長い形態を獲得し、融合するまで隣接する細胞と整列します。
- FAP培養の場合は、細胞を適切な容量のMuSC培養培地に再懸濁し、37°Cおよび5%CO2の標準条件でインキュベートします。
- 摂動していない筋肉から単離されたFAPを15,000細胞/cm2の密度で、損傷した筋肉から分離したFAPを9,000細胞/cm2でプレートします。
注意: メッキ後、FAPは48時間以内にプレートの表面に完全に付着し、活性化されたFAPは数時間以内にプレートに付着します。それらが付着すると、FAPは小さな細胞体と細長い細胞突起を伴う特徴的な形状を獲得し、急速に増殖します。 - 2日ごとに培地を交換してください。
注:FAPは細胞密度に非常に敏感です。低密度でFAPを播種すると、細胞増殖不良や細胞死につながる可能性があります。それどころか、高い播種密度でFAPをメッキすると、細胞の生存率が向上し、細胞の増殖が改善されます。損傷した筋肉に由来するFAPは、すでに活性化されているため、通常、損傷していない筋肉よりも低い細胞密度を必要とします。FAPめっき濃度は、実験条件やサンプルの供給源に基づいて調整することをお勧めします。
- 摂動していない筋肉から単離されたFAPを15,000細胞/cm2の密度で、損傷した筋肉から分離したFAPを9,000細胞/cm2でプレートします。
- 共存培養の場合は、FAPとMuSCを共存培地に1:1の比率で再懸濁し、37°Cおよび5%CO2の標準条件でインキュベートします。細胞を48時間付着させ、2日ごとに培地を交換します。
8. 培養FAPおよびMuSCの免疫蛍光解析
- 細胞培地を吸引し、1x PBSで2〜3回の洗浄を行います。
- 細胞を2%パラホルムアルデヒド(PFA)で1x PBSでRTで15分間固定します。
- 2%PFAを吸引し、1x PBSで細胞を2〜3回すばやく洗浄します。
- 細胞透過処理とブロッキングを実行します。
- 新たに単離されたFAPの免疫染色では、細胞を1x PBS + 0.1% Triton X-100(PBST)+ 1%ウシ血清アルブミン(BSA) + 5%正常ロバ血清(NDS)でRTで30分間インキュベートすることにより、細胞透過処理とブロッキングを行います。
- 新たに単離されたMuSCの免疫染色では、細胞をPBST + 1% BSA + 5%正常ヤギ血清(NGS)とRTで30分間インキュベートすることにより、細胞透過処理とブロッキングを行います。
- 一次抗体を適用する:
- 新たに単離したFAPの免疫染色には、PBST + 1% BSA + 5% NDSで希釈したヤギ抗PDGFRα一次抗体(1:300)を4°Cで一晩塗布します。
- 新たに単離されたMuSCの免疫染色には、PBST + 1% BSA + 5% NGSで希釈したマウス抗Pax7一次抗体(1:10)をRTで45分間塗布します。
- 細胞を1x PBSで2〜3回洗浄し、一次抗体溶液を除去します。
- 二次抗体を適用する:
- 新たに単離されたFAPの免疫染色には、PBST + 1% BSAで希釈したロバ抗ヤギIgG(H+L)Alexa Fluor 488二次抗体(1:500)をRTで1時間塗布します。
- 新たに単離されたMuSCの免疫染色には、PBST + 1% BSAで希釈したヤギ抗マウスIgG 1 Alexa Fluor 555二次抗体(1 :500)をRTで45分間塗布します。
- 細胞を1x PBSで2〜3回洗浄し、一次抗体溶液を除去します。
- 細胞をPBST(1:1000)中のDAPIとともにRTで5分間インキュベートすることにより、核対比染色を実行します。
- 1x PBSで細胞を3回洗浄して、DAPI溶液を除去します。
注意:DAPIは有毒で危険です。取り扱いには注意し、有害廃棄物ボトルに入れて廃棄してください。 - 光から保護された4°Cで細胞を保管してください。
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Representative Results
このプロトコルにより、野生型成体マウス(3〜6か月)の損傷していない後肢から約100万のFAPと最大350,000のMuSCを分離することができ、これはFAPで8%、MuSCで3%の収量に対応します。損傷後7日で損傷したTAから細胞を選別する場合、2〜3個のTA筋肉をプールして、最大300,000個のFAPと120,000個のMuSCを取得し、これらはそれぞれ11%と4%の収率に相当します。ソート後の純度値は、通常、FAP および MuSC で 95% を超えます。
FAP と MuSC を分離するために採用されたゲーティング戦略を 図 2 に示します。まず、前方散乱(FSC)対側方散乱(SSC)密度プロットを作成することによって目的の細胞集団を同定し、細胞形態学的特性に基づいてある程度の細胞同定を可能にします。このゲーティング戦略は、通常、FSC対SSCプロットの左下隅にある小さな細胞の破片を除外するためにも使用されます。細胞をさらにゲートして、FSCおよびSSCの高さと幅のシグナルに基づいてダブレットを除外し、得られた一重項細胞を7-AADで染色して生存率を評価します。生細胞は、Sca1およびCD31/CD45発現についてさらに評価され、系統陽性細胞をさらなる分析から除外します。次に、系統陰性のSca1陰性シングレットをVCAM-1およびα7-インテグリンについて染色して、FAPとMuSCを区別します。FAPはCD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-細胞として識別され、MuSCはCD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+細胞として識別されます。あるいは、生細胞は、FAPを区別するためにCD31/CD45およびGFP-PDGFRαに対してもゲーティングされる。FAPは、CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-インテグリン-細胞として同定されます。
このプロトコルは、FAP集団を単離するための2つのゲーティング戦略を提示します:内因性PDGFRα-EGFPレポーターを使用するか、Sca1抗体で細胞染色を行うことによって。PDGFRα-EGFPノックインレポーターマウス(B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18は、内在性PDGFRα遺伝子座由来のH2B-eGFP融合遺伝子を発現し、PDGFRα系統の効率的かつ特異的な標識を可能にします(図3A)。このマウスラインは、以前はPdgfrα+ FAPを単離するために使用されており、GFPレポーターは非常に可視で特異的なシグナルを提供するため、FAPの単離に非常に役立ちます19。あるいは、このプロトコルは、FAPを識別するためのSca1ベースの分離方法を記述します。Sca1(Ly-6A / E)は、筋肉製剤中のFAPを同定および分離するために一般的に使用されます13、16、17。Sca1は、Ly-6ファミリー20の18-kDaグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合タンパク質メンバーです。しかし、Sca1の発現は間葉系前駆筋細胞の細胞表面に発現するだけでなく、造血幹細胞(HSC)や成熟白血球、T細胞でも見られます。本プロトコールでは、FACSを用いた系統追跡研究を行うことにより、Sca1がFAPのマーカーとして適格であることを確認した。具体的には、PDGFRα-EGFPマウスを用いて、単核細胞の集団の中からSca1+/GFP発現FAPを単離した。その結果、すべてのGFP発現細胞がSca1陽性、CD31、CD45、VCAM-1、α7-インテグリンも陰性であることがわかりました(図4)。この分析により、静止および活性化FAPの両方におけるFAPのマーカーとしてのSca1抗体の使用が確認され、FAPを単離するためのいずれかの戦略の不明瞭な使用のための手段を提供します。
このプロトコルでは、損傷後7日目にノテキシンの筋肉内注射で負傷した成体マウスからもFAPおよびMuSCを単離しました(図5)。損傷後、MuSCとFAPはin vivoで活性化および増殖し、3日目から4日目の間に増殖のピークに達します2,3。これらの増殖の変化は、Sca1/PDFGRαおよびVCAM-1/α7-インテグリン陽性細胞の割合の増加に反映されています。図6は、無傷および損傷後7日間のTAにおけるFAPおよびMuSCの定量化を表しています。損傷後2日目から3日目の間に増殖のピークが観察されますが、損傷後7日目でも細胞の増殖率が低いことが認識できます。MuSCが活性化されると、それらの細胞サイズが著しく増加します21,22。したがって、これらの細胞をFACSで分離する際に、FSC-AおよびSSC-Aパラメータを調整し、中央のそれらの細胞を含むようにゲートを拡張することが非常に重要です(図5A)。
単離された細胞集団の純度は、共培養GFP+ FAPおよびMuSCとPax7抗体の免疫染色によって確認されました。新たに単離されたGFP+ FAPおよびMuSCを1:1の比率で48時間共培養しました(図3B)。GFP+ FAPはPax7マーカーを発現しなかったが、MuSCはこの抗体と反応した。したがって、Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-インテグリンおよびLin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+ゲーティング戦略は、それぞれFAPおよびMuSCの純粋な集団を単離するのに効果的です。
図1:FAPおよびMuSC分離のグラフィカルな概要。 後肢筋からのFAPおよびMuSCの分離を示すグラフの概要。このプロトコルは、TA筋肉から単離された細胞にも適用されます。まず、酵素消化を受ける前に筋肉を集めて機械的に細かく刻みます。次に、筋肉混合物を20Gの針で処理し、ろ過して単核細胞の懸濁液を得る。次に、細胞を蛍光色素標識抗体のカクテルとともにインキュベートし、最終的にセルソーターに通して、FAPおよびMuSCの純粋な集団を単離します。その後、純粋な細胞集団は、ダウンストリームアプリケーションのために処理されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:静止状態のFAPとMuSCの代表的なFACSプロファイル。 (A-H)FAPとMuSCを分離するためのゲーティング戦略。(A)まず、SSCおよびFSCの特性に基づいて、細胞破片および(B、C)ダブレットを排除するようにサンプルをゲートします。(D)得られた単一細胞を7-AADで染色して、生存率を評価します。(E)次に、7-AAD陰性単一細胞をAPC-CD31/CD45およびパシフィックブルー-Sca1について評価し、系統陽性細胞をさらなる分析から除外します。(F,G)次に、系統陰性一重項をPE-Cy7-VCAM-1およびPE-α7-インテグリンについて染色します。(F)FAPはCD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-細胞として同定され、(G)MuSCはCD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+細胞として同定される。(h)GFPレポーターを用いたPDGFRα-EGFPマウスにおけるFAPs単離。(I-M)適切な補正とゲーティングを実証するための蛍光マイナス1(FMO)コントロールのFACSプロファイル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:FAPおよびMuSC細胞培養の検証 。 (A)GFPを発現する新たに単離されたFAPをプレーティングし、PDGFRα抗体で共染色した。核はDAPIで染色した。GFP(緑)、PDGFRα(赤)、およびDAPI(青)染色の合成画像が表示されます。スケールバー、25μm。(B)新たに単離したFAPs(緑)およびMuSCを48時間共培養し、Pax7(赤色)で染色した。核はDAPIで染色した。GFPを発現するFAPはPax7を発現しないが、MuSCはPax7のみを発現し、GFPに対して陽性ではないため、選別された両方の集団の純度が確認された。スケールバー、75μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PDGFRα-EGFPマウスおよびSca1発現は、成体マウスにおいてFAPsを特異的に標識する。 FAPはGFP+/Sca1+細胞として単離されます。7-AAD陰性単一細胞は、APC-CD31/CD45およびGFP-PDGFRαについて評価され、系統陽性細胞を除外し、FAPを区別します。系統陰性/Sca1陽性細胞は、MuSCを除外するためにPE-Cy7-VCAM-1およびPE-α7-インテグリンについて染色されます。FAPは、CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-細胞として同定される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:活性化されたFAPおよびMuSCの代表的なFACSプロファイル。 (A-H)活性化されたFAPおよびMuSCを分離するためのゲーティング戦略。(A)サンプルは、FSC-A対SSC-A密度プロットを作成することにより、細胞の破片を排除するためにゲートされます。関心のある人口に対応するために拡大されたゲートに注意してください。(B,C)サンプルはさらにゲート化され、SSCおよびFSCの特性に基づいてダブレットが除去されます。(D)得られた単一細胞を7-AADで染色して、生存率を評価します。(E)次に、7-AAD陰性単一細胞をAPC-CD31/CD45およびパシフィックブルー-Sca1について評価し、系統陽性細胞をさらなる分析から除外します。(F,G)次に、系統陰性一重項をPE-Cy7-VCAM-1およびPE-α7-インテグリンについて染色します。(F)FAPはCD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-細胞として同定され、(G)MuSCはCD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+細胞として同定される。(h)GFPレポーターを用いたPDGFRα-EGFPマウスにおけるFAPs単離。(I-M)適切な補正とゲーティングを実証するための蛍光マイナス1(FMO)コントロールのFACSプロファイル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:摂動していないTAおよび損傷したTAにおけるFAPおよびMuSCの定量化。 無傷および損傷後7日間のTA筋肉におけるFAPおよびMuSCの定量化。細胞計数は、採取した筋肉のmgs当たりに選別された細胞数で割ることにより行った。** P < 0.01 無傷者と負傷者の間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 7-AAD (μg/mL) |
CD31/CD45-APC (μg/mL) |
スカ1-パシフィックブルー (μg/mL) |
α 7-インテグリン-PE (μg/mL) |
VCAM-1-ビオチン (μg/mL) |
PE-Cy7ストレプトアビジン (μg/mL) |
||
| 無染色コントロール | |||||||
| 単一染色コントロール | |||||||
| 7-AAD(生存率制御) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| スカ1 | 5 | ||||||
| α7-インテグリン | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMOコントロール | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-インテグリン | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| 実験サンプル | |||||||
| フルステイン | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
表1:抗体染色マトリックス。 実験サンプルおよび対照サンプルの染色に使用した抗体濃度のリスト。GFPによりFAPを単離する場合、Sca1染色は省略することができる。代わりに、GFP 単一染色コントロールと GFP FMO を実行してください。
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Discussion
純粋な成体幹細胞集団の同定と単離のための効率的で再現性のあるプロトコルを確立することは、その機能を理解するための最初で最も重要なステップです。単離されたFAPおよびMuSCは、筋肉疾患の潜在的な治療法として移植実験におけるマルチオミクス解析を行うために使用することができ、または幹細胞治療における疾患モデリングのために遺伝子改変することができる。
ここで説明するプロトコルは、成体マウスの後肢の筋肉から得られたFAPおよびMuSCの同定、単離、および培養のための標準化されたガイドラインを提供します。FAPおよびMuSCの純粋な集団をFACSベースの技術を用いて単離し、その後、特定の細胞表面マーカーおよび遺伝的手段を用いて細胞を免疫染色することによってそれらの純度を評価した。
このプロトコルは、FAPとMuSCの収量に大きな影響を与える3つの主要なセクションで構成されています:機械的および酵素的な筋肉消化、20 G針を介した単核細胞懸濁液の生成、およびFACSを介した単一細胞の最終的な単離。
適切な筋肉ミンチを行うことは、単一細胞を放出するために非常に重要です。ミンチ後に筋肉片の最適なサイズに達すると、消化に使用される酵素が最適に機能し、ステップ4.1で使用される針の詰まりを防ぐため、このステップに重点を置く必要があります。一方、筋肉を過剰にミンチすると、MuSCが最初の消化中に急速に放出され、ステップ3.7.2または3.8.2で吸引される可能性があるため、細胞収量が低下し、細胞生存率が低下する可能性があります14。さらに、筋肉製剤の消化に使用される酵素の効率は、異なる酵素ロット間で変動性があるか、時間とともに酵素の活性が低下する可能性があるため、酵素解離の質にも影響します23。したがって、消化のタイミングと濃度を最適化するために、酵素の各バッチをテストすることをお勧めします。さらに、筋肉を消化するのに必要な濃度および時間は、筋肉のこわばりに影響を与える病的状態によっても影響を受ける可能性がある。これらの特定の条件には、個別の最適化が必要です。
単核細胞の最終世代は、20 Gの針を備えた10 mLシリンジに懸濁液を通すことによって起こります。このステップを実行する際には、それらの破裂がさらなる細胞損傷を引き起こすので形成される気泡の数を最小限に抑えるために特別な注意を払うべきである24。
次に、細胞懸濁液を抗体カクテルで染色し、セルソーターで取得します。適切なゲートを設定することも重要なステップです。これらの実験を行う際には、放出スピルオーバーを適切に補正し、スピルオーバー拡散によるバックグラウンド信号を考慮するために、リストされている単一染色コントロールとFMOコントロールを実行することを強くお勧めします。これは、GFPのような明るい蛍光タンパク質や、VCAM-1-ビオチン/ストレトパビジン-PE-Cy7複合体のような間接染色を扱う場合に特に重要です。
さらに、この実験を初めて実行する前に、目的の集団を検出するために使用される抗体の滴定を実行することをお勧めします。抗体の最適濃度を決定することは、陽性集団の最も明るいシグナルを確保し、バックグラウンド染色の増加を回避するための重要なステップです。
選別が完了したら、選別された細胞に対して選別後の分析を実行して、それらの純度と生存率を決定することが重要です。選別された細胞の収量と生存率は、サンプルの処理に必要な時間に大きく影響されるため、複数のマウスの処理を計画する際には考慮に入れる必要があります。さらに、選別された細胞を2倍の血清濃縮培地で氷上に保つことで、細胞の回復を助け、生存率を向上させることができます。
このプロトコルでは、FAPおよびMuSCは、損傷していないマウスの前脛骨筋から、およびノテキシン注射の7日後に分離されました。急性損傷の後、異なるFAPおよびMuSC亜集団が再生中の筋肉組織において一過性に発現することが報告されている。今回、Malecovaたちは、FAPを発現するVCAM-1の亜集団の存在を報告しており、損傷を受けていない筋肉には存在せず、急性炎症では損傷後2日目から3日目の間にピークに達し、マウスジストロフィーマウスでは持続した13。同様に、Kafadarらは、損傷の2日後に筋原性前駆細胞の小さなサブセットでSca1の発現が一時的に増加したことを報告している25。しかし、Sca1+筋原性細胞は損傷25の3日後に大きく減少した。これらの亜集団の存在は、このプロトコルを使用してFAPおよびMuSCを早期に分離する際に認識および考慮する必要があります。
要約すると、このプロトコルは、健康なまたは損傷した成体マウスの筋肉のいずれかから単離されたFAPおよびMuSCの純粋な集団の単離および培養のための方法を記載する。細胞の高い純度と生存率により、このプロトコルはさらなるダウンストリームアプリケーションに適しています。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
MuSCの分離に関するアドバイスをくださったTom Cheung氏(香港科技大学)に感謝します。この作業は、NIAMS-IRPによって、NIH助成金AR041126およびAR041164を通じて資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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