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Developmental Biology

एफएसीएस-अलगाव और फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों और मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति अनियंत्रित और घायल माउस कंकाल की मांसपेशी से

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63983
Automatic Translation
1, 2, 1
1Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health (NIH), 2Flow Cytometry Section, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health (NIH)

Summary

फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज कोशिकाओं (एफएपी) और मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) की सटीक पहचान शारीरिक और रोग स्थितियों में उनके जैविक कार्य का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस मांसपेशियों से एफएपी और एमयूएससी के अलगाव, शुद्धिकरण और संस्कृति के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है।

Abstract

फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज कोशिकाएं (एफएपी) कंकाल की मांसपेशी-निवासी मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एमएससी) की आबादी हैं जो फाइब्रोजेनिक, एडिपोजेनिक, ओस्टियोजेनिक या चोंड्रोजेनिक वंश के साथ अंतर करने में सक्षम हैं। मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) के साथ, एफएपी मांसपेशी होमियोस्टेसिस, मरम्मत और उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जबकि बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) को सक्रिय रूप से बनाए रखते हैं और फिर से तैयार करते हैं। पैथोलॉजिकल स्थितियों में, जैसे कि पुरानी क्षति और मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी, एफएपी विपथन सक्रियण से गुजरते हैं और कोलेजन-उत्पादक फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जिससे फाइब्रोसिस और इंट्रामस्क्युलर फैटी घुसपैठ होती है। इस प्रकार, एफएपी मांसपेशियों के उत्थान में दोहरी भूमिका निभाते हैं, या तो एमयूएससी टर्नओवर को बनाए रखने और ऊतक की मरम्मत को बढ़ावा देने या फाइब्रोटिक निशान गठन और एक्टोपिक वसा घुसपैठ में योगदान करके, जो कंकाल की मांसपेशी ऊतक की अखंडता और कार्य से समझौता करते हैं। शारीरिक और पैथोलॉजिकल स्थितियों में इन कोशिकाओं की जैविक भूमिका को समझने के लिए एफएपी और एमयूएससी का उचित शुद्धिकरण एक शर्त है। यहां, हम प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके वयस्क चूहों के अंग की मांसपेशियों से एफएपी और एमयूएससी के एक साथ अलगाव के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल पूरे अंग की मांसपेशियों और घायल टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों से मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं के यांत्रिक और एंजाइमी पृथक्करण का विस्तार से वर्णन करता है। एफएपी और एमयूएससी को बाद में शुद्ध सेल आबादी प्राप्त करने के लिए अर्ध-स्वचालित सेल सॉर्टर का उपयोग करके अलग किया जाता है। हम इसके अतिरिक्त अकेले या सहसंस्कृति स्थितियों में शांत और सक्रिय एफएपी और एमयूएससी की खेती के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी शरीर में सबसे बड़ा ऊतक है, वयस्क मानव वजन के ~ 40% के लिए लेखांकन, और मुद्रा बनाए रखने, आंदोलन पैदा करने, बेसल ऊर्जा चयापचय को विनियमित करने और शरीर के तापमान के लिए जिम्मेदार है1. कंकाल की मांसपेशी एक अत्यधिक गतिशील ऊतक है और इसमें विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं के अनुकूल होने की उल्लेखनीय क्षमता होती है, जैसे कि यांत्रिक तनाव, चयापचय परिवर्तन और दैनिक पर्यावरणीय कारक। इसके अलावा, कंकाल की मांसपेशी तीव्र चोट के जवाब में पुनर्जीवित होती है, जिससे इसकी आकृति विज्ञान और कार्यों की पूरी बहालीहोती है 2. कंकाल की मांसपेशी प्लास्टिसिटी मुख्य रूप से निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) की आबादी पर निर्भर करती है, जिसे उपग्रह कोशिकाएं भी कहा जाता है, जो मायोफाइबर प्लाज्मा झिल्ली और बेसल लामिना 2,3 के बीच स्थित हैं। सामान्य परिस्थितियों में, एमयूएससी सेलुलर टर्नओवर की भरपाई करने और स्टेम सेल पूल4 को फिर से भरने के लिए केवल कुछ डिवीजनों के साथ, एक शांत अवस्था में मांसपेशियों के आला में रहते हैं। चोट के जवाब में, एमयूएससी कोशिका चक्र में प्रवेश करते हैं, प्रसार करते हैं, और या तो नए मांसपेशी फाइबर के गठन में योगदान करते हैं या आत्म-नवीकरण प्रक्रिया 2,3 में आला पर लौटते हैं। एमयूएससी के अलावा, कंकाल की मांसपेशियों का होमोस्टैटिक रखरखाव और उत्थान फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों (एफएपी) 5,6,7 नामक मांसपेशी निवासी कोशिकाओं की आबादी के समर्थन पर निर्भर करता है। एफएपी मांसपेशियों के संयोजी ऊतक में एम्बेडेड मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं हैं और फाइब्रोजेनिक, एडिपोजेनिक, ओस्टियोजेनिक, या चोंड्रोजेनिक वंश 5,8,9,10 के साथ अंतर करने में सक्षम हैं। एफएपी एमयूएससी के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करते हैं क्योंकि वे मांसपेशी स्टेम सेल आला में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का स्रोत हैं। एफएपी साइटोकिन्स और विकास कारकों को स्रावित करके कंकाल की मांसपेशियों के दीर्घकालिक रखरखाव को भी बढ़ावा देते हैं जो मायोजेनेसिस और मांसपेशियों की वृद्धि 6,11 के लिए ट्रॉफिक समर्थन प्रदान करते हैं। तीव्र मांसपेशियों की चोट पर, एफएपी तेजी से एक क्षणिक आला का उत्पादन करने के लिए फैलता है जो पुनर्जन्म मांसपेशियों की संरचनात्मक अखंडता का समर्थन करता है और एमयूएससी प्रसार और भेदभाव को पैराक्राइन तरीके से बनाए रखने के लिए एक अनुकूल वातावरण प्रदान करताहै 5. जैसे-जैसे उत्थान आगे बढ़ता है, एफएपी को एपोप्टोसिस द्वारा पुनर्योजी मांसपेशियों से साफ कर दिया जाता है, और उनकी संख्या धीरे-धीरे बेसल स्तर12 पर वापस आ जाती है। हालांकि, पुरानी मांसपेशियों की चोट के पक्ष में स्थितियों में, एफएपी प्रो-एपोप्टोटिक सिग्नलिंग को ओवरराइड करते हैं और मांसपेशियों के आला में जमा होते हैं, जहां वे कोलेजन-उत्पादक फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जिससे एक्टोपिक वसा घुसपैठ और फाइब्रोटिक निशान गठन12,13 होता है।

उनकी मल्टीपोटेंसी और उनकी पुनर्योजी क्षमताओं के कारण, एफएपी और एमयूएससी को कंकाल की मांसपेशी विकारों के उपचार के लिए पुनर्योजी चिकित्सा में संभावित लक्ष्यों के रूप में पहचाना गया है। इसलिए, उनके कार्य और चिकित्सीय क्षमता की जांच करने के लिए, एफएपी और एमयूएससी के अलगाव और संस्कृति के लिए कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल स्थापित करना महत्वपूर्ण है।

प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) आकार और दानेदारता जैसी रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर विभिन्न सेल आबादी की पहचान कर सकता है, और सेल सतह मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के उपयोग के आधार पर सेल-विशिष्ट अलगाव की अनुमति देता है। वयस्क चूहों में, एमयूएससी संवहनी कोशिका आसंजन अणु 1 (वीसीएएम -1, जिसे सीडी 106 के रूप में भी जाना जाता है) 14,15 और α7-इंटीग्रिन15 को व्यक्त करते हैं, जबकि एफएपी प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर α (पीडीजीएफआर) और स्टेम सेल एंटीजन 1 (एससीए 1 या लाइ 6 ए / . यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, एमयूएससी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/एससीए1-/वीसीएएम-1+/α7-इंटीग्रिन+ के रूप में की गई थी, जबकि एफएपी की पहचान सीडी31-/सीडी45-/एससीए1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-के रूप में की गई थी। वैकल्पिक रूप से, पीडीजीएफआरयूईजीएफपी चूहों को एफएपी को सीडी 31-/सीडी45-/पीडीजीएफआरयू +/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन- घटनाओं18,19 के रूप में अलग करने के लिए नियोजित किया गया था। इसके अलावा, हमने पीडीजीएफआर-जीएफपी + कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट सिग्नल के बीच ओवरलैपिंग की तुलना सतह मार्कर एससीए 1 द्वारा पहचानी गई कोशिकाओं से की। हमारे विश्लेषण से पता चला है कि सभी जीएफपी-व्यक्त कोशिकाएं एससीए 1 के लिए भी सकारात्मक थीं, यह दर्शाता है कि एफएपी की पहचान और अलगाव के लिए या तो दृष्टिकोण नियोजित किया जा सकता है। अंत में, विशिष्ट मार्कर एंटीबॉडी के साथ धुंधला प्रत्येक सेल आबादी की शुद्धता की पुष्टि की।

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Protocol

प्रदर्शन किए गए सभी पशु प्रयोग राष्ट्रीय गठिया, मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोग संस्थान (एनआईएएमएस) की पशु देखभाल और उपयोग समिति (एसीयूसी) द्वारा अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में आयोजित किए गए थे। इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने वाले जांचकर्ताओं को अपने स्थानीय पशु नैतिकता दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए।

नोट: यह प्रोटोकॉल वयस्क नर और मादा चूहों (3-6 महीने) के हिंद अंग और घायल टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों से एफएपी और एमयूएससी को अलग करने के तरीके का विस्तार से वर्णन करता है और एफएपी और एमयूएससी को कोकल्चर करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है। प्रयोगात्मक प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों बाँझ स्थितियों में और कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो।

1. अभिकर्मक सेटअप

  1. मध्यम धोएं (डब्ल्यूएम): हैम के एफ -10 पोषक तत्व मिश्रण सेल मीडिया में 10% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) घोड़े के सीरम और 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़कर इस समाधान को तैयार करें। डब्ल्यूएम को अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. मांसपेशी पृथक्करण बफर (एमडीबी): डब्ल्यूएम में कोलेजनेज द्वितीय को भंग करके इस बफर को तैयार करें। यदि पूरे हिंद अंग की मांसपेशियों को इकट्ठा करते हैं, तो प्रत्येक माउस के लिए डब्ल्यूएम के 10 एमएल में 1000 यू / एमएल कोलेजनेज द्वितीय को भंग करें (50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में तैयार होने के लिए)। यदि टीए मांसपेशियों को इकट्ठा करते हैं, तो प्रत्येक माउस के लिए डब्ल्यूएम के 7 एमएल में 800 यू / एमएल कोलेजनेज द्वितीय को भंग करें (15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में तैयार होने के लिए)। टीए मांसपेशियों के लिए, यह सेल छर्रों को बेहतर ढंग से कल्पना करने और एफएपी और एमयूएससी की उच्च उपज प्राप्त करने में मदद करेगा। मांसपेशियों को इकट्ठा करने से पहले एमडीबी ताजा तैयार करें और जरूरत पड़ने तक इसे बर्फ पर रखें।
  3. कोलेजनेज द्वितीय समाधान स्टॉक: बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में कोलेजनेज द्वितीय को 1000 यू / एमएल की अंतिम एकाग्रता में भंग करके इस समाधान को तैयार करें। 0.45 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें और 1 एमएल स्टॉक में विभाज्य करें। समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. डिस्पेज़ समाधान स्टॉक: बाँझ 1 एक्स पीबीएस में विघटन को 11 यू / एमएल की अंतिम एकाग्रता में भंग करके इस समाधान को तैयार करें। 0.45 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें और 1 एमएल स्टॉक में विभाज्य करें। समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. वॉल्यूम) भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2.5 एनजी / एमएल एफजीएफ के साथ डीएमईएम को पूरक करके एफएपी की संस्कृति माध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम स्टोर करें।
  6. 10% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) घोड़े के सीरम, 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2.5 एनजी / एमएल एफजीएफ के साथ एफ 10 के पूरक एमयूएससी की संस्कृति माध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम स्टोर करें।
  7. वॉल्यूम) भ्रूण गोजातीय सीरम, 10% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) घोड़े सीरम, 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2.5 एनजी / एमएल एफजीएफ के साथ डीएमईएम को पूरक करके कोकल्चर माध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम स्टोर करें।

2. हिंद अंग मांसपेशियों की कटाई

  1. 6 सेमी डिश (प्रति माउस एक डिश) में 2-3 एमएल डब्ल्यूएम जोड़ें और इसे बर्फ पर रखें।
  2. श्वासावरोध द्वारा इच्छामृत्यु करें: माउस को सीओ2 कक्ष में रखें और 100% सीओ2 पेश करें। मृत्यु की पुष्टि करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करें।
  3. एक विच्छेदन पैड पर माउस लापरवाह प्लेस और संदूषण से बचने के लिए 70% (वॉल्यूम /
  4. माउस पेट त्वचा के केंद्र चुटकी और क्षैतिज रूप से खोलने ~ 1 सेमी काटने के लिए संदंश का प्रयोग करें। नीचे की मांसपेशियों को उजागर करने के लिए विपरीत दिशाओं में उद्घाटन खींचकर माउस में घाव किनारों और डेस्क को समझें। उस समय माउस के हिंद अंग के एक तरफ उजागर करें।
  5. मांसपेशियों को इकट्ठा करने से पहले, हैमस्ट्रिंग और क्वाड्रिसेप्स के समीपस्थ अंत के बीच इंटरमस्कुलर वसा को हटा दें। इससे एफएपी और एमयूएससी के अलगाव में सुधार होगा।
  6. ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना, टीए और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशियों के नीचे उजागर करने के लिए प्रावरणी को तोड़ने और छीलने के लिए तेज संदंश का उपयोग करें। टिबिया से मांसपेशियों को अलग करने के लिए टीए / ईडीएल मांसपेशियों के नीचे संदंश की तेज नोक चलाएं।
  7. ईडीएल को टखने से जोड़ने वाले टेंडन को काट ें और इसे संदंश के साथ पकड़ते समय, टीए / ईडीएल की अनुदैर्ध्य रेखा के साथ कैंची के साथ मांसपेशियों को ट्रिम करें। ईडीएल मांसपेशियों को अलग करने के लिए घुटने के चारों ओर टेंडन काटें। मांसपेशियों को बर्फ पर रखे 6 सेमी डिश में रखें।
  8. टखने पर सभी टेंडन को काटकर और टिबिया और फाइबुला से मांसपेशियों को अलग करके गैस्ट्रोनेमियस और एकमात्र मांसपेशियों को अलग करने के लिए आगे बढ़ें। घुटने के चारों ओर काटें और मांसपेशियों को 6 सेमी पकवान में स्थानांतरित करें।
  9. क्वाड्रिसेप्स के चारों ओर प्रावरणी को छीलें और मांसपेशियों और हड्डी के बीच संदंश की तेज नोक चलाकर इसे फीमर से अलग करें। घुटने के चारों ओर टेंडन काटें और, डिस्टल छोर पर संदंश के साथ क्वाड्रिसेप्स को पकड़ते हुए, फीमर के साथ काटकर बाकी मांसपेशियों को ट्रिम करें। मांसपेशियों को 6 सेमी डिश में रखें।
  10. फीमर के चारों ओर हैमस्ट्रिंग और शेष मांसपेशियों को अलग करें और उन्हें 6 सेमी डिश में स्थानांतरित करें। बर्फ पर रखे 6 सेमी पकवान में हिंद अंग की मांसपेशियों को इकट्ठा करें।
    नोट: रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचें, जब संभव हो, रक्त के गुच्छों के गठन को रोकने के लिए जो डाउनस्ट्रीम अलगाव में हस्तक्षेप कर सकते हैं। यदि रक्तस्राव होता है, तो रक्त को अवशोषित करने के लिए बाँझ धुंध के साथ तुरंत एक्साइज्ड पोत को धब्बा दें।
  11. कॉन्ट्रालेटरल अंग से टीए, ईडीएल, गैस्ट्रोनेमियस, सोलस, क्वाड्रिसेप और हैमस्ट्रिंग मांसपेशियों को इकट्ठा करें।
    नोट: पूरे हिंद अंग की मांसपेशियों को अलग करते समय, दो या अधिक चूहों को पूल न करें। यदि टीए मांसपेशियों को अलग करना है, तो तीन टीए मांसपेशियों को पूल किया जा सकता है।

3. यांत्रिक और एंजाइमी मांसपेशी पाचन

  1. 6 सेमी पकवान से डब्लूएम एस्पिरेट करें और मांसपेशियों को नम रखने के लिए एमडीबी के 1-2 एमएल जोड़ें।
  2. अच्छी तरह से कीमा बनाया हुआ ऊतक का घोल पेस्ट प्राप्त करने तक मांसपेशियों को अच्छी तरह से कीमा बनाएं। ऐसा करने के लिए, मांसपेशियों के एक टुकड़े के एक छोर को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें, फिर मांसपेशियों को कम तंग होने तक फाड़ने और टुकड़ा करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें।
  3. कैंची का उपयोग करके, मांसपेशियों को 1-2 मिनट के लिए छोटे टुकड़ों में काटते रहें। मांसपेशियों के प्रत्येक समूह के लिए इस चरण को दोहराएं जब तक कि एक अच्छी तरह से कीमा बनाया हुआ मांसपेशी कीचड़ प्राप्त न हो जाए।
    नोट: यह एफएपी और एमयूएससी की उपज को अधिकतम करने के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। उचित मांसपेशियों की कीमा बनाने सुनिश्चित करने के लिए इस चरण में 8-10 मिनट (4-5 मिनट यदि केवल टीए मांसपेशियों को अलग करना) खर्च करने की सिफारिश की जाती है।
  4. एमडीबी युक्त शंक्वाकार ट्यूब के लिए प्रत्येक माउस से कीमा बनाया हुआ मांसपेशियों स्थानांतरण।
  5. प्रयोगशाला फिल्म के साथ ट्यूबों सील और 1 घंटे के लिए आंदोलन (75 आरपीएम) के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में सेते हैं। मिलाते हुए पथ के साथ क्षैतिज रूप से ट्यूबों रखें और ट्यूबों को पानी में डूबे रखने के लिए वजन का उपयोग करें।
  6. कोलेजनेज द्वितीय स्टॉक के 1 एमएल और माउस प्रति डिस्पेस स्टॉक के 1 एमएल पिघलना। उपयोग करने से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर एक झूलते बाल्टी रोटर में डिस्पेस स्टॉक स्पिन करें। केवल सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें।
  7. यदि पूरे हिंद अंग की मांसपेशियों को एकत्र किया गया था, तो निम्नानुसार आगे बढ़ें:
    1. 1 घंटे के बाद, शेकर से ट्यूब को हटा दें और इसे डब्ल्यूएम के साथ 50 एमएल तक भरें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 एक्स जी पर एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला के 42 मिलीलीटर दो नए ट्यूबों (प्रत्येक ट्यूब में ~ 21 मिलीलीटर) में स्थानांतरण और मूल ट्यूब में ~ 8 एमएल छोड़ दें।
      1. डब्ल्यूएम के साथ 50 मिलीलीटर तक सतह पर तैरनेवाला के 21 मिलीलीटर युक्त नई ट्यूबों को भरें 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 एक्स जी पर एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र करें। सभी सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और छर्रों को बर्फ पर रखें।
    3. एमडीबी के ~ 8 एमएल युक्त मूल ट्यूब में कोलेजनेज द्वितीय स्टॉक के 1 एमएल और डिस्पेस स्टॉक के 1 एमएल जोड़ें।
    4. एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, क्लॉगिंग के बिना गोली को 10 बार पुन: निलंबित करें। बुलबुले के गठन से परहेज करते हुए, ट्यूब की दीवार की ओर समाधान निकालें। यदि पुन: निलंबन के दौरान क्लॉगिंग होती है, तो मांसपेशियों के टुकड़ों को यंत्रवत् रूप से बाधित करने के लिए ट्यूब के नीचे के खिलाफ पिपेट की नोक को धक्का दें। चरण 3.9 पर आगे बढ़ें।
  8. यदि टीए मांसपेशियों को एकत्र किया गया था, तो निम्नानुसार आगे बढ़ें:
    1. 1 घंटे के बाद, शेकर से ट्यूब को हटा दें और उन्हें डब्ल्यूएम के साथ 15 एमएल तक भरें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 एक्स जी पर एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला के 13 मिलीलीटर एक नए 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण और मूल ट्यूब में ~ 2 एमएल छोड़ दें।
      1. डब्ल्यूएम के साथ 15 मिलीलीटर तक सतह पर तैरनेवाला के 13 मिलीलीटर युक्त नई ट्यूब भरें 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 एक्स जी पर एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र करें। सभी सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और गोली को बर्फ पर रखें।
    3. एक 1000 μL विंदुक टिप का उपयोग कर, क्लॉगिंग के बिना ऊपर और नीचे मूल ट्यूब में गोली को फिर से निलंबित करें।
    4. 2 एमएल एमडीबी युक्त मूल ट्यूब में कोलेजनेज II स्टॉक के 1 एमएल और डिस्पेज स्टॉक के 1 एमएल जोड़ें और डब्ल्यूएम के साथ 10 एमएल तक भरें।
  9. प्रयोगशाला फिल्म के साथ ट्यूबों सील और 30 मिनट के लिए आंदोलन (75 आरपीएम) के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में सेते हैं। चरण 3.5 में के रूप में ट्यूबों प्लेस.

4. मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं की पीढ़ी

नोट: यदि 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र टीए मांसपेशियों के साथ काम कर रहे हैं, तो चरण 4.1 के साथ आगे बढ़ने से पहले निलंबन को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।

  1. 30 मिनट के बाद, प्रकार के बरतन से ट्यूब को हटा दें। एस्पिरेट और 20 जी सुई के साथ 10 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से मांसपेशियों के निलंबन को सफलतापूर्वक 10 बार बाहर निकालें।
    नोट: बुलबुले और फोमिंग से बचने के लिए ट्यूब की दीवार की ओर मांसपेशियों के निलंबन को बाहर निकालें। बिना पचे हुए टेंडन या उपास्थि के छोटे टुकड़े आकांक्षा के पहले दौर के दौरान सुई को रोक सकते हैं। यदि क्लॉगिंग होती है, तो सुई की नोक से क्लॉग को हटाने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें।
  2. डब्ल्यूएम के साथ 50 एमएल तक प्रत्येक ट्यूब भरें और मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे दो बार पलटें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 एक्स जी पर एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब (~ 42 एमएल) में स्थानांतरित करें और मूल ट्यूब में ~ 8 एमएल छोड़ दें।
    1. डब्ल्यूएम के साथ 50 मिलीलीटर तक सतह पर तैरनेवाला के 42 मिलीलीटर युक्त नई ट्यूब भरें 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र करें। सभी सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और गोली को बर्फ पर रखें।
  4. डब्ल्यूएम के 8 एमएल युक्त मूल 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक 40 μm नायलॉन सेल छलनी रखें और डब्ल्यूएम के 1-2 एमएल के साथ सेल छलनी को पूर्व-गीला करें।
  5. 40 μm नायलॉन सेल छलनी पकड़े हुए, धीरे गोली 5-10 बार पुन: निलंबित करने के लिए एक 10 मिलीलीटर विंदुक का उपयोग करें। सेल हानि को कम करने के लिए एक ही ट्यूब में सेल छलनी के माध्यम से छर्रों को फ़िल्टर करें।
  6. इस चरण में, सुनिश्चित करें कि बर्फ पर सेल छर्रों के साथ अतिरिक्त ट्यूब हैं। छर्रों को फिर से निलंबित करने और मूल ट्यूब में स्थित सेल छलनी में समाधान को स्थानांतरित करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 4-5 मिलीलीटर डब्ल्यूएम जोड़कर उन छर्रों को मूल ट्यूब में वापस फ़िल्टर करें। गुरुत्वाकर्षण द्वारा फ़िल्टरिंग की अनुमति दें।
  7. मूल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी छर्रों को इकट्ठा करने के बाद, डब्ल्यूएम के एक और 4-5 एमएल के साथ सेल छलनी कुल्ला सेल छलनी के नीचे से सभी तरल इकट्ठा करने के लिए एक 1000 μL विंदुक का उपयोग करें।
  8. 50 एमएल तक डब्ल्यूएम के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें और मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे दो बार पलटें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 एक्स जी पर एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। गोली को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद तुरंत सभी सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
  10. डब्ल्यूएम के 600 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और इसे 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

5. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एंटीबॉडी धुंधला

नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए, निम्नलिखित नियंत्रण स्थापित करें: i) बिना दाग नियंत्रण, ii) लाइव सेल आबादी के लिए चयन करने के लिए व्यवहार्यता नियंत्रण, iii) फ्लोरोक्रोम उत्सर्जन स्पिलओवर के लिए सही करने के लिए एकल दाग मुआवजा नियंत्रण, और iv) प्रतिदीप्ति माइनस एक (एफएमओ) स्पिलओवर प्रसार के लिए लेखांकन द्वारा गेटिंग सीमाओं को सेट करने के लिए नियंत्रण। धुंधला नियंत्रण की पूरी सूची के लिए तालिका 1 देखें।

  1. बिना दाग नियंत्रण तैयार करने के लिए, सेल निलंबन के 10 μL को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 190 μL डब्ल्यूएम होता है। सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें और 35 μm सेल-छलनी टोपी के साथ 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब के माध्यम से फ़िल्टर करें। निलंबन को गुरुत्वाकर्षण द्वारा फ़िल्टर करने की अनुमति दें।
  2. सेल छलनी के नीचे से सभी तरल इकट्ठा करने के लिए एक 200 μL विंदुक का प्रयोग करें। एक टोपी के साथ सील करें और इसे बर्फ पर छोड़ दें, प्रकाश से संरक्षित।
  3. व्यवहार्यता, एफएमओ, और एकल दाग नियंत्रण तैयार करें: लेबल 10 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब और प्रत्येक ट्यूब में डब्ल्यूएम के 190 μL और सेल निलंबन के 10 μL जोड़ें। नियंत्रणों की पूरी सूची के लिए तालिका 1 देखें। प्रयोगात्मक नियंत्रण के आधार पर उपयुक्त ट्यूब में एंटीबॉडी जोड़ें। एंटीबॉडी संयोजन और एकाग्रता के बारे में जानकारी के लिए तालिका 1 देखें।
  4. बाकी सेल निलंबन (500 μL) को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब (प्रयोगात्मक ट्यूब) में स्थानांतरित करें और निम्नलिखित एंटीबॉडी जोड़ें: सीडी 31-एपीसी, सीडी 45-एपीसी, एससीए 1-पैसिफिक ब्लू, वीसीएएम -1-बायोटिन, और α7-इंटीग्रिन-पीई। एंटीबॉडी संयोजन और एकाग्रता के बारे में जानकारी के लिए तालिका 1 देखें।
  5. धीरे वर्दी वितरण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक ट्यूब अच्छी तरह से मिश्रण और प्रकाश से संरक्षित 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन प्रकार के बरतन में कोशिकाओं सेते हैं।
  6. 45 मिनट के बाद, डब्ल्यूएम के साथ 2 एमएल तक के सभी माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को भरें। पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबों को दो बार धीरे-धीरे पलटें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर एक निश्चित कोण रोटर के साथ एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में ट्यूबों अपकेंद्रित्र। गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा।
  7. डब्ल्यूएम के 300 μL में सभी माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  8. उचित ट्यूबों में स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी जोड़ें। एंटीबॉडी संयोजन और एकाग्रता के बारे में जानकारी के लिए तालिका 1 देखें। धीरे वर्दी वितरण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक ट्यूब अच्छी तरह से मिश्रण और प्रकाश से संरक्षित 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन प्रकार के बरतन में कोशिकाओं सेते हैं। शेष ट्यूबों को बर्फ पर छोड़ दें, प्रकाश से संरक्षित।
  9. 20 मिनट के बाद, डब्ल्यूएम के साथ 2 एमएल तक स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी युक्त माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर एक निश्चित कोण रोटर के साथ एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से आकांक्षा और डब्ल्यूएम के 300 μL में निलंबित कोशिकाओं.
  10. डब्ल्यूएम के 200 μL के साथ 10 5 मिलीलीटर पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूबों के 35 μm सेल छलनी टोपी को पूर्व-गीला करें उचित 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूबों के माध्यम से नियंत्रण ट्यूबों से फ़िल्टर करें। सेल छलनी के नीचे से सभी तरल इकट्ठा करने के लिए एक 200 μL विंदुक का प्रयोग करें। टोपी के साथ सील करें, ट्यूबों को बर्फ पर छोड़ दें, और उन्हें प्रकाश से बचाएं।
  11. डब्ल्यूएम के कुल 500 μL के लिए WM के एक अतिरिक्त 200 μL के साथ प्रयोगात्मक ट्यूब में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। डब्लूएम के 200 μL के साथ 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब की एक सेल छलनी टोपी को पूर्व-गीला करें। प्रयोगात्मक ट्यूब से सेल निलंबन को 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे गुरुत्वाकर्षण द्वारा फ़िल्टर करने की अनुमति दें।
  12. डब्ल्यूएम के 300 μL के साथ प्रयोगात्मक नमूना निलंबन युक्त 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब कुल्ला और एक ही छलनी टोपी के माध्यम से इसे पारित करें। सेल छलनी के नीचे से सभी तरल इकट्ठा करने के लिए एक 200 μL विंदुक का प्रयोग करें। एक टोपी के साथ सील करें, बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें, और उन्हें प्रकाश से बचाएं।
    नोट: यदि 35 μm सेल-छलनी टोपी का क्लॉगिंग होता है, तो प्रवाह-थ्रू की सुविधा के लिए बेंच पर ट्यूब को धीरे-धीरे टैप करें।
  13. एफएपी और एमयूएससी के लिए संग्रह ट्यूब तैयार करें और लेबल करें। यदि पूरे हिंद अंग की मांसपेशियों से कोशिकाओं को अलग करना है, तो कोशिकाओं को 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन राउंड-बॉटम ट्यूबों में 2 एक्स सीरम के साथ पूरक एफएपी या एमयूएससी संस्कृति माध्यम के 1 एमएल तक सॉर्ट करें। यदि टीए मांसपेशियों से कोशिकाओं को अलग करना, 2 एक्स सीरम के साथ पूरक संस्कृति माध्यम के 400 μL तक युक्त 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में एफएपी और एमयूएससी सॉर्ट करें।

6. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस)

नोट: यह प्रोटोकॉल एक कॉम्पैक्ट बेंचटॉप अनुसंधान प्रवाह साइटोमीटर को 100 μm नोजल से लैस करता है और नौ अलग-अलग फ्लोरोक्रोम (आगे और साइड स्कैटर सहित 11 पैरामीटर) का विश्लेषण करने की क्षमता के साथ तीन-लेजर कॉन्फ़िगरेशन (488 एनएम, 640 एनएम, 405 एनएम) की विशेषता है। इस प्रोटोकॉल और उनके संबंधित डिटेक्टर बैंडपास फिल्टर में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम निम्नानुसार हैं: पीई 586/42; पीई-साइ 7 783/56; एपीसी 660/10; पैसिफिक ब्लू 448/45; 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) 700/54, जीएफपी 527/32। कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर क्रमबद्ध किया जाता है और सॉर्ट के बाद बर्फ पर रहते हैं। इस उपकरण को संचालित करने से पहले, सुनिश्चित करें कि उपयोगकर्ता को तकनीकी अनुप्रयोग विशेषज्ञ द्वारा ठीक से प्रशिक्षित किया गया है।

  1. सेट अप और प्रदर्शन निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार सेल सॉर्टर की जाँच करें।
  2. एफएपी और एमयूएससी (चित्रा 2) की पहचान करने के लिए एक पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति स्थापित करें।
    1. निम्नलिखित योजना के आधार पर एफएपी को अलग करें: i) फॉरवर्ड सेल स्कैटर एरिया बनाम साइड सेल स्कैटर एरिया (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए) कोशिकाओं को मलबे बनाम अलग करने के लिए, ii) साइड सेल स्कैटर ऊंचाई बनाम साइड सेल स्कैटर चौड़ाई (एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू) एसएससी रेंज में डबलेट्स से सिंगलेट्स को भेदभाव करने के लिए, iii) फॉरवर्ड सेल स्कैटर ऊंचाई बनाम फॉरवर्ड सेल स्कैटर चौड़ाई (एफएससी-एच बनाम एफएससी-डब्ल्यू) डबल से सिंगलेट्स को भेदभाव करने के लिए और iv) जीवित बनाम मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए 7-एएडी क्षेत्र बनाम एसएससी-ए।
      1. यदि एंटीबॉडी-आधारित विधि के माध्यम से एफएपी को अलग करते हैं, तो निम्नलिखित योजना का उपयोग करें: वी) एपीसी-सीडी 45 / सीडी 31 क्षेत्र बनाम प्रशांत ब्लू-ली -6 ए / ई (एससीए 1) क्षेत्र आगे के विश्लेषण से सीडी 31 + और सीडी 45 + कोशिकाओं को बाहर करने के लिए, और छठी) पीई-सीवाई 7-वीसीएएम -1 क्षेत्र बनाम पीई-α7-एकीकृत क्षेत्र सीडी 31-/ एफएपी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/एससीए1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-इवेंट्स के रूप में की जाती है।
      2. यदि अंतर्जात जीएफपी रिपोर्टर विधि के माध्यम से एफएपी को अलग करना है, तो निम्नलिखित योजना का उपयोग करें: v) एपीसी-सीडी 45 / सीडी 31 क्षेत्र बनाम जीएफपी-पीडीजीएफआरयू क्षेत्र आगे के विश्लेषण से सीडी 31 + और सीडी 45 + कोशिकाओं को बाहर करने और जीएफपी + कोशिकाओं को अलग करने के लिए। एफएपी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/पीडीजीएफआरα+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-इवेंट्स के रूप में की जाती है।
    2. निम्नलिखित योजना के आधार पर एमयूएससी को अलग करें: i) फॉरवर्ड सेल स्कैटर एरिया बनाम साइड सेल स्कैटर एरिया (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए) कोशिकाओं को मलबे बनाम अलग करने के लिए, ii) साइड सेल स्कैटर ऊंचाई बनाम साइड सेल स्कैटर चौड़ाई (एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू) एसएससी रेंज में डबलेट्स से सिंगलेट्स को भेदभाव करने के लिए, iii) फॉरवर्ड सेल स्कैटर ऊंचाई बनाम फॉरवर्ड सेल स्कैटर चौड़ाई (एफएससी-एच बनाम एफएससी-डब्ल्यू) डबल से सिंगलेट्स को भेदभाव करने के लिए iv) लाइव बनाम मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए 7-एएडी क्षेत्र बनाम एसएससी-ए, v) एपीसी-सीडी 45/ सीडी 31 क्षेत्र बनाम पैसिफिक ब्लू-ली -6 ए / ई (एससीए 1) क्षेत्र आगे के विश्लेषण से सीडी 31 + और सीडी 45 + कोशिकाओं को बाहर करने के लिए, और vi) पीई-सीवाई 7-वीसीएएम -1 क्षेत्र बनाम पीई -α7-एकीकृत क्षेत्र सीडी 31- / एमयूएससी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/एससीए1-/वीसीएएम-1+/α7-इंटीग्रिन+ इवेंट्स के रूप में की जाती है।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेल आबादी एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए प्लॉट में ठीक से तैनात है और लाइव सिंगल कोशिकाओं पर ठीक से गेट करने के लिए बेदाग नियंत्रण और व्यवहार्यता नियंत्रण चलाएं।
  4. सभी एकल दाग नियंत्रण प्राप्त करें और स्पिलओवर मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करें।
  5. सभी एफएमओ नियंत्रण चलाएं और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रसार और सकारात्मक दाग वाली आबादी के बीच कट-ऑफ बिंदु निर्धारित करें।
  6. प्रयोगात्मक नमूने के अधिग्रहण से पहले लगभग 5-10 मिनट, 7-एएडी व्यवहार्यता डाई जोड़ें और धीरे से मिश्रण करें।
  7. एक बार जब सभी नियंत्रण संसाधित हो जाते हैं, तो एफएमओ नियंत्रण के अनुसार सॉर्ट गेट्स सेट करें; प्राप्त करें और प्रयोगात्मक नमूनों को सॉर्ट करें।
  8. सभी नमूनों को संसाधित करने के बाद, निर्माता के विनिर्देश के अनुसार साइटोमीटर को साफ करें। विश्लेषण के लिए सभी .fcs डेटा निर्यात करें।

7. एफएपी और एमयूएससी की संस्कृति

नोट: सॉर्ट की गई कोशिकाओं को सॉर्ट करने के तुरंत बाद सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, कोलेजन मैं लेपित प्लेटों पर एक उपयुक्त माध्यम में।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर एक निश्चित कोण रोटर में संग्रह ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  2. सेल गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा।
  3. एमयूएससी की संस्कृति के लिए, एमयूएससी संस्कृति माध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर मानक स्थितियों में सेते हैं।
    1. सेमी 2 के घनत्व पर प्लेट ताजा पृथक एमयूएससी और 15,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर एमयूएससी को सक्रिय किया।
    2. चढ़ाना के बाद, कोशिकाएं छोटी, गोलाकार और पारदर्शी दिखाई देती हैं। 36 घंटे के भीतर, एमयूएससी प्लेट की सतह का पालन करते हैं और धीरे-धीरे पहले 48 घंटे के लिए अपना आकार बढ़ाते हैं।
    3. माध्यम को हर 2 दिनों में बदलें।
      नोट: एमयूएससी सेल घनत्व के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। एमयूएससी को अपनी बढ़ती अवस्था में रखने के लिए, उन्हें तब तक बढ़ाएं जब तक कि वे 60% -70% संगम न हों। कोशिकाओं को नए कोलेजन में पारित करें मैंने व्यंजन या प्लेटों को लेपित किया और हर 2 दिनों में नया ताजा माध्यम जोड़ें। यदि एमयूएससी को 3-4 दिनों से अधिक समय तक एक ही डिश या प्लेट में रखा जाता है, तो वे एक लम्बी रूप प्राप्त करेंगे और एक साथ फ्यूज होने तक पड़ोसी कोशिकाओं के साथ संरेखित होंगे।
  4. एफएपी की संस्कृति के लिए, एमयूएससी संस्कृति माध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर मानक स्थितियों में सेते हैं।
    1. सेमी2 के घनत्व पर अप्रभावित मांसपेशियों से पृथक एफएपी प्लेट करें और 9,000 कोशिकाओं / सेमी2 पर घायल मांसपेशियों से अलग एफएपी।
      नोट: चढ़ाना के बाद, एफएपी पूरी तरह से 48 घंटे के भीतर प्लेट की सतह का पालन करते हैं, जबकि सक्रिय एफएपी कुछ घंटों के भीतर प्लेट से जुड़ते हैं। एक बार जब वे संलग्न हो जाते हैं, तो एफएपी एक छोटे सेल बॉडी और लम्बी सेल प्रक्रियाओं के साथ अपने विशिष्ट आकार को प्राप्त करते हैं, और वे तेजी से फैलते हैं।
    2. माध्यम को हर 2 दिनों में बदलें।
      नोट: एफएपी सेल घनत्व के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। कम घनत्व पर एफएपी बोने से खराब कोशिका वृद्धि और कोशिका मृत्यु हो सकती है। इसके विपरीत, उच्च बीजारोपण घनत्व पर एफएपी चढ़ाना सेल अस्तित्व को बढ़ावा देगा और उनके विस्तार में सुधार करेगा। क्षतिग्रस्त मांसपेशियों से प्राप्त एफएपी को आमतौर पर अक्षतिग्रस्त मांसपेशियों की तुलना में कम कोशिका घनत्व की आवश्यकता होती है, क्योंकि वे पहले से ही सक्रिय होते हैं। किसी की प्रयोगात्मक स्थितियों और नमूनों के स्रोत के आधार पर एफएपी चढ़ाना घनत्व को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है।
  5. सहसंस्कृति के लिए, 1: 1 के अनुपात में सहसंस्कृति माध्यम में एफएपी और एमयूएससी को फिर से निलंबित करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर मानक स्थितियों में उन लोगों को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें और हर 2 दिनों में माध्यम को प्रतिस्थापित करें।

8. सुसंस्कृत एफएपी और एमयूएससी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

  1. सेल माध्यम की आकांक्षा करें और 1x पीबीएस के साथ दो या तीन वॉश करें।
  2. आरटी पर 15 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस में 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. 2% पीएफए की आकांक्षा करें और जल्दी से कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो या तीन बार धो लें।
  4. सेल पारगम्यता और अवरुद्ध करें:
    1. ताजा पृथक एफएपी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, आरटी पर 30 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस + 0.1% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएसटी) + 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) + 5% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके सेल पारगम्यता और अवरुद्ध करें।
    2. ताजा पृथक एमयूएससी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएसटी + 1% बीएसए + 5% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके सेल पारगम्यता और अवरुद्ध करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें:
    1. ताजा पृथक एफएपी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, पीबीएसटी + 1% बीएसए + 5% एनडीएस में पतला बकरी एंटी पीडीजीएफआर प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 300) को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर लागू करें।
    2. ताजा पृथक एमयूएससी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, आरटी पर 45 मिनट के लिए पीबीएसटी + 1% बीएसए + 5% एनजीएस में पतला माउस एंटी पैक्स 7 प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 10) लागू करें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो या तीन बार धोएं।
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें:
    1. ताजा पृथक एफएपी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएसटी + 1% बीएसए में पतला गधा एंटी-बकरी आईजीजी (एच + एल) एलेक्सा फ्लोर 488 माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500) लागू करें।
    2. ताजा पृथक एमयूएससी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, आरटी पर 45 मिनट के लिए पीबीएसटी +1 % बीएसए में पतला बकरी एंटी-माउस आईजीजी 1 एलेक्सा फ्लोर 555 माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500) लागू करें।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो या तीन बार धोएं।
  9. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएसटी (1: 1000) में डीएपीआई के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके परमाणु काउंटर-धुंधला प्रदर्शन करें।
  10. डीएपीआई समाधान को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
    सावधानी: डीएपीआई विषाक्त और खतरनाक है; इसे देखभाल के साथ संभालें और इसे खतरनाक अपशिष्ट बोतल में निपटाएं।
  11. प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर करें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल जंगली प्रकार के वयस्क चूहों (3-6 महीने) के अप्रभावित हिंद अंगों से लगभग एक मिलियन एफएपी और 350,000 एमयूएससी के अलगाव की अनुमति देता है, जो एफएपी के लिए 8% की उपज और कुल घटनाओं के एमयूएससी के लिए 3% के अनुरूप है। क्षतिग्रस्त टीए से कोशिकाओं को छँटाई करते समय चोट के 7 दिन बाद, दो से तीन टीए मांसपेशियों को 300,000 एफएपी और 120,000 एमयूएससी प्राप्त करने के लिए पूल किया जाता है, जो क्रमशः 11% और 4% की उपज के अनुरूप होते हैं। पोस्ट-सॉर्ट शुद्धता मान आमतौर पर एफएपी और एमयूएससी के लिए 95% से ऊपर होते हैं।

एफएपी और एमयूएससी को अलग करने के लिए अपनाई गई गेटिंग रणनीति को चित्र 2 में चित्रित किया गया है। सबसे पहले, ब्याज की सेल आबादी को फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) बनाम साइड स्कैटर (एसएससी) घनत्व प्लॉट बनाकर पहचाना जाता है, जो सेल रूपात्मक गुणों के आधार पर कुछ हद तक सेलुलर पहचान की अनुमति देता है। इस गेटिंग रणनीति का उपयोग छोटे सेलुलर मलबे को बाहर करने के लिए भी किया जाता है, जो आमतौर पर एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट के निचले बाएं कोने पर स्थित होता है। कोशिकाओं को एफएससी और एसएससी ऊंचाई और चौड़ाई संकेतों के आधार पर डबलट्स को बाहर करने के लिए आगे गेट किया जाता है, और परिणामस्वरूप सिंगलेट कोशिकाओं को उनकी व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए 7-एएडी के साथ दाग दिया जाता है। जीवित कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण से वंश सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एससीए 1 और सीडी 31 / सीडी 45 अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन किया जाता है। वंशावली नकारात्मक एससीए 1 नकारात्मक सिंगलेट्स को तब एफएपी और एमयूएससी को अलग करने के लिए वीसीएएम -1 और α7-इंटीग्रिन के लिए दाग दिया जाता है। एफएपी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/एससीए1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-कोशिकाओं के रूप में की जाती है और एमयूएससी की पहचान सीडी31-/सीडी45-/एससीए1-/वीसीएएम-1+/α7-इंटीग्रिन+ कोशिकाओं के रूप में की जाती है। वैकल्पिक रूप से, एफएपी को अलग करने के लिए जीवित कोशिकाओं को सीडी 31 / सीडी 45 और जीएफपी-पीडीजीएफआरα के लिए भी गेट किया जाता है। एफएपी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/पीडीजीएफआरα+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-कोशिकाओं के रूप में की जाती है।

यह प्रोटोकॉल एफएपी आबादी को अलग करने के लिए दो गेटिंग रणनीतियों को प्रस्तुत करता है: या तो अंतर्जात पीडीजीएफआर-ईजीएफपी रिपोर्टर का उपयोग करके या एससीए 1 एंटीबॉडी के साथ सेल धुंधला प्रदर्शन करके। पीडीजीएफआर -ईजीएफपी नॉक-इन रिपोर्टर चूहों (बी 6.129 एस 4-पीडीजीएफआरटीएम 11 (ईजीएफपी) सोर / जे) 18 अंतर्जात पीडीजीएफआरयू लोकस से एच 2 बी-ईजीएफपी संलयन जीन को व्यक्त करते हैं, जिससे पीडीजीएफआरई वंश (चित्रा 3 ए) के कुशल और विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति मिलती है। इस माउस लाइन का उपयोग पहले पीडीजीएफआरई + एफएपी को अलग करने के लिए किया गया था और वास्तव में एफएपी के अलगाव के लिए बहुत उपयोगी है, क्योंकि जीएफपी रिपोर्टर एक अत्यधिक दृश्यमान और विशिष्ट सिग्नल19 प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, यह प्रोटोकॉल एफएपी की पहचान के लिए एक एससीए 1-आधारित अलगाव विधि का वर्णन करता है। एससीए 1 (एलवाई -6 ए / ई) का उपयोग आमतौर पर मांसपेशियों की तैयारी13,16,17 में एफएपी की पहचान करने और अलग करने के लिए किया जाता है। एससीए 1 एलवाई -6 परिवार20 का 18-केडीए ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (जीपीआई) से जुड़ा हुआ प्रोटीन सदस्य है। हालांकि, मेसेनकाइमल पूर्वज मांसपेशियों की कोशिकाओं की कोशिका सतह पर व्यक्त किए जाने के अलावा, एससीए 1 अभिव्यक्ति हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) के साथ-साथ परिपक्व ल्यूकोसाइट्स और टी कोशिकाओं में भी देखी जाती है। इस प्रोटोकॉल में, हमने एफएसीएस-आधारित वंश अनुरेखण अध्ययन करके एफएपी के मार्कर के रूप में एससीए 1 की उपयुक्तता की पुष्टि की। विशेष रूप से, पीडीजीएफआर-ईजीएफपी चूहों को मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं की आबादी के बीच एससीए 1 + / जीएफपी-व्यक्त एफएपी को अलग करने के लिए नियोजित किया गया था। हमने पाया कि सभी जीएफपी-व्यक्त कोशिकाएं एससीए 1 के लिए भी सकारात्मक थीं और सीडी 31, सीडी 45, वीसीएएम -1 और α7-इंटीग्रिन (चित्रा 4) के लिए नकारात्मक थीं। इस विश्लेषण ने शांत और सक्रिय एफएपी दोनों में एफएपी के लिए मार्कर के रूप में एससीए 1 एंटीबॉडी के उपयोग की पुष्टि की और एफएपी को अलग करने के लिए किसी भी रणनीति के अस्पष्ट उपयोग के लिए साधन प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल में, एफएपी और एमयूएससी को नोटेक्सिन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ घायल वयस्क चूहों से भी अलग किया गया था, 7 दिन बाद की चोट (चित्रा 5)। चोट लगने के बाद, एमयूएससी और एफएपी विवो में सक्रिय और प्रसार करते हैं, दिन 3 और 4 2,3 के बीच प्रसार के चरम पर पहुंच जाते हैं। प्रसार में ये परिवर्तन एससीए 1/पीडीएफजीआरα के साथ-साथ वीसीएएम-1/α7-इंटीग्रिन पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि से परिलक्षित होते हैं। चित्रा 6 अप्रभावित और 7 दिनों के बाद चोट टीए में एफएपी और एमयूएससी की मात्रा का ठहराव का प्रतिनिधित्व करता है; यद्यपि प्रसार में चोटी चोट के बाद 2 और 3 दिनों के बीच देखी जाती है, लेकिन चोट के 7 दिन बाद भी प्रसार कोशिकाओं की कम दर सराहनीय है। चूंकि एमयूएससी सक्रिय होते हैं, इसलिए उनके सेलुलर आकार21,22 में उल्लेखनीय वृद्धि होती है। इसलिए, एफएसीएस द्वारा इन कोशिकाओं को अलग करते समय, एफएससी-ए और एसएससी-ए मापदंडों को समायोजित करना और केंद्र (चित्रा 5 ए) में उन कोशिकाओं को शामिल करने के लिए गेट का विस्तार करना महत्वपूर्ण महत्व का है।

पृथक सेल आबादी की शुद्धता की पुष्टि पैक्स 7 एंटीबॉडी के साथ सहसंवर्धित जीएफपी + एफएपी और एमयूएससी के इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा की गई थी। ताजा पृथक जीएफपी + एफएपी और एमयूएससी को 1: 1 (चित्रा 3 बी) के अनुपात में 48 घंटे के लिए सहसंस्कृत किया गया था। जीएफपी + एफएपी ने पैक्स 7 मार्कर को व्यक्त नहीं किया, जबकि एमयूएससी ने इस एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की। इस प्रकार, लिन-/एससीए-1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन- और लिन-/एससीए-1-/वीसीएएम-1+/α7-इंटीग्रिन+ गेटिंग रणनीति क्रमशः एफएपी और एमयूएससी की शुद्ध आबादी को अलग करने में प्रभावी है।

Figure 1
चित्रा 1: एफएपी और एमयूएससी अलगाव का ग्राफिकल अवलोकन। हिंद अंग की मांसपेशियों से एफएपी और एमयूएससी अलगाव दिखाते हुए ग्राफिकल अवलोकन। प्रोटोकॉल टीए मांसपेशियों से अलग कोशिकाओं पर भी लागू होता है। सबसे पहले, मांसपेशियों को एंजाइमी पाचन से गुजरने से पहले एकत्र और यंत्रवत् कीमा बनाया जाता है। मांसपेशियों के मिश्रण को तब 20 ग्राम सुई के माध्यम से संसाधित किया जाता है और मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं के निलंबन को प्राप्त करने के लिए फ़िल्टर किया जाता है। कोशिकाओं को फ्लोरोफोर-संयुग्मित एंटीबॉडी के कॉकटेल के साथ ऊष्मायन किया जाता है और अंततः एफएपी और एमयूएससी की शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए सेल सॉर्टर के माध्यम से चलाया जाता है। शुद्ध सेल आबादी को तब डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए संसाधित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एफएपी और एमयूएससी के अलगाव के लिए शांत एफएपी और एमयूएससी (ए-एच) गेटिंग रणनीति के प्रतिनिधि एफएसीएस प्रोफाइल। (ए) सबसे पहले, नमूनों को एसएससी और एफएससी गुणों के आधार पर सेलुलर मलबे और (बी, सी) डबलट्स को बाहर करने के लिए गेट किया जाता है। (डी) परिणामी एकल कोशिकाओं को तब उनकी व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए 7-एएडी के साथ दाग दिया जाता है। (ई) 7-एएडी नकारात्मक एकल कोशिकाओं को तब एपीसी-सीडी 31 / सीडी 45 और पैसिफिक ब्लू-एससीए 1 के लिए मूल्यांकन किया जाता है ताकि आगे के विश्लेषण से वंश सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर किया जा सके। (एफ, जी) वंशावली नकारात्मक सिंगलेट्स को पीई-सीवाई 7-वीसीएएम -1 और पीई-α7-इंटीग्रिन के लिए दाग दिया जाता है। (एफ) एफएपी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/एससीए1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-कोशिकाओं के रूप में की जाती है और (जी) एमयूएससी की पहचान सीडी31-/सीडी45-/एससीए1-/वीसीएएम-1+/α7-इंटीग्रिन+ कोशिकाओं के रूप में की जाती है। (एच) जीएफपी रिपोर्टर का उपयोग करके पीडीजीएफआर-ईजीएफपी चूहों में एफएपी अलगाव। (आई-एम) उचित मुआवजे और गेटिंग का प्रदर्शन करने के लिए प्रतिदीप्ति माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण के लिए एफएसीएस प्रोफाइल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एफएपी और एमयूएससी सेल संस्कृति का सत्यापन( ए) जीएफपी व्यक्त करने वाले ताजा पृथक एफएपी को पीडीजीएफआर एंटीबॉडी के साथ चढ़ाया और सह-दाग दिया गया। नाभिक को डीएपीआई के साथ दाग दिया गया था। जीएफपी (हरा), पीडीजीएफआर (लाल), और डीएपीआई (नीला) धुंधला की मर्ज की गई छवियां प्रदर्शित की जाती हैं। स्केल सलाखों, 25 μm. (बी) ताजा पृथक एफएपी (हरा) और एमयूएससी को 48 घंटे के लिए सहसंस्कृत किया गया था और पैक्स 7 (लाल) के साथ दाग दिया गया था। नाभिक को डीएपीआई के साथ दाग दिया गया था। जीएफपी-व्यक्त एफएपी पैक्स 7 को व्यक्त नहीं करते हैं, जबकि एमयूएससी विशेष रूप से पैक्स 7 व्यक्त करते हैं और जीएफपी के लिए सकारात्मक नहीं हैं, दोनों क्रमबद्ध आबादी की शुद्धता की पुष्टि करते हैं। स्केल सलाखों, 75 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पीडीजीएफआर-ईजीएफपी चूहों और एससीए 1 अभिव्यक्ति विशेष रूप से वयस्क चूहों में एफएपी लेबल करते हैं। एफएपी को जीएफपी +/एससीए 1 + कोशिकाओं के रूप में अलग किया जाता है। 7-एएडी नकारात्मक एकल कोशिकाओं का मूल्यांकन एपीसी-सीडी 31 / सीडी 45 और जीएफपी-पीडीजीएफआरα के लिए वंश सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर करने और एफएपी को अलग करने के लिए किया जाता है। एससीए 1 सकारात्मक कोशिकाओं को एमयूएससी को बाहर करने के लिए पीई-सीवाई 7-वीसीएएम -1 और पीई-α7-इंटीग्रिन के लिए दाग दिया जाता है। एफएपी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/पीडीजीएफआरα+/एससीए1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-कोशिकाओं के रूप में की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सक्रिय एफएपी और एमयूएससी के अलगाव के लिए सक्रिय एफएपी और एमयूएससी (ए-एच) गेटिंग रणनीति के प्रतिनिधि एफएसीएस प्रोफाइल। (ए) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए घनत्व भूखंड बनाकर सेलुलर मलबे को बाहर करने के लिए नमूने गेट किए जाते हैं। ब्याज की आबादी को समायोजित करने के लिए बढ़े हुए गेट पर ध्यान दें। (बी, सी) एसएससी और एफएससी गुणों के आधार पर डबलट्स को खत्म करने के लिए नमूनों को आगे गेट किया जाता है। (डी) परिणामी एकल कोशिकाओं को तब उनकी व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए 7-एएडी के साथ दाग दिया जाता है। (ई) 7-एएडी नकारात्मक एकल कोशिकाओं को तब एपीसी-सीडी 31 / सीडी 45 और पैसिफिक ब्लू-एससीए 1 के लिए मूल्यांकन किया जाता है ताकि आगे के विश्लेषण से वंश सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर किया जा सके। (एफ, जी) वंशावली नकारात्मक सिंगलेट्स को पीई-सीवाई 7-वीसीएएम -1 और पीई-α7-इंटीग्रिन के लिए दाग दिया जाता है। (एफ) एफएपी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/एससीए1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-कोशिकाओं के रूप में की जाती है और (जी) एमयूएससी की पहचान सीडी31-/सीडी45-/एससीए1-/वीसीएएम-1+/α7-इंटीग्रिन+ कोशिकाओं के रूप में की जाती है। (एच) जीएफपी रिपोर्टर का उपयोग करके पीडीजीएफआर-ईजीएफपी चूहों में एफएपी अलगाव। (आई-एम) उचित मुआवजे और गेटिंग का प्रदर्शन करने के लिए प्रतिदीप्ति माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण के लिए एफएसीएस प्रोफाइल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: अप्रभावित और घायल टीए में एफएपी और एमयूएससी का परिमाणीकरण। "चोट रहित और चोट के बाद टीए मांसपेशियों में एफएपी और एमयूएससी की मात्रा का ठहराव"। सेल गिनती एकत्र की गई मांसपेशियों के प्रति मिलीग्राम क्रमबद्ध कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके की गई थी। ** पी < 0.01 घायल बनाम घायल के बीच। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7-एएडी
(μg/एमएल)		 सीडी 31/सीडी 45-एपीसी
(μg/एमएल)		 एससीए 1-पैसिफिक ब्लू
(μg/एमएल)		 α 7-इंटीग्रिन-पीई
(μg/एमएल)		 वीसीएएम -1-बायोटिन
(μg/एमएल)		 पीई-साइ 7 स्ट्रेप्टाविडिन
(μg/एमएल)
बिना दाग वाला नियंत्रण
एकल सना हुआ नियंत्रण
7-एएडी (व्यवहार्यता नियंत्रण) 1
सीडी 31/ 2
एससीए 1 5
α7-एकीकृत 0.4
वीसीएएम -1 5 2
एफएमओ नियंत्रण
एफएमओ 7 एएडी 2 5 0.4 5 2
एफएमओ सीडी 31/ 1 5 0.4 5 2
एफएमओ एससीए 1 1 2 0.4 5 2
एफएमओ α7-इंटीग्रिन 1 2 5 5 2
एफएमओ वीसीएएम -1 1 2 5 0.4
प्रायोगिक नमूना
पूरा दाग 1 2 5 0.4 5 2

तालिका 1: एंटीबॉडी धुंधला मैट्रिक्स। प्रयोगात्मक और नियंत्रण नमूनों को धुंधला करने के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडी सांद्रता की सूची। यदि जीएफपी द्वारा एफएपी को अलग करना है, तो एससीए 1 धुंधला छोड़ा जा सकता है। इसके बजाय, जीएफपी एकल दाग नियंत्रण और जीएफपी एफएमओ चलाएं।

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Discussion

शुद्ध वयस्क स्टेम सेल आबादी की पहचान और अलगाव के लिए कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल स्थापित करना उनके कार्य को समझने की दिशा में पहला और सबसे महत्वपूर्ण कदम है। पृथक एफएपी और एमयूएससी का उपयोग मांसपेशियों की बीमारियों के संभावित उपचार के रूप में प्रत्यारोपण प्रयोगों में मल्टीओमिक्स विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है या स्टेम सेल थेरेपी में रोग मॉडलिंग के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के हिंद अंग की मांसपेशियों से प्राप्त एफएपी और एमयूएससी की पहचान, अलगाव और संस्कृति के लिए मानकीकृत दिशानिर्देश प्रदान करता है। एफएपीएस और एमयूएससी की शुद्ध आबादी को एफएसीएस-आधारित तकनीक का उपयोग करके अलग किया गया था, और बाद में विशिष्ट सेल सतह मार्करों और आनुवंशिक साधनों के साथ इम्यूनोस्टेनिंग कोशिकाओं द्वारा उनकी शुद्धता का मूल्यांकन किया गया था।

प्रोटोकॉल में तीन मुख्य खंड होते हैं जो एफएपी और एमयूएससी की उपज को अत्यधिक प्रभावित करते हैं: यांत्रिक और एंजाइमी मांसपेशी पाचन, 20 जी सुई के माध्यम से एक मोनोन्यूक्लिएटेड सेल निलंबन की पीढ़ी, और एफएसीएस के माध्यम से एकल कोशिकाओं का अंतिम अलगाव।

एकल कोशिकाओं को छोड़ने के लिए उचित मांसपेशी कीमा बनाना महत्वपूर्ण महत्व का है। इस कदम पर जोर दिया जाना चाहिए, क्योंकि कीमा बनाने के बाद मांसपेशियों के टुकड़ों के इष्टतम आकार तक पहुंचने से पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों को सबसे अच्छा काम करने की अनुमति मिलती है और चरण 4.1 में उपयोग की जाने वाली सुई को बंद करने से रोकता है। दूसरी ओर, मांसपेशियों को ओवर-कीमा बनाने से खराब सेल उपज और कम सेल व्यवहार्यता हो सकती है, क्योंकि एमयूएससी पहले पाचन के दौरान तेजी से जारी किए जाते हैं और चरण 3.7.2 या 3.8.214 में आकांक्षी हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, मांसपेशियों की तैयारी के पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों की दक्षता एंजाइमी पृथक्करण की गुणवत्ता को भी प्रभावित करती है, क्योंकि विभिन्न एंजाइम लॉट के बीच परिवर्तनशीलता हो सकती है या समय23 के साथ एंजाइमों की गतिविधि में कमी हो सकती है। इसलिए, पाचन समय और एकाग्रता को अनुकूलित करने के लिए एंजाइमों के प्रत्येक बैच का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, मांसपेशियों को पचाने के लिए आवश्यक एकाग्रता और समय की मात्रा भी मांसपेशियों की कठोरता को प्रभावित करने वाली रोग स्थितियों से प्रभावित हो सकती है। इन विशेष स्थितियों के लिए व्यक्तिगत अनुकूलन की आवश्यकता होगी।

मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं की अंतिम पीढ़ी 20 ग्राम सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज के माध्यम से निलंबन चलाकर होती है। गठित बुलबुले की संख्या को कम करने के लिए इस कदम को करते समय विशिष्ट देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि उनके फटने से अतिरिक्त सेल क्षतिहोती है 24.

सेल निलंबन को तब एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ दाग दिया जाता है और सेल सॉर्टर के साथ अधिग्रहित किया जाता है। उचित फाटकों की स्थापना एक और महत्वपूर्ण कदम है। इन प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, उत्सर्जन स्पिलओवर के लिए ठीक से क्षतिपूर्ति करने और स्पिलओवर प्रसार के कारण पृष्ठभूमि संकेत के लिए खाते में सूचीबद्ध एकल दाग नियंत्रण और एफएमओ नियंत्रण चलाने की दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब जीएफपी जैसे उज्ज्वल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और वीसीएएम -1-बायोटिन / स्ट्रेटपाविडिन-पीई-सीवाई 7 कॉम्प्लेक्स जैसे अप्रत्यक्ष दाग से निपटना पड़ता है।

इसके अलावा, पहली बार इस प्रयोग को निष्पादित करने से पहले, ब्याज की आबादी का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी का अनुमापन करना अच्छा अभ्यास है। एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण सकारात्मक आबादी के सबसे उज्ज्वल संकेत को सुनिश्चित करने और पृष्ठभूमि धुंधला में वृद्धि से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।

एक बार छँटाई पूरी हो जाने के बाद, उनकी शुद्धता और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए सॉर्ट की गई कोशिकाओं पर पोस्ट-सॉर्ट विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है। क्रमबद्ध कोशिकाओं की उपज और व्यवहार्यता नमूने को संसाधित करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा से अत्यधिक प्रभावित होती है और कई चूहों को संसाधित करने की योजना बनाते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, 2x सीरम समृद्ध मीडिया में बर्फ पर क्रमबद्ध कोशिकाओं को रखने से सेल वसूली में मदद मिल सकती है और उनकी व्यवहार्यता में सुधार हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, एफएपी और एमयूएससी को अनियंत्रित चूहों के टिबियलिस पूर्वकाल की मांसपेशियों के साथ-साथ नोटेक्सिन इंजेक्शन के 7 दिनों बाद अलग किया गया था। एक तीव्र चोट के बाद, विभिन्न एफएपी और एमयूएससी उप-आबादी को पुनर्जीवित मांसपेशियों के ऊतकों में क्षणिक रूप से व्यक्त किए जाने की सूचना दी गई है। मालेकोवा और सहकर्मियों ने वीसीएएम -1 की उप-आबादी की उपस्थिति की सूचना दी है जो एफएपी व्यक्त करती है जो अक्षतिग्रस्त मांसपेशियों में अनुपस्थित है, तीव्र सूजन में चोट लगने के बाद 2 और 3 दिनों के बीच चरम पर है, और म्यूरिन डिस्ट्रोफिक चूहों में बनी हुई है13. इसी तरह, कफदार और सहकर्मियों ने चोट लगने के 2 दिन बाद मायोजेनिक पूर्वजों के एक छोटे सबसेट पर एससीए 1 की अभिव्यक्ति में क्षणिक वृद्धि की सूचना दीहै। हालांकि, एससीए 1 + मायोजेनिक कोशिकाओं को चोट25 के 3 दिन बाद बहुत कम कर दिया गया था। पहले के चरणों में एफएपी और एमयूएससी को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय इन उप-आबादी की उपस्थिति को स्वीकार किया जाना चाहिए और विचार किया जाना चाहिए।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल स्वस्थ या घायल वयस्क माउस मांसपेशियों से अलग एफएपी और एमयूएससी की शुद्ध आबादी के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है। उच्च शुद्धता और कोशिकाओं की व्यवहार्यता इस प्रोटोकॉल को आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाती है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

हम एमयूएससी अलगाव पर सलाह के लिए टॉम चेउंग (हांगकांग यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी) को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को एनआईएच अनुदान एआर 041126 और एआर 041164 के माध्यम से एनआईएएमएस-आईआरपी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile BD Biosciences  305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) The University of British Columbia 53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody BioLegend 102510
APC anti-mouse CD45 Antibody BioLegend 103112
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL BD Biosciences  309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody BioLegend 105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male) The Jackson Laboratory 000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse The Jackson Laboratory 007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356408
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile VWR 414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile Corning 352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile Corning 353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL VWR 352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning VWR 60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning VWR 21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) Promega G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder ThermoFisher Scientific 17101015
Gibco Dispase, powder ThermoFisher Scientific 17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher Scientific 12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States ThermoFisher Scientific 16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix ThermoFisher Scientific 11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin ThermoFisher Scientific 16050122
Gibco PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) ThermoFisher Scientific 10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A-21127
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools Inc 14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) ThermoFisher Scientific A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody R&D Systems AF1062
Normal Donkey Serum Fisher Scientific NC9624464
Normal Goat Serum ThermoFisher Scientific 31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody BioLegend 108120
Paraformaldehyde, 16% Fisher Scientific NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin BioLegend 405206
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools Inc 91500-09
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools Inc 91150-20
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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Riparini, G., Simone, J. M.,… More

Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63983, doi:10.3791/63983 (2022).

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