Summary
De precieze identificatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en spierstamcellen (MuSC's) is van cruciaal belang voor het bestuderen van hun biologische functie in fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol biedt richtlijnen voor de isolatie, zuivering en cultuur van FAPs en MuSC's van volwassen muisspieren.
Abstract
Fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) zijn een populatie van mesenchymale stromale cellen (MSC's) die in staat zijn om te differentiëren langs fibrogene, adipogene, osteogene of chondrogene afstamming. Samen met spierstamcellen (MuSC's) spelen FAPs een cruciale rol bij spierhomeostase, herstel en regeneratie, terwijl ze de extracellulaire matrix (ECM) actief onderhouden en remodelleren. Bij pathologische aandoeningen, zoals chronische schade en spierdystrofieën, ondergaan FAPs afwijkende activering en differentiëren ze in collageenproducerende fibroblasten en adipocyten, wat leidt tot fibrose en intramusculaire vetinfiltratie. Faps spelen dus een dubbele rol bij spierregeneratie, hetzij door musc-omzet te ondersteunen en weefselherstel te bevorderen, hetzij door bij te dragen aan fibrotische littekenvorming en ectopische vetinfiltraten, die de integriteit en functie van het skeletspierweefsel in gevaar brengen. Een goede zuivering van FAPs en MuSCs is een voorwaarde voor het begrijpen van de biologische rol van deze cellen in fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor de gelijktijdige isolatie van FAPs en MuSC's van ledemaatspieren van volwassen muizen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Het protocol beschrijft in detail de mechanische en enzymatische dissociatie van mononucleaire cellen van hele ledematen spieren en gewonde tibialis anterieure (TA) spieren. FAPs en MuSC's worden vervolgens geïsoleerd met behulp van een semi-geautomatiseerde celsorteerder om zuivere celpopulaties te verkrijgen. Daarnaast beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het kweken van rustige en geactiveerde FAPs en MuSC's, alleen of in cocultuuromstandigheden.
Introduction
De skeletspieren zijn het grootste weefsel in het lichaam, goed voor ~ 40% van het volwassen menselijk gewicht, en is verantwoordelijk voor het handhaven van de houding, het genereren van beweging, het reguleren van het basale energiemetabolisme en de lichaamstemperatuur1. Skeletspieren zijn een zeer dynamisch weefsel en bezitten een opmerkelijk vermogen om zich aan te passen aan een verscheidenheid aan stimuli, zoals mechanische stress, metabole veranderingen en dagelijkse omgevingsfactoren. Bovendien regenereert de skeletspieren als reactie op acuut letsel, wat leidt tot volledig herstel van de morfologie en functies2. Skeletspierplasticiteit is voornamelijk afhankelijk van een populatie van residente spierstamcellen (MuSC's), ook wel satellietcellen genoemd, die zich bevinden tussen het myofiberplasmamembraan en de basale lamina 2,3. Onder normale omstandigheden bevinden MuSC's zich in de spierniche in een rustige toestand, met slechts een paar divisies om de cellulaire omzet te compenseren en de stamcelpool aan te vullen4. Als reactie op letsel komen MuSC's de celcyclus binnen, prolifereren ze en dragen ze bij aan de vorming van nieuwe spiervezels of keren ze terug naar de niche in een zelfvernieuwingsproces 2,3. Naast MuSC's zijn homeostatisch onderhoud en regeneratie van de skeletspieren afhankelijk van de ondersteuning van een populatie van spierresidente cellen genaamd fibro-adipogene voorlopers (FAPs)5,6,7. FAPs zijn mesenchymale stromale cellen ingebed in het spierbindweefsel en in staat om onderscheid te maken langs fibrogene, adipogene, osteogene of chondrogene afstamming 5,8,9,10. FAPs bieden structurele ondersteuning voor MuSC's omdat ze een bron zijn van extracellulaire matrixeiwitten in de spierstamcelniche. FAPs bevorderen ook het langetermijnonderhoud van de skeletspieren door cytokines en groeifactoren af te scheiden die trofische ondersteuning bieden voor myogenese en spiergroei 6,11. Bij acuut spierletsel vermenigvuldigen FAPs zich snel om een voorbijgaande niche te produceren die de structurele integriteit van de regenererende spier ondersteunt en een gunstige omgeving biedt om de proliferatie en differentiatie van MuSC's op een paracriene manier te ondersteunen5. Naarmate de regeneratie vordert, worden FAPs door apoptose uit de regeneratieve spier verwijderd en keren hun aantallen geleidelijk terug naar basaal niveau12. In omstandigheden die chronische spierbeschadiging bevorderen, overschrijven FAPs echter pro-apoptotische signalering en hopen ze zich op in de spierniche, waar ze differentiëren in collageenproducerende fibroblasten en adipocyten, wat leidt tot ectopische vetinfiltraten en fibrotische littekenvorming12,13.
Vanwege hun multipotentie en hun regeneratieve vermogens zijn FAPs en MuSC's geïdentificeerd als potentiële doelwitten in de regeneratieve geneeskunde voor de behandeling van skeletspieraandoeningen. Daarom is het belangrijk om, om hun functie en therapeutisch potentieel te onderzoeken, efficiënte en reproduceerbare protocollen op te stellen voor de isolatie en cultuur van FAPs en MuSC's.
Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan verschillende celpopulaties identificeren op basis van morfologische kenmerken zoals grootte en granulariteit, en maakt celspecifieke isolatie mogelijk op basis van het gebruik van antilichamen gericht tegen celoppervlakmarkers. Bij volwassen muizen drukken MuSC's het vasculaire celadhesiemolecuul 1 (VCAM-1, ook bekend als CD106)14,15 en α7-Integrin15 tot expressie, terwijl FAPs de van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor tot expressie brengen α (PDGFRα) en het stamcelantigeen 1 (Sca1 of Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . In het hier beschreven protocol werden MuSC's geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, terwijl FAPs werden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Als alternatief werden PDGFRαEGFP-muizen gebruikt om FAPs te isoleren als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Bovendien vergeleken we de overlapping tussen het fluorescerende signaal van PDGFRα-GFP+ cellen met cellen geïdentificeerd door de oppervlaktemarker Sca1. Onze analyse toonde aan dat alle GFP-expresserende cellen ook positief waren voor Sca1, wat aangeeft dat beide benaderingen kunnen worden gebruikt voor de identificatie en isolatie van FAPs. Ten slotte bevestigde kleuring met specifieke markerantistoffen de zuiverheid van elke celpopulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle uitgevoerde dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen die zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee (ACUC) van het National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Onderzoekers die dit protocol uitvoeren, moeten zich houden aan hun lokale richtlijnen voor dierenethiek.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft in detail hoe FAPs en MuSCs kunnen worden geïsoleerd van achterste ledematen en gewonde tibialis anterieure (TA) spieren van volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen (3-6 maanden) en biedt richtlijnen voor het cocultureren van FAPs en MuSC's. Een overzicht van de experimentele procedure is weergegeven in figuur 1. Alle stappen van dit protocol moeten worden uitgevoerd in steriele omstandigheden en bij kamertemperatuur (RT), tenzij anders aangegeven.
1. Reagens instellen
- Wash Medium (WM): Bereid deze oplossing door 10% (vol/vol) paardenserum en 1x penicilline/streptomycine toe te voegen aan Ham's F-10 Nutrient Mix celmedia. WM kan van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard.
- Spierdissociatiebuffer (MDB): Bereid deze buffer voor door Collagenase II in WM op te lossen. Als u hele spieren van de achterpoten verzamelt, lost u 1000 U / ml Collagenase II op in 10 ml WM voor elke muis (te bereiden in een conische buis van 50 ml). Als u TA-spieren verzamelt, lost u 800 U / ml Collagenase II op in 7 ml WM voor elke muis (te bereiden in een conische buis van 15 ml). Voor TA-spieren zal dit helpen om celpellets beter te visualiseren en een hogere opbrengst van FAPs en MuSCs te verkrijgen. Bereid MDB vers voor voordat je de spieren verzamelt en houd het op ijs totdat het nodig is.
- Collagenase II-oplossingsvoorraad: Bereid deze oplossing door Collagenase II op te lossen in steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 1000 U/ml. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 0,45 μm en aliquot in voorraden van 1 ml. Bewaar de oplossing bij -20 °C.
- Dispase oplossingsvoorraad: bereid deze oplossing door Dispase op te lossen in steriele 1x PBS tot een eindconcentratie van 11 U/ml. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 0,45 μm en aliquot in voorraden van 1 ml. Bewaar de oplossing bij -20 °C.
- Bereid het kweekmedium van FAP voor door DMEM aan te vullen met 10% (vol / vol) foetaal runderserum, 1x penicilline / streptomycine en 2,5 ng / ml FGF. Bewaar het medium bij 4 °C.
- Bereid het kweekmedium van MuSC dat F10 aanvult met 10% (vol / vol) paardenserum, 1x penicilline / streptomycine en 2,5 ng / ml FGF. Bewaar het medium bij 4 °C.
- Bereid het cocultuurmedium door DMEM aan te vullen met 10% (vol/vol) foetaal runderserum, 10% (vol/vol) paardenserum, 1x penicilline/streptomycine en 2,5 ng/ml FGF. Bewaar het medium bij 4 °C.
2. Achterste ledematen spier oogsten
- Voeg 2-3 ml WM toe in een schaal van 6 cm (één schaal per muis) en leg het op ijs.
- Voer euthanasie uit door verstikking: plaats de muis in een CO2-kamer en introduceer 100% CO2. Gebruik cervicale dislocatie om de dood te bevestigen.
- Plaats de muis in rugligging op een dissectiepad en spuit deze in met 70% (vol/vol) ethanol om besmetting te voorkomen.
- Gebruik een tang om in het midden van de buikhuid van de muis te knijpen en knip een opening van ~ 1 cm horizontaal. Pak de wondranden en het bureau in de muis door de opening in tegengestelde richtingen te trekken om de spieren eronder bloot te leggen. Leg op dat moment één kant van de achterpoot van de muis bloot.
- Voordat u spieren verzamelt, verwijdert u intermusculair vet tussen de hamstrings en het proximale uiteinde van de quadriceps. Dit zal de isolatie van FAPs en MuSC's verbeteren.
- Zonder het weefsel te beschadigen, gebruik een scherpe tang om de fascia te breken en af te pellen om de onderliggende TA- en extensor digitorum longus (EDL) -spieren bloot te leggen. Laat de scherpe punt van de tang onder de TA/EDL-spieren lopen om de spieren los te maken van het scheenbeen.
- Knip de pezen af die de TA/EDL aan de enkel bevestigen en trim, terwijl u deze met een tang vasthoudt, de spieren met een schaar langs de lengtelijn van de TA/EDL. Snijd de pezen rond de knie om de hele TA/EDL-spieren los te maken. Plaats de spieren in een schaal van 6 cm die op ijs wordt gehouden.
- Ga verder met het isoleren van de gastrocnemius- en soleusspieren door alle pezen bij de enkel te snijden en de spieren los te maken van het scheenbeen en het kuitbeen. Snijd rond de knie en breng de spieren over naar de schaal van 6 cm.
- Verwijder de fascia rond de quadriceps en scheid deze van het dijbeen door de scherpe punt van de tang tussen de spier en het bot te laten lopen. Snijd de pezen rond de knie en, terwijl u de quadriceps met een tang aan het distale uiteinde vasthoudt, trimt u de rest van de spier door langs het dijbeen te snijden. Plaats de spieren in de schaal van 6 cm.
- Maak de hamstrings en resterende spieren rond het dijbeen los en breng die over naar de schaal van 6 cm. Verzamel de spieren van de achterpoten in een schaal van 6 cm die op ijs wordt gehouden.
OPMERKING: Vermijd het beschadigen van bloedvaten, indien mogelijk, om de vorming van bloedklonten te voorkomen die de downstream-isolatie kunnen verstoren. Als er een bloeding optreedt, dep het weggesneden vat dan onmiddellijk met een steriel gaasje om het bloed te absorberen. - Verzamel TA, EDL, gastrocnemius, soleus, quadricep en hamstringspieren van de contralaterale ledemaat.
OPMERKING: Wanneer u de hele spieren van de achterpoten isoleert, moet u geen twee of meer muizen poolen. Bij het isoleren van TA-spieren kunnen maximaal drie TA-spieren worden samengevoegd.
3. Mechanische en enzymatische spiervertering
- Aspirateer WM uit de schaal van 6 cm en voeg 1-2 ml MDB toe om de spieren vochtig te houden.
- Gehakt de spieren grondig totdat u een slurrypasta van goed gehakt weefsel krijgt. Gebruik hiervoor een tang om het ene uiteinde van een stuk spier vast te houden en gebruik vervolgens een scalpel om de spier te scheuren en te snijden totdat deze minder strak is.
- Gebruik een schaar om de spier gedurende 1-2 minuten in kleine stukjes te knippen. Herhaal deze stap voor elke groep spieren totdat u een goed gehakt spierslib hebt verkregen.
OPMERKING: Dit is een zeer kritieke stap om de opbrengst van FAPs en MuSC's te maximaliseren. Het wordt aanbevolen om 8-10 minuten (4-5 minuten als u alleen TA-spieren isoleert) in deze stap te besteden om een goede spierafgehakting te garanderen. - Breng de gehakte spieren van elke muis over naar de conische buis met MDB.
- Sluit de buizen af met laboratoriumfolie en incubeer in een waterbad van 37 °C met agitatie (75 rpm) gedurende 1 uur. Plaats de buizen horizontaal langs het schudpad en gebruik gewichten om de buizen ondergedompeld te houden in water.
- Ontdooi 1 ml Collagenase II-bouillon en 1 ml dispase-bouillon per muis. Draai voor gebruik de dispase kolf in een zwenkbakrotor op 10.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Gebruik alleen het supernatant.
- Als de spieren van de hele achterpoten zijn verzameld, ga dan als volgt te werk:
- Verwijder na 1 uur de buis uit de shaker en vul deze tot 50 ml met WM. Keer voorzichtig een paar keer om om het mengen te garanderen.
- Centrifugeer de cellen in een zwenkbakrotor bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng 42 ml supernatant over in twee nieuwe buizen (~ 21 ml in elke buis) en laat ~ 8 ml in de oorspronkelijke buis.
- Vul de nieuwe buizen met 21 ml van het supernatant tot 50 ml met WM. Centrifugeer de cellen opnieuw in een zwenkbakrotor bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Aspirateer al het supernatant en houd de pellets op ijs.
- Voeg 1 ml collagenase II-bouillon en 1 ml dispase-bouillon toe in de originele buis met ~ 8 ml MDB.
- Gebruik een serologische pipet van 5 ml om de pellet 10 keer te resuspeneren zonder verstopping. Werp de oplossing uit naar de wand van de buis en vermijd de vorming van bellen. Als er verstopping optreedt tijdens resuspensie, duw dan de punt van de pipet tegen de onderkant van de buis om de spierbrokken mechanisch te verstoren. Ga verder met stap 3.9.
- Als TA-spieren zijn verzameld, ga dan als volgt te werk:
- Verwijder na 1 uur de buis uit de shaker en vul ze tot 15 ml met WM. Keer voorzichtig een paar keer om om het mengen te garanderen.
- Centrifugeer de cellen in een zwenkbakrotor bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng 13 ml supernatant over in een nieuwe buis van 15 ml en laat ~ 2 ml in de oorspronkelijke buis.
- Vul de nieuwe buis met 13 ml van het supernatant tot 15 ml met WM. Centrifugeer de cellen opnieuw in een zwenkbakrotor bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Adem al het supernatant op en houd de pellet op ijs.
- Gebruik een pipetpunt van 1000 μL om de pellet in de oorspronkelijke buis op en neer te resuspenseren zonder verstopping.
- Voeg 1 ml Collagenase II-bouillon en 1 ml dispase-bouillon toe aan de oorspronkelijke buis met 2 ml MDB en vul tot 10 ml met WM. Ga verder met stap 3.9.
- Sluit de buizen af met laboratoriumfilm en incubeer in een waterbad van 37 °C met agitatie (75 tpm) gedurende 30 minuten. Plaats de buizen zoals in stap 3.5.
4. Generatie van mononucleaire cellen
OPMERKING: Als u werkt met TA-spieren die zijn verzameld in een conische buis van 15 ml, breng de suspensie dan over in een conische buis van 50 ml voordat u doorgaat met stap 4.1.
- Verwijder na 30 min de buis uit de shaker. Aspirateer en werp de spiersuspensie 10 keer met succes door een spuit van 10 ml met een naald van 20 G.
OPMERKING: Werp spierophanging uit naar de wand van de buis om bellen en schuimvorming te voorkomen. Kleine stukjes onverteerde pezen of kraakbeen kunnen de naald verstoppen tijdens de eerste aspiratierondes. Als er verstopping optreedt, gebruik dan een steriele tang om de verstopping van de punt van de naald te verwijderen. - Vul elke buis tot 50 ml met WM en keer voorzichtig een paar keer om om het mengen te garanderen.
- Centrifugeer de cellen in een zwenkbakrotor bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng supernatant over in een nieuwe buis (~ 42 ml) en laat ~ 8 ml in de oorspronkelijke buis.
- Vul de nieuwe buis met 42 ml van het supernatant tot 50 ml met WM. Centrifugeer de cellen opnieuw in een zwenkbakrotor bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Adem al het supernatant op en houd de pellet op ijs.
- Plaats een nylon celzeef van 40 μm in de originele conische buis van 50 ml met 8 ml WM en maak de celzeef voorbevochtigd met 1-2 ml WM.
- Terwijl u de nylon celzeef van 40 μm vasthoudt, gebruikt u een pipet van 10 ml om de pellet 5-10 keer voorzichtig te resuspeneren. Filter de pellets door de celzeef terug in dezelfde buis om celverlies te minimaliseren.
- Zorg er bij deze stap voor dat er extra buizen met celpellets op ijs zijn. Filter die pellets terug in de oorspronkelijke buis door 4-5 ml WM aan elke buis toe te voegen om de pellets te resuspenderen en breng de oplossing over naar de celzeef die in de oorspronkelijke buis is geplaatst. Laat filteren op zwaartekracht toe.
- Nadat u alle pellets in de oorspronkelijke conische buis van 50 ml hebt verzameld, spoelt u de celzeef af met nog eens 4-5 ml WM. Gebruik een pipet van 1000 μL om alle vloeistof van de onderkant van de celzeef te verzamelen.
- Vul elke buis met WM tot 50 ml en keer voorzichtig een paar keer om om het mengen te garanderen.
- Centrifugeer de cellen in een zwenkbakrotor bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig onmiddellijk al het supernatant na centrifugering aan zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de pellet in 600 μL WM en breng het over naar een microcentrifugebuis van 2 ml.
5. Antilichaamkleuring voor flowcytometrie
OPMERKING: Stel voor elk experiment de volgende controles in: i) niet-gekleurde controle, ii) levensvatbaarheidscontrole om te selecteren voor de levende celpopulatie, iii) enkele gekleurde compensatiecontroles om te corrigeren voor fluorochroomemissie spillover, en iv) fluorescentie minus één (FMO) controles om gatinggrenzen in te stellen door rekening te houden met spillover-verspreiding. Raadpleeg tabel 1 voor een volledige lijst van kleuringscontroles.
- Om onbevlekte controle te bereiden, brengt u 10 μL van de celsuspensie over in een 2 ml microcentrifugebuis met 190 μL WM. Resuspendeer de celsuspensie en filter door een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem met een 35 μm celzeefdop. Laat de ophanging filteren op zwaartekracht.
- Gebruik een pipet van 200 μL om alle vloeistof van de onderkant van de celzeef te verzamelen. Sluit af met een dop en laat het op ijs, beschermd tegen licht.
- Bereid levensvatbaarheid, FMO en enkelgekleurde controles voor: label 10 microcentrifugebuizen van 2 ml en voeg 190 μL WM toe aan elke buis en 10 μL celsuspensie. Raadpleeg tabel 1 voor een volledige lijst van besturingselementen. Voeg antilichamen toe aan de juiste buis, afhankelijk van de experimentele controle. Raadpleeg tabel 1 voor informatie over de combinatie en concentratie van antilichamen.
- Breng de rest van de celsuspensie (500 μL) over in een microcentrifugebuis van 2 ml (experimentele buis) en voeg de volgende antilichamen toe: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotine en α7-Integrin-PE. Raadpleeg tabel 1 voor informatie over de combinatie en concentratie van antilichamen.
- Meng elke buis voorzichtig goed om een gelijkmatige verdeling te garanderen en incubeer de cellen in een roterende shaker bij 4 °C gedurende 45 minuten beschermd tegen licht.
- Vul na 45 minuten alle microcentrifugebuizen tot 2 ml met WM. Keer de buizen voorzichtig een paar keer om om volledige menging te garanderen. Centrifugeer de buizen in een gekoelde centrifuge met een rotor met vaste hoek bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Adem het supernatant op zonder de pellet te storen.
- Resuspendeer de cellen in alle microcentrifugebuizen in 300 μL WM.
- Voeg streptavidin antilichaam toe in geschikte buizen. Raadpleeg tabel 1 voor informatie over de combinatie en concentratie van antilichamen. Meng elke buis voorzichtig goed om een gelijkmatige verdeling te garanderen en incubeer de cellen in een roterende shaker bij 4 °C gedurende 20 minuten beschermd tegen licht. Laat de resterende buizen op ijs, beschermd tegen het licht.
- Vul na 20 minuten microcentrifugebuizen met streptavidin-antilichaam tot 2 ml met WM. Keer de buizen voorzichtig een paar keer om om volledige menging te garanderen. Centrifugeer de buizen in een gekoelde centrifuge met een rotor met vaste hoek bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Adem het supernatant volledig op en resuspensiecellen in 300 μL WM.
- Maak de 35 μm celzeefdop van 10 5 ml polystyreenbuizen met ronde bodem met 200 μL WM voorbevochtig. Filter cellen uit controlebuizen door de juiste 5 ml polystyreenbuizen met ronde bodem. Gebruik een pipet van 200 μL om alle vloeistof van de onderkant van de celzeef te verzamelen. Sluit af met doppen, laat de buizen op ijs liggen en bescherm ze tegen licht.
- Resuspendeer de cellen in de experimentele buis met nog eens 200 μL WM voor een totaal van 500 μL WM. Maak een celzeefdop van een 5 ml polystyreen ronde bodembuis met 200 μL WM vooraf nat. Breng de celsuspensie van de experimentele buis over in de 5 ml polystyreen buis met ronde bodem en laat deze filteren op basis van de zwaartekracht.
- Spoel de microcentrifugebuis van 2 ml met de experimentele monstersuspensie met 300 μL WM en laat deze door dezelfde zeefdop lopen. Gebruik een pipet van 200 μL om alle vloeistof van de onderkant van de celzeef te verzamelen. Sluit af met een dop, laat buizen op ijs achter en bescherm ze tegen licht.
OPMERKING: Als verstopping van de 35 μm cel-zeefdop optreedt, tikt u voorzichtig op de buis op de bank om de doorstroom te vergemakkelijken. - Bereid de verzamelbuizen voor en label ze voor FAPs en MuSC's. Als cellen worden geïsoleerd van hele spieren van de achterpoten, sorteert u de cellen in 5 ml polypropyleen buizen met ronde bodem met maximaal 1 ml FAPs of MuSCs-kweekmedium aangevuld met 2x serum. Als cellen van TA-spieren worden geïsoleerd, sorteert u FAPs en MuSCs in 2 ml microcentrifugebuizen met maximaal 400 μL kweekmedium aangevuld met 2x serum.
6. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een compacte benchtop onderzoeksstroomcytometer uitgerust met een mondstuk van 100 μm en met een configuratie met drie lasers (488 nm, 640 nm, 405 nm) met de mogelijkheid om tot negen verschillende fluorochelen te analyseren (11 parameters inclusief de voorwaartse en zijwaartse spreiding). De fluorochromen die in dit protocol worden gebruikt en de bijbehorende detectorbandpassfilters zijn als volgt: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Pacific Blauw 448/45; 7-Aminoactinomycine D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Cellen worden gesorteerd op 4 °C en blijven op ijs na de sortering. Voordat u dit instrument gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de gebruiker goed is opgeleid door een specialist in technische toepassingen.
- Stel de celsorteerder in en controleer de prestaties volgens de specificaties van de fabrikant.
- Stel een hiërarchische gatingstrategie op om FAP's en MuSC's te identificeren (figuur 2).
- Isoleer FAP's op basis van het volgende schema: i) voorwaarts celverstrooiingsgebied versus zijcelverstrooiingsgebied (FSC-A vs. SSC-A) om cellen te scheiden versus puin, ii) zijcelverstrooiingshoogte versus zijcelverstrooiingsbreedte (SSC-H versus SSC-W) om singlets te onderscheiden van doubletten in het SSC-bereik, iii) voorwaartse celverstrooiingshoogte versus voorwaartse celverstrooiingsbreedte (FSC-H versus FSC-W) om singlets te onderscheiden van doubletten in het FSC-bereik, en iv) 7-AAD-gebied versus SSC-A om levende versus dode cellen te onderscheiden.
- Als u FAPs isoleert via de op antilichamen gebaseerde methode, gebruikt u het volgende schema: v) APC-CD45/CD31-gebied versus Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1)-gebied om CD31+ en CD45+ cellen uit te sluiten van verdere analyse, en vi) PE-Cy7-VCAM-1-gebied versus PE-α7-Integrin-gebied van de CD31-/CD45-/Sca1+ populatie om FAPs te onderscheiden. FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-events.
- Als u FAP's isoleert via de endogene GFP-reportermethode, gebruikt u het volgende schema: v) APC-CD45/CD31-gebied versus GFP-PDGFRα-gebied om CD31+ en CD45+ cellen uit te sluiten van verdere analyse en GFP+ cellen te isoleren. FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events.
- Isoleer MuSC's op basis van het volgende schema: i) voorwaarts celverstrooiingsgebied versus zijcelverstrooiingsgebied (FSC-A vs. SSC-A) om cellen te scheiden versus puin, ii) zijcelverstrooiingshoogte versus zijcelverstrooiingsbreedte (SSC-H vs. SSC-W) om singlets te onderscheiden van doubletten in het SSC-bereik, iii) voorwaartse celverstrooiingshoogte versus voorwaartse celverstrooiingsbreedte (FSC-H versus FSC-W) om singlets te onderscheiden van doubletten in het FSC-bereik, iv) 7-AAD-gebied vs SSC-A om levende versus dode cellen te onderscheiden, v) APC-CD45/CD31-gebied vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) gebied om CD31+ en CD45+ cellen uit te sluiten van verdere analyse, en vi) PE-Cy7-VCAM-1 gebied vs PE-α7-Integrin gebied van de CD31-/CD45-/Sca1- populatie om MuSC's te onderscheiden. MuSC's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ gebeurtenissen.
- Isoleer FAP's op basis van het volgende schema: i) voorwaarts celverstrooiingsgebied versus zijcelverstrooiingsgebied (FSC-A vs. SSC-A) om cellen te scheiden versus puin, ii) zijcelverstrooiingshoogte versus zijcelverstrooiingsbreedte (SSC-H versus SSC-W) om singlets te onderscheiden van doubletten in het SSC-bereik, iii) voorwaartse celverstrooiingshoogte versus voorwaartse celverstrooiingsbreedte (FSC-H versus FSC-W) om singlets te onderscheiden van doubletten in het FSC-bereik, en iv) 7-AAD-gebied versus SSC-A om levende versus dode cellen te onderscheiden.
- Voer de niet-gekleurde controle en levensvatbaarheidscontrole uit om ervoor te zorgen dat de celpopulatie correct is gepositioneerd in het SSC-A versus FSC-A-plot en om op de juiste manier te gateen op levende afzonderlijke cellen.
- Verkrijg alle afzonderlijke gekleurde besturingselementen en genereer de spillover-compensatiematrix.
- Voer alle FMO-controles uit en bepaal het afkappunt tussen achtergrondfluorescentieverspreiding en de positief gekleurde populatie.
- Ongeveer 5-10 minuten voor de verwerving van het experimentele monster, voeg 7-AAD levensvatbaarheidskleurstof toe en meng voorzichtig.
- Zodra alle controles zijn verwerkt, stelt u de sorteerpoorten in overeenstemming met de FMO-besturingselementen; verwerven en sorteren van de experimentele monsters.
- Nadat alle monsters zijn verwerkt, reinigt u de cytometer volgens de specificaties van de fabrikant. Exporteer alle .fcs-gegevens voor analyse.
7. Cultuur van FAPs en MuSC's
OPMERKING: Gesorteerde cellen moeten onmiddellijk na het sorteren worden gekweekt, in een geschikt medium op collageen I gecoate platen.
- Centrifugeer de opvangbuizen in een rotor met vaste hoek bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Aspirateer het supernatant zonder de celpellet te verstoren.
- Voor de kweek van MuSC, resuspensie de cellen in een geschikt volume MuSC-kweekmedium en incubeer ze in standaardomstandigheden bij 37 °C en 5% CO2.
- Plaat vers geïsoleerde MuSC's met een dichtheid van 20.000 cellen /cm2 en geactiveerde MuSC's met een dichtheid van 15.000 cellen / cm2.
- Na plating lijken cellen klein, bolvormig en doorschijnend. Binnen 36 uur hechten MuSC's zich aan het oppervlak van de plaat en vergroten ze langzaam hun grootte gedurende de eerste 48 uur.
- Vervang het medium om de 2 dagen.
OPMERKING: MuSC's zijn erg gevoelig voor celdichtheid. Om MuSC's in hun woekerende toestand te houden, laat je ze groeien totdat ze 60% -70% samenvloeien. Doorgeef de cellen in nieuw collageen Ik heb gerechten of borden gecoat en voeg elke 2 dagen een nieuw vers medium toe. Als MuSC's langer dan 3-4 dagen in dezelfde schaal of plaat worden bewaard, krijgen ze een langwerpige vorm en worden ze uitgelijnd met naburige cellen totdat ze samensmelten.
- Voor fap-kweek, resuspensie de cellen in een geschikt volume muSC-kweekmedium en incubeer ze in standaardomstandigheden bij 37 °C en 5% CO2.
- Plaat de FAPs geïsoleerd uit onverstoorbare spieren met een dichtheid van 15.000 cellen / cm2 en FAPs geïsoleerd uit gewonde spieren op 9.000 cellen / cm2.
OPMERKING: Na het plateren hechten FAP's zich binnen 48 uur volledig aan het oppervlak van de plaat, terwijl geactiveerde FAPs binnen enkele uren aan de plaat worden bevestigd. Zodra ze zijn bevestigd, krijgen FAPs hun karakteristieke vorm, met een kleincellig lichaam en langwerpige celprocessen, en ze vermenigvuldigen zich snel. - Vervang het medium om de 2 dagen.
OPMERKING: FAPs zijn erg gevoelig voor celdichtheid. Het zaaien van FAPs bij lage dichtheden kan leiden tot slechte celgroei en celdood. Integendeel, het plating van FAPs met een hoge zaaidichtheid zal de overleving van cellen stimuleren en hun expansie verbeteren. FAPs die voortkomen uit beschadigde spieren vereisen meestal een lagere celdichtheid dan onbeschadigde spieren, omdat ze al zijn geactiveerd. Het wordt aanbevolen om de FAP-beplatingsdichtheid aan te passen op basis van iemands experimentele omstandigheden en op basis van de bron van de monsters.
- Plaat de FAPs geïsoleerd uit onverstoorbare spieren met een dichtheid van 15.000 cellen / cm2 en FAPs geïsoleerd uit gewonde spieren op 9.000 cellen / cm2.
- Voor cocultuur resuspenseer je FAP's en MuSC's in het cocultuurmedium in een verhouding van 1:1 en incubeer je die in standaardomstandigheden bij 37 °C en 5% CO2. Laat de cellen 48 uur hechten en vervang het medium om de 2 dagen.
8. Immunofluorescentieanalyse van gekweekte FAPs en MuSC's
- Aspirateer het celmedium en voer twee of drie wasbeurten uit met 1x PBS.
- Fixeer de cellen met 2% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS gedurende 15 minuten op RT.
- Aspirateer 2% PFA en was de cellen snel twee of drie keer met 1x PBS.
- Voer celpermeabilisatie en -blokkering uit:
- Voor immunostaining van vers geïsoleerde FAPs, voer celpermeabilisatie en -blokkering uit door cellen te incuberen met 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% runderserumalbumine (BSA) + 5% Normal Donkey Serum (NDS) gedurende 30 minuten bij RT.
- Voor immunostaining van vers geïsoleerde MuSC's, voer celpermeabilisatie en -blokkering uit door cellen te incuberen met PBST + 1% BSA + 5% Normal Goat Serum (NGS) gedurende 30 minuten bij RT.
- Breng primaire antilichamen aan:
- Voor immunostaining van vers geïsoleerde FAPs, breng geiten anti PDGFRα primair antilichaam (1:300) verdund in PBST + 1% BSA + 5% NDS 's nachts bij 4 °C.
- Voor immunostaining van vers geïsoleerde MuSC's, breng muis anti Pax7 primair antilichaam (1:10) verdund in PBST + 1% BSA + 5% NGS gedurende 45 minuten bij RT.
- Was de cellen twee of drie keer met 1x PBS om de primaire antilichaamoplossing te verwijderen.
- Breng secundaire antilichamen aan:
- Voor immunostaining van vers geïsoleerde FAPs, breng ezel anti-geit IgG (H + L) Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:500) verdund in PBST + 1% BSA gedurende 1 uur bij RT.
- Voor immunostaining van vers geïsoleerde MuSC's, breng geiten anti-muis IgG1 Alexa Fluor 555 secundair antilichaam (1:500) verdund in PBST + 1% BSA gedurende 45 minuten bij RT.
- Was de cellen twee of drie keer met 1x PBS om de primaire antilichaamoplossing te verwijderen.
- Voer nucleaire tegenkleuring uit door cellen te incuberen met DAPI in PBST (1:1000) gedurende 5 minuten bij RT.
- Was de cellen drie keer met 1x PBS om de DAPI-oplossing te verwijderen.
LET OP: DAPI is giftig en gevaarlijk; ga er voorzichtig mee om en gooi het weg in de fles met gevaarlijk afval. - Bewaar de cellen bij 4 °C beschermd tegen het licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakt de isolatie mogelijk van ongeveer een miljoen FAPs en tot 350.000 MuSC's van niet-gewonde achterpoten van volwassen muizen van het wilde type (3-6 maanden), wat overeenkomt met een opbrengst van 8% voor FAPs en 3% voor MuSC's van totale gebeurtenissen. Bij het sorteren van cellen van beschadigde TA 7 dagen na het letsel, worden twee tot drie TA-spieren samengevoegd om tot 300.000 FAPs en 120.000 MuSC's te verkrijgen, wat overeenkomt met een rendement van respectievelijk 11% en 4%. De zuiverheidswaarden na het sorteren liggen meestal boven de 95% voor FAPs en MuSC's.
De gatingstrategie die is aangenomen om FAP's en MuSC's te isoleren, wordt geïllustreerd in figuur 2. Ten eerste worden celpopulaties van belang geïdentificeerd door het creëren van een forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) dichtheidsdiagram, dat een zekere mate van cellulaire identificatie mogelijk maakt op basis van celmorfologische eigenschappen. Deze gating-strategie wordt ook gebruikt om klein cellulair puin uit te sluiten, dat zich meestal in de linkerbenedenhoek van het FSC versus SSC-perceel bevindt. Cellen worden verder afgeschermd om doubletten uit te sluiten op basis van FSC- en SSC-hoogte- en breedtesignalen, en de resulterende singletcellen worden vervolgens gekleurd met 7-AAD om hun levensvatbaarheid te evalueren. Levende cellen worden verder beoordeeld op Sca1- en CD31/CD45-expressie om Lineage-positieve cellen uit te sluiten van verdere analyse. Afstammingsnegatieve Sca1-negatieve singlets worden vervolgens gekleurd voor VCAM-1 en α7-Integrin om FAPs en MuSCs te onderscheiden. FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-cellen en MuSC's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ cellen. Als alternatief zijn levende cellen ook afgeschermd voor CD31/CD45 en GFP-PDGFRα om FAP's te onderscheiden. FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-cellen.
Dit protocol presenteert twee gatingstrategieën om de FAP-populatie te isoleren: ofwel door een endogene PDGFRα-EGFP-reporter te gebruiken of door celkleuring uit te voeren met een Sca1-antilichaam. De PDGFRα-EGFP knock-in reporter muizen (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 brengen het H2B-eGFP fusiegen tot expressie van de endogene PDGFRα locus, waardoor efficiënte en specifieke labeling van de PDGFRα-afstamming mogelijk is (figuur 3A). Deze muislijn werd eerder gebruikt om Pdgfrα+ FAPs te isoleren en is inderdaad zeer nuttig voor de isolatie van FAPs, omdat de GFP-reporter een zeer zichtbaar en specifiek signaal biedt19. Als alternatief beschrijft dit protocol een op Sca1 gebaseerde isolatiemethode voor de identificatie van FAPs. Sca1 (Ly-6A/E) wordt vaak gebruikt om FAPs in spiervoorbereiding te identificeren en te isoleren 13,16,17. Sca1 is een 18-kDa glycosylphosphatidylinositol (GPI)-gebonden eiwitlid van de Ly-6 familie20. Naast het feit dat het tot expressie komt op het celoppervlak van mesenchymale voorloperspiercellen, wordt Sca1-expressie echter ook waargenomen in hematopoëtische stamcellen (HSC's) en volwassen leukocyten en T-cellen. In dit protocol hebben we de geschiktheid van Sca1 als FAPs-marker bevestigd door op FACS gebaseerde lineage tracing-studies uit te voeren. In het bijzonder werden PDGFRα-EGFP-muizen gebruikt om Sca1 + / GFP-expresserende FAPs te isoleren onder populaties van mononucleaire cellen. We ontdekten dat alle GFP-expresserende cellen ook positief waren voor Sca1 en negatief voor CD31, CD45, VCAM-1 en α7-Integrin (figuur 4). Deze analyse bevestigde het gebruik van Sca1-antilichamen als marker voor FAPs in zowel rustige als geactiveerde FAPs en biedt middelen voor het onduidelijke gebruik van beide strategieën om FAPs te isoleren.
In dit protocol werden FAPs en MuSCs ook geïsoleerd van volwassen muizen die gewond raakten met intramusculaire injecties van Notexin, 7 dagen na het letsel (figuur 5). Na letsel activeren en vermenigvuldigen MuSC's en FAPs zich in vivo en bereiken ze de piek van proliferatie tussen dag 3 en 4 2,3. Deze veranderingen in proliferatie worden weerspiegeld door een toename van het percentage Sca1/PDFGRα en VCAM-1/α7-Integrin positieve cellen. Figuur 6 geeft de kwantificering weer van FAP's en MuSC's in niet-gewonde en 7 dagen na het letsel TA's; hoewel de piek in proliferatie wordt waargenomen tussen dag 2 en 3 na letsel, is een lage snelheid van prolifererende cellen nog steeds merkbaar 7 dagen na het letsel. Naarmate MuSC's worden geactiveerd, is er een duidelijke toename van hun cellulaire grootte21,22. Daarom is het bij het isoleren van deze cellen door FACS van cruciaal belang om FSC-A- en SSC-A-parameters aan te passen en de poort uit te breiden om die cellen in het midden op te nemen (figuur 5A).
De zuiverheid van de geïsoleerde celpopulaties werd bevestigd door immunostaining van gecocultureerde GFP+ FAPs en MuSC's met Pax7-antilichamen. Vers geïsoleerde GFP+ FAPs en MuSCs werden gedurende 48 uur gecocultureerd in een verhouding van 1:1 (figuur 3B). GFP+ FAPs drukten geen Pax7-marker uit, terwijl MuSC's reageerden met dit antilichaam. Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- en Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ gatingstrategie is dus effectief in het isoleren van zuivere populaties van respectievelijk FAPs en MuSC's.
Figuur 1: Grafisch overzicht van FAP- en MuSC-isolatie. Grafisch overzicht met FAP- en MuSC-isolatie van de spieren van de achterpoten. Het protocol is ook van toepassing op cellen geïsoleerd uit TA-spieren. Eerst worden spieren verzameld en mechanisch gehakt voordat ze een enzymatische spijsvertering ondergaan. Het spiermengsel wordt vervolgens verwerkt door een naald van 20 G en gefilterd om een suspensie van mononucleaire cellen te verkrijgen. Cellen worden vervolgens geïncubeerd met een cocktail van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen en lopen uiteindelijk door een celsorteerder om een pure populatie van FAPs en MuSCs te isoleren. Zuivere celpopulaties worden vervolgens verwerkt voor downstream-toepassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatief FACS-profiel van rustige FAPs en MuSC's. (A-H) Gating-strategie voor de isolatie van FAPs en MuSCs. (A) Ten eerste worden monsters omheind om cellulair puin en (B, C) doubletten op basis van SSC- en FSC-eigenschappen uit te sluiten. (D) De resulterende enkele cellen worden vervolgens gekleurd met 7-AAD om hun levensvatbaarheid te evalueren. (E) 7-AAD-negatieve enkele cellen worden vervolgens beoordeeld op APC-CD31/CD45 en Pacific Blue-Sca1 om Lineage-positieve cellen uit te sluiten van verdere analyse. (F,G) Afstammingsnegatieve singlets worden vervolgens gekleurd voor PE-Cy7-VCAM-1 en PE-α7-Integrin. (F) FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-cellen en (G) MuSC's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ cellen. (H) FAPs-isolatie in PDGFRα-EGFP-muizen met behulp van een GFP-reporter. (I-M) FACS-profiel voor Fluorescence Minus One (FMO) controles om de juiste compensatie en gating aan te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Validatie van FAP- en MuSC-celkweek. (A) Vers geïsoleerde FAPs die GFP tot expressie brengen, werden geplateerd en geco-gekleurd met een PDGFRα-antilichaam. Kernen waren gekleurd met DAPI. Samengevoegde afbeeldingen van GFP (groen), PDGFRα (rood) en DAPI (blauw) kleuring worden weergegeven. Schaalbalken, 25 μm. (B) Vers geïsoleerde FAPs (groen) en MuSC's werden gedurende 48 uur gecocultureerd en gekleurd met Pax7 (rood). Kernen waren gekleurd met DAPI. GFP-expressing FAPs drukken Pax7 niet uit, terwijl MuSC's uitsluitend Pax7 uitdrukken en niet positief zijn voor GFP, wat de zuiverheid van beide gesorteerde populaties bevestigt. Schaalbalken, 75 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: PDGFRα-EGFP-muizen en Sca1-expressie labelen specifiek FAPs bij volwassen muizen. FAP's worden geïsoleerd als GFP+/Sca1+-cellen. 7-AAD-negatieve enkelvoudige cellen worden beoordeeld op APC-CD31/CD45 en GFP-PDGFRα om Lineage-positieve cellen uit te sluiten en FAPs te onderscheiden. Afstammingsnegatieve/Sca1-positieve cellen worden gekleurd voor PE-Cy7-VCAM-1 en PE-α7-Integrin om MuSC's uit te sluiten. FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatief FACS-profiel van geactiveerde FAPs en MuSC's. (A-H) Gating-strategie voor de isolatie van geactiveerde FAPs en MuSCs. (A) Monsters worden omheind om cellulair puin uit te sluiten door FSC-A versus SSC-A dichtheidsdiagram te creëren. Let op de vergrote poort om de bevolking van belang tegemoet te komen. (B,C) Monsters worden verder afgeschermd om doubletten te elimineren op basis van SSC- en FSC-eigenschappen. (D) De resulterende enkele cellen worden vervolgens gekleurd met 7-AAD om hun levensvatbaarheid te evalueren. (E) 7-AAD-negatieve enkele cellen worden vervolgens beoordeeld op APC-CD31/CD45 en Pacific Blue-Sca1 om Lineage-positieve cellen uit te sluiten van verdere analyse. (F,G) Afstammingsnegatieve singlets worden vervolgens gekleurd voor PE-Cy7-VCAM-1 en PE-α7-integrine. (F) FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrine-cellen en (G) MuSC's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrine+ cellen. (H) FAPs-isolatie in PDGFRα-EGFP-muizen met behulp van een GFP-reporter. (I-M) FACS-profiel voor Fluorescence Minus One (FMO) controles om de juiste compensatie en gating aan te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Kwantificering van FAPs en MuSC's in onverstoorbare en gewonde TA's. Kwantificering van FAPs en MuSCs in niet-gewonde en 7 dagen na het letsel TA-spieren. Het tellen van cellen werd uitgevoerd door het aantal gesorteerde cellen per mg verzamelde spieren te delen. ** P < 0,01 tussen ongedeerden vs gewonden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 7-AAD (μg/ml) |
cd31/cd45-apc (μg/ml) |
Sca1-Pacific Blauw (μg/ml) |
α 7-Integrin-PE (μg/ml) |
VCAM-1-Biotine (μg/ml) |
PE-Cy7 Streptavidin (μg/ml) |
||
| Onbevlekt besturingselement | |||||||
| Enkele bevlekte bedieningselementen | |||||||
| 7-AAD (levensvatbaarheidscontrole) | 1 | ||||||
| cd31/cd45 | 2 | ||||||
| SCA1 | 5 | ||||||
| α7-Integrin | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMO-besturingselementen | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Experimenteel monster | |||||||
| Volledige vlek | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tabel 1: Antilichaamkleuringsmatrix. Lijst van antilichaamconcentraties die worden gebruikt voor het kleuren van de experimentele en controlemonsters. Bij het isoleren van FAPs door GFP kan Sca1-kleuring worden weggelaten. Voer in plaats daarvan GFP single stained control en GFP FMO uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het opstellen van efficiënte en reproduceerbare protocollen voor de identificatie en isolatie van zuiver volwassen stamcelpopulaties is de eerste en meest kritieke stap naar het begrijpen van hun functie. Geïsoleerde FAPs en MuSCs kunnen worden gebruikt om multiomics-analyse uit te voeren in transplantatie-experimenten als een potentiële behandeling voor spierziekten of kunnen genetisch worden gemodificeerd voor ziektemodellering in stamceltherapie.
Het hier beschreven protocol biedt gestandaardiseerde richtlijnen voor de identificatie, isolatie en cultuur van FAPs en MuSCs verkregen uit achterste ledematen spieren van volwassen muizen. Zuivere populaties van FAPs en MuSC's werden geïsoleerd met behulp van een op FACS gebaseerde techniek en hun zuiverheid werd vervolgens beoordeeld door immunostaining cellen met specifieke celoppervlakmarkers en genetische middelen.
Het protocol bestaat uit drie hoofdsecties die een grote invloed hebben op de opbrengst van FAPs en MuSC's: de mechanische en enzymatische spiervertering, de generatie van een mononucleated celsuspensie door de 20 G-naald en de uiteindelijke isolatie van afzonderlijke cellen via FACS.
Het uitvoeren van een goede spierafgehaktheid is van cruciaal belang om enkele cellen vrij te maken. De nadruk moet op deze stap worden gelegd, omdat het bereiken van de optimale grootte van de spierstukken na het hakken de enzymen die worden gebruikt voor de spijsvertering het beste laat werken en voorkomt dat de naald die in stap 4.1 is gebruikt, verstopt raakt. Aan de andere kant kan het te veel hakken van de spier resulteren in een slechte celopbrengst en verminderde levensvatbaarheid van de cel, omdat MuSC's snel vrijkomen tijdens de eerste spijsvertering en kunnen worden geaspireerd in stap 3.7.2 of 3.8.214. Bovendien heeft de efficiëntie van de enzymen die worden gebruikt voor de vertering van het spierpreparaat ook invloed op de kwaliteit van de enzymatische dissociatie, omdat er variabiliteit kan zijn tussen verschillende enzympartijen of een afname van de activiteit van enzymen met tijd23. Daarom wordt geadviseerd om elke batch enzymen te testen om de timing en concentratie van de spijsvertering te optimaliseren. Bovendien kan de concentratie en hoeveelheid tijd die nodig is voor het verteren van de spier ook worden beïnvloed door pathologische aandoeningen die de spierstijfheid beïnvloeden. Deze specifieke omstandigheden vereisen individuele optimalisatie.
De laatste generatie mononucleaire cellen gebeurt door de suspensie door een spuit van 10 ml met een naald van 20 G te laten lopen. Specifieke zorg moet worden genomen bij het uitvoeren van deze stap om het aantal gevormde bellen te minimaliseren, omdat hun barsten extra celschade veroorzaakt24.
De celsuspensie wordt vervolgens gekleurd met een antilichaamcocktail en verkregen met een celsorteerder. Het instellen van de juiste poorten is een andere cruciale stap. Bij het uitvoeren van deze experimenten wordt het ten zeerste aanbevolen om de vermelde enkelvlekcontroles en FMO-controles uit te voeren om de emissieoverloop goed te compenseren en rekening te houden met het achtergrondsignaal als gevolg van spillover-verspreiding. Dit is vooral belangrijk bij het omgaan met heldere fluorescerende eiwitten zoals GFP en indirecte vlekken zoals het VCAM-1-biotine / Stretpavidin-PE-Cy7-complex.
Bovendien is het, voordat dit experiment voor de eerste keer wordt uitgevoerd, een goede gewoonte om een titratie uit te voeren van de antilichamen die worden gebruikt om populaties van belang te detecteren. Het bepalen van de optimale concentratie van de antilichamen is een cruciale stap om het helderste signaal van de positieve populatie te garanderen en de toename van achtergrondkleuring te voorkomen.
Zodra de sortering is voltooid, is het belangrijk om een post-sort analyse uit te voeren op de gesorteerde cellen om hun zuiverheid en levensvatbaarheid te bepalen. De opbrengst en levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen worden sterk beïnvloed door de hoeveelheid tijd die nodig is om het monster te verwerken en moet in aanmerking worden genomen bij het plannen om meerdere muizen te verwerken. Bovendien kan het houden van de gesorteerde cellen op ijs in 2x serumverrijkende media het celherstel helpen en hun levensvatbaarheid verbeteren.
In dit protocol werden FAPs en MuSC's geïsoleerd uit de tibialis anterieure spieren van ongewonde muizen en 7 dagen na Notexin-injectie. Na een acuut letsel zijn verschillende FAP- en MuSC-subpopulaties gemeld die tijdelijk tot expressie komen in het regenererende spierweefsel. Malecova en collega's hebben de aanwezigheid gemeld van een subpopulatie van VCAM-1 die FAPs tot expressie brengt die afwezig is in onbeschadigde spieren, piekte tussen dag 2 en 3 na het letsel bij acute ontsteking en aanhield bij muizendystrofische muizen13. Evenzo hebben Kafadar en collega's een voorbijgaande toename van de expressie van Sca1 gemeld op een kleine subset van myogene voorlopers 2 dagen na het letsel25. Sca1+ myogene cellen waren echter sterk afgenomen 3 dagen na verwonding25. De aanwezigheid van deze subpopulaties moet worden erkend en overwogen bij het gebruik van dit protocol om FAPs en MuSC's in eerdere stadia te isoleren.
Samenvattend beschrijft dit protocol een methode voor de isolatie en cultuur van een zuivere populatie van FAPs en MuSC's geïsoleerd van gezonde of gewonde volwassen muisspieren. De hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van de cellen maken dit protocol geschikt voor verdere downstream toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We willen Tom Cheung (The Hong Kong University of Science &Technology) bedanken voor advies over MuSC-isolatie. Dit werk werd gefinancierd door het NIAMS-IRP via NIH-subsidies AR041126 en AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
