Summary
Visuel, enkeltmolekyle biokemi studeret gennem mikrofluidiske kamre lettes i høj grad ved hjælp af glastønde, gastætte sprøjter, stabile forbindelser af slanger til flowceller og eliminering af bobler ved at placere skifteventiler mellem sprøjterne og slangerne. Protokollen beskriver dobbelte optiske fælder, der muliggør visualisering af DNA-transaktioner og intermolekylære interaktioner.
Abstract
Visuel biokemi er en kraftfuld teknik til at observere de stokastiske egenskaber af enkeltenzymer eller enzymkomplekser, der er skjult i gennemsnittet, der finder sted i bulkfasestudier. For at opnå visualisering fokuseres dobbelt optisk pincet, hvor den ene fælde er fastgjort, og den anden er mobil, i en kanal i et multi-stream mikrofluidisk kammer placeret på scenen af et omvendt fluorescensmikroskop. Den optiske pincet fanger enkelte molekyler af fluorescerende mærket DNA og væskestrøm gennem kammeret og forbi de fangede perler, strækker DNA'et til B-form (under minimal kraft, dvs. 0 pN) med nukleinsyren observeret som en hvid streng mod en sort baggrund. DNA-molekyler flyttes fra en strøm til den næste ved at oversætte scenen vinkelret på strømmen for at muliggøre initiering af reaktioner på en kontrolleret måde. For at opnå succes parres mikrofluidiske enheder med optisk klare kanaler med glassprøjter, der holdes på plads i en sprøjtepumpe. Optimale resultater bruger stik, der er permanent bundet til flowcellen, slanger, der er mekanisk stive og kemisk resistente, og som er forbundet med koblingsventiler, der eliminerer bobler, der forhindrer laminær strømning.
Introduction
Evnen til at visualisere protein-DNA-interaktioner på enkeltmolekyleniveau og i realtid har givet betydelig indsigt i genomstabilitet 1,2. Ud over at arbejde med enkelte DNA-molekyler et ad gangen, giver evnen til at se transaktioner mellem individuelle molekyler i nærheden yderligere indsigt 3,4,5. Manipulation af yderligere DNA-molekyler kræver både yderligere optiske fælder samt højkvalitets, multikanals, mikrofluidiske flowceller6.
Der er flere metoder til rådighed til at generere mere end en optisk fælde. Disse omfatter galvanometerscanningsspejle, akustiske optiske modulatorer og diffraktiv optik, der genererer holografisk optisk pincet 4,7,8,9. Ofte producerer scanningsspejle og akustiske optiske modulatorer fælder, der timeshare. I opsætningen beskrevet her opdeles strålen fra en enkelt Nd: YAG-laser ved polarisering, og derefter styrer galvanometerlaserscanningsspejle positionen af det, der kaldes mobilfælden (figur 1)4. For at lette placeringen af spejle og filtre til at dirigere fangststrålen til mikroskopmålets bagåbning anvendes en HeNe-laser. Dette gør den overordnede justering lettere, da HeNe-strålen er synlig for det blotte øje, mens infrarøde bjælker ikke er det. HeNe-strålen er også sikrere at arbejde med, hvilket gør placeringen af spejle og andre komponenter mindre stressende. I første omgang er strålevejen for denne laser adskilt fra 1064 nm-strålen, men introduceres i samme strålebane og derefter i mikroskopmålet. Når fysisk justering er opnået, udføres placeringen af 1064 nm-strålen oven på HeNe-strålen, og dette lettes ved hjælp af en infrarød seer og forskellige strålebilleddannelsesværktøjer til at visualisere stråleposition og kvalitet. Derefter introduceres stråleekspanderen, og den resulterende ekspanderede infrarøde stråle justeres på målets bagåbning. Endelig fjernes målet, og effekten i hver polariseret stråle måles og justeres ved hjælp af λ/2 bølgeplader til at være ens (figur 1C). Effektmålinger udføres også, når målet er returneret, og typisk er der et strømtab på 53%. Der er dog tilstrækkelig kraft til at danne stabile faste og bevægelige optiske fælder i brændplanet (figur 1D).
For at afbilde DNA-transaktioner spiller mikrofluidiske flowceller en nøglerolle, da de tillader kontrollerede målinger på enkeltmolekyleniveau med høj rumlig og tidsmæssig opløsning (figur 2). Udtrykket mikrofluidisk refererer til evnen til at manipulere væsker i en eller flere kanaler med dimensioner fra 5-500 μm10,11. Udtrykket strøm refererer til den faktiske væske inden for en kanal, og kanalen refererer til den fysiske kanal, hvor en væskestrøm eller strømme bevæger sig. Enkeltkanals flowcelledesign har en fælles, fysisk kanal, hvor reaktioner observeres, og der er typisk kun en væskestrøm til stede. Således er disse designs kendt som single-stream flowceller. I modsætning hertil defineres multi-stream flowceller som en mikrofluidisk enhed, hvor to eller flere indgangskanaler konvergerer til en enkelt, fælles, fysisk kanal (figur 2A). Inden for den fælles kanal strømmer væskestrømmene, der stammer fra de enkelte kanaler, parallelt med hinanden og forbliver adskilt med kun minimal blanding mellem dem, der forekommer på grund af diffusion (figur 2B). I de fleste eksperimentelle opsætninger skubber en enkelt pumpe væsker ind i hver kanal med samme hastighed. I modsætning hertil, når der anvendes grænsestyring, skubber tre eller flere uafhængigt styrede pumper væsker gennem kanalerne. Hver pumpe arbejder dog med en anden hastighed, men nettostrømningshastigheden i den fælles kanal er konstant12. Dette muliggør hurtig udskiftning af hovedkanalkomponenter ved blot at ændre pumpehastigheden.
Ud over laminær strømning er en anden kritisk faktor den parabolske hastighedsprofil i den laminære væskestrøm. Den højeste strømningshastighed forekommer midt i strømmen, og den langsomste forekommer ved siden af overfladerne (figur 2C)13. Denne profil skal betragtes som fuldt ud at strække et DNA-molekyle, der er fastgjort til en perle, der holdes i strømmen for præcis visualisering af fluorescerende DNA og nøjagtige enkeltmolekyleanalyser. Her strækkes DNA'et til B-form og holdes på plads under 0 pN kraft. For at opnå dette skal fokuseringen af den optiske fældeposition være til en position 10-20 μm fra bunddækseloverfladen (figur 2D). Der skal udvises forsigtighed, så DNA-molekylet ikke strækkes ud over B-form, da dette kan hæmme enzymreaktioner. Under typiske bufferforhold er 1 μm = 3.000 bp DNA14. Ved at fange 10-20 μm fra dækslippet placeres DNA-komplekset desuden langt fra overfladen, hvilket minimerer overfladeinteraktioner.
Mange metoder er blevet brugt til at skabe mikrofluidiske enhedskanaler, og disse kan gøres i laboratoriet, eller flowceller kan købes fra kommercielle kilder 6,15,16,17. De optimale materialer, der anvendes til at konstruere flowcellerne, skal være mekanisk stive, optisk gennemsigtige med lav fluorescens og uigennemtrængelige for organiske opløsningsmidler6. Ofte bruges borosilikatflydeglas eller smeltet silica til at give et stabilt flowmiljø i længere tid, der er egnet til optisk fangst, visualisering og kraftdetektion. Disse materialer tillader også anvendelse af ikke-vandige opløsningsmidler (f.eks. Methanol af spektrofotometrisk kvalitet) for at forenkle overfladebefugtning og fjernelse af luftbobler og denatureringsmidler (f.eks. 6M guanidiniumhydrochlorid) eller vaskemidler til at rense flowcellen. Endelig varierer metoderne til at indføre væsker i flowceller fra komplekse vakuumpumpesystemer til enkeltsprøjtepumper 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I den her beskrevne fremgangsmåde anvendes en sprøjtepumpe, der kan rumme op til 10 sprøjter (figur 3A). Dette giver fleksibilitet til at bruge enkeltkanals flowceller eller flowceller med flere indløbskanaler. Her anvendes en trekanals flowcelle og parres med sprøjter, der holdes på plads på sprøjtepumpen ved hjælp af poly-ether-ether-keton (PEEK) slange (figur 3A-C). Strømmen af væsker styres af firevejskoblingsventiler og tjener således til at minimere indførelsen af bobler i flowcellen (figur 3A, D). Derudover anbefales Hamilton gastætte sprøjter, der har stive glasvægge og polytetrafluorethylen (PTFE)-belagte stempler, da de giver usædvanlig glat stempelbevægelse, der er afgørende for at opnå et jævnt flow14,27.
I det beskrevne eksperimentelle system er flowceller med to til fem indløbskanaler blevet anvendt. Antallet af indløbskanaler dikteres af det eksperiment, der udføres. Til undersøgelsen af RecBCD og Hop2-Mnd1 var to strømkanaler tilstrækkelige14,28. For helicasen blev enzymet bundet til den frie ende af DNA'et og oversat til en strøm indeholdende magnesium og ATP for at initiere translokation og afvikling. For Hop2-Mnd1 blev optisk fanget DNA oversat til den tilstødende væskestrøm indeholdende proteiner og buffer ± divalente metalioner. Brugen af trekanals flowceller gør det muligt for en at fange DNA i strøm 1, oversætte DNA'et til stream 2 for at tillade proteinbinding at forekomme og derefter at streame 3, hvor ATP er til stede, for eksempel for at initiere reaktioner. En variation af ovenstående er at bruge fluorescerende mærket protein i kanal 2, hvilket resulterer i, at væskestrømmen er helt hvid og udelukker visualisering af DNA'et. Når dette molekyle oversættes til strøm 3, er både proteiner og DNA nu synlige, når reaktioner initieres.
Brugen af firevejskoblingsventiler til styring af væskestrømmen er en kritisk komponent i systemet for at eliminere bobler i flowcellerne. Bobler er skadelige for stabil væskestrøm, da de trækker sig sammen og udvider sig på uforudsigelige måder, hvilket resulterer i hurtige ændringer i strømningshastighed og introduktion af turbulens. Når ventilerne er placeret mellem sprøjter og indløbsrør, afbrydes strømningsvejen ved at skifte ventilposition, når sprøjterne skiftes ud. Når den nye sprøjte sættes på plads, kan stemplet trykkes manuelt, så >6 μL skubbes ud (ventilens døde volumen), og dette eliminerer bobler næsten helt.
Fastgørelsen af forbindelser til flowceller er ofte det hastighedsbegrænsende trin i flowcellebrug. Vi beskriver brugen af to typer stik: aftagelige kendt som press-fit og permanente (nanoport-samlinger). De aftagelige stik er enkle at klæbe til en flowcelle, og forskellige typer fleksible slanger ud over den anbefalede PTFE kan testes med disse stik. Dette er en hurtig og omkostningseffektiv måde at teste slanger og stik på uden at ofre dyrere glasflowceller. I modsætning hertil er nanoport-samlinger fastgjort permanent, modstår tryk op til 1.000 psi, og i vores hænder er deres anvendelse begrænset til PEEK-rør med forskellige diametre. Dette er ikke en ulempe, da PEEK-slanger fortrinsvis anvendes. En enkelt glasstrømningscelle med permanente samlinger fastgjort kan genbruges i mere end 1 år med omhyggelig brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Justering og test af laserfælde med polystyrenperler
BEMÆRK: For opsætningen henvises til figur 1A, B.
FORSIGTIG: Eksperimentalisten skal bære passende beskyttelsesbriller eller lasersikkerhedsbriller under laserstrålejustering. Da det optiske pincetsystem, der er beskrevet heri, bruger både HeNe- og IR-stråler, kræves der to separate sæt lasersikkerhedsglasvarer.
- HeNe Beam-justering
- Placer alle optiske komponenter på breadboardet. Juster breadboardet, så det er så tæt på en vinkel på 90° som muligt i forhold til mikroskopet.
- Fastgør parringsrøret indeholdende objektiv- og telanlinsen til mikroskopet (figur 1A-11,12).
BEMÆRK: Telan-objektivet er et linsesystem, der bruges til at fokusere billedet på det mellemliggende billedplan i okularerne. - Tænd HeNe-laseren, og åbn lukkeren (figur 1A-18). Strålen skal ramme filter (figur 1A-3) i en højde af 54 mm, der reflekterer 50% af lyset på spejl 5 (figur 1A-5). De resterende 50% af strålen rammer spejl 4 (figur 1A-4) i samme højde som spejl 3.
- Spejl 4 (figur 1A-4) justeres, så strålen rammer spejl 6 (figur 1A-6) i en højde af 51 mm.
- Spejl 6 (figur 1A-6) justeres, så strålen rettes mod det nederste galvaniske spejl i en højde af 51 mm. Strålen, der kommer ud fra det øvre galvaniske spejl, vil være på 57,5 mm.
- Spejl 3 (figur 1A-3) justeres, så denne stråle rammer spejl 5 (figur 1A-5) i en højde på 57,5 mm. Når strålen er reflekteret fra spejl 5, skal den ramme spejl 9 (figur 1A-9) i samme højde. Strålen rekombineres effektivt ved spejl 9, passerer gennem målet og telan linsesystem på spejl 21 (figur 1A-21), som reflekterer det ind i målet.
- Placer et rent mikroskopglas på mikroskopets scene. Tænd kameraet, og indskriv, hvordan de faste stråler og scanningsstrålerne vises enkeltvis på skærmen. Start med spejl 3, derefter 5 og 9, til sidst 21, udfør små justeringer for at placere den faste stråle i midten af skærmen.
- For at sikre, at vinklen på strålens udgangsspejl 21 er 90°, skal du ændre mikroskopets Z-højde og placere strålebilledet på gliderens øvre og nedre overflade. Når de er identiske, er strålen i den rigtige position, som er vinkelret på scenen. Lukd denne stråle ved hjælp af lukker 19 (figur 1A-19).
- Start med spejle 4 og 6, udfør små justeringer for at placere den faste stråle i midten af skærmen. Lukd denne stråle.
- Infrarød (IR) Strålejustering
FORSIGTIG: Udfør alle trin ved lav lasereffekt af sikkerhedsmæssige årsager.- Bølgeplade 14 (figur 1A-14) justeres for at justere forholdet mellem transmitterede og reflekterede stråler, der opdeles ved strålesplitteren 2 (figur 1A-2). Strålesplitter 2 reflekterer s-komponenten i laserstrålen og transmitterer p-komponenten.
- Strålen, der passerer gennem 2, rammer spejl 7 (figur 1A-7), som afbøjer strålen på det nederste galvaniske spejl. Det skal følge HeNe-strålens vej på spejl 21. Udfør små bevægelser af spejl 7 for at opnå denne positionering.
- Juster spejl 2, så strålen, der reflekteres af spejl 2, rammer spejl 10 (figur 1A-10) i en højde på 57,5 mm.
- Strålen reflekteres fra spejl 10 til spejl 8 (figur 1A-8) i en højde af 57,5 mm. Den efterfølgende stråle skal ramme spejl 9 i samme højde. Hvis ikke, skal du foretage små justeringer af spejle 10 og 8 efter behov.
- Fjern målet, og placer hovedet på effektmåleren over porten i det objektive tårn.
- Brug pladerne 14, 15 og 16 (figur 1A-14,15,16) til at justere effekten af hver laserstråle, så de er ens som vist i figur 1C.
- Sæt stråleudvidelse 1 (figur 1A-1) på plads. Juster den udvidede laserstråle til at være cirkulær uden koma eller bygningsfejl.
- For at teste de optiske fælder fremstilles en opløsning af 1 μm polystyrenperler suspenderet i vand. Placer derefter 10 μL af denne opløsning på et mikroskopglas, læg en dækseddel ovenpå og forsegl med neglelak. Placer diaset på mikroskoptrinnet, og test de optiske fælder ved at fange disse 1 μm perler. Sørg for, at perlerne suges ind i fælderne og holdes stabilt, når scenen flyttes. Fældefangst bør ske lige effektivt fra alle sider af fælden.
2. Fremstilling af mikrofluidisk kammer
- Hvis flowcellen er en kommercielt konstrueret anordning fremstillet af polydimethylsiloxan (PDMS) på en dækslip, skal du fortsætte til trin 3. Hvis det er en glasenhed med stik fastgjort, skal du fortsætte til trin 4.
- Hvis flowcellen ikke har stik fastgjort, skal du først binde dem til indgangshullerne på mikroskoprutschebanen. Se trin 3 for trinene til fastgørelse af stik.
3. Flowcelleforbindelser ved hjælp af en PDMS-flowcelle
BEMÆRK: For opsætningen henvises til figur 2D.
- Placer flowcellen på en ren plan overflade. Hold PTFE-slangen 3 mm fra den frie ende med tang. Skub slangen ind i den præformede port (porten kan understøtte 2 bar linjetryk).
- Gentag denne procedure for hver af de resterende porte. Tilslut indløbsportene til sprøjtepumpen og udløbet til en affaldsflaske (figur 4A, B).
- Fyld hver glassprøjte med 1 ml spektrofotometrisk methanol. Fastgør hver sprøjte til en skifteventil. Sørg for, at ventilen har udløbet rettet mod affald, og rens hver ledning med 50 μL methanol (figur 4C, lukket position).
- Skift udløbspositionen til flowcellen (figur 4C, åben position). Pump 800 μL methanol gennem flowcellen med en strømningshastighed på 100 μL/t for at fugte overfladerne og eliminere bobler.
- Den næste dag gentages denne proces ved hjælp af 800 μL ultrarent vand. Flowcellen er nu klar til brug.
4. Fastgørelse af pressepasrørsstik
BEMÆRK: For opsætningen henvises til figur 2F.
- Hvis der skal anvendes tryktilpasningsrør, skal du forsigtigt fjerne klæbebåndet fra den ene side af stikket og placere det over hullet i mikroskopglasset. Tryk ned i et par sekunder. Gentag processen for de resterende connectorer.
- Placer flowcellen på en ren plan overflade. Hold PTFE-slangen 3 mm fra den frie ende med tang. Skub slangen ind i det præformede hul i porten, og gentag denne procedure for hver af de resterende porte.
- Fastgør slanger fra indløbene til koblingsventilerne. Fortsæt til trin 7.
5. Fastgørelse af permanente samlinger
BEMÆRK: For opsætningen henvises til figur 2A-C.
- Udfør fastgørelsen enten på en ren, flad overflade eller på en specialbygget manifold for at holde flowcellen og stikkene på plads, mens limningen finder sted.
- Flowcellen anbringes på en ren plan overflade eller i manifoldens forsænkede sektion (figur 2B). Placer en lille mængde glaslim på bunden af samlingen, og indsæt tætningen.
- Placer nanoporten over et af indgangshullerne på mikroskopglasset. Skub forsigtigt ned og hold på plads uden lateral bevægelse. Gentag processen for de resterende porte.
- Lad tørre eller klemme på plads i manifolden. Fjern forsigtigt flowcellen fra manifolden, og sørg for, at samlingerne flugter godt med indgangsportene i flowcellen. Fortsæt til trin 7, når du er klar.
6. Flowcelleforbindelser og forberedelse
BEMÆRK: For opsætningen henvises til figur 4A, B.
- Placer en flowcelle på mikroskoptrinnet. Fastgør slangen ved hjælp af de fingertætte stik.
- Fyld hver glassprøjte med 1 ml spektrofotometrisk methanol. Fastgør hver sprøjte til en skifteventil. Sørg for, at ventilen har udløbet rettet mod affald, og rens hver ledning med 50 μL methanol (figur 4C, lukket position).
- Skift udløbspositionen til flowcellen (figur 4C, åben position). Pump 800 μL methanol gennem flowcellen med en strømningshastighed på 100 μL/t for at fugte overfladerne og eliminere bobler.
- Den næste dag gentages denne proces ved hjælp af 800 μL ultrarent vand. Flowcellen er nu klar til brug.
7. Kontrol af væskestrømmen
- Drej koblingsventilerne til lukket position (figur 4C). Fjern sprøjterne, kassér det resterende vand, og fyld sprøjterne med eksperimentelle opløsninger, for eksempel DNA-perler; enzym; og ATP. Returner sprøjter til pumpen og tilslut dem til koblingsventilerne.
- I denne position skal du manuelt tvinge stemplerne ned 5-10 μL for at fjerne eventuelle bobler. Skift skifteventilens position til Åbn.
- Brug flowhastighedsskemaet til at opnå en væskestrømningshastighed, der er optimal til diffusering og visualisering som beskrevet i tabel 1. Det optimale væskeflow til optisk fangst bør muliggøre stabil fangst af perler, og når DNA'et er strakt, skal det være B-form (~3.000 bp/μm).
8. Fangst af polystyrenperler med enkelte DNA-molekyler fastgjort
- Ved 10x forstørrelse skal du lokalisere grænsen mellem væskestrømme tæt på kanalindgangspunkterne. Tilsæt olie til 100x målet, og skift til den højere forstørrelse.
- Åbn skodderne for de optiske fælder (enten begge eller en ad gangen). De fokuserede laserstråler skal fange perler, og DNA skal strække sig ud med det samme.
- Når et kompleks er blevet fanget, skal du oversætte trinnet vinkelret på strømmen (figur 3A, C, indsat). Dette vil flytte det fangede kompleks fra DNA-perleopløsningen til stream 2. Yderligere oversættelse vil flytte komplekset til stream 3.
9. Rengøring af flowcelle
BEMÆRK: Udfør dette dagligt.
- Sluk for pumpen, når eksperimentet er afsluttet. Drej koblingsventilerne til lukket position (figur 4C).
- Fjern sprøjter og tøm dem. Skyl tre gange med filtreret destilleret vand.
- Fyld sprøjterne med rengøringsopløsning. Anbring sprøjter i pumpen, og tilslut til koblingsventiler.
- Rens skifteventiler, og skift position for at åbne. Pump 800 μL rengøringsopløsning ved en strømningshastighed på 100 μL/t typisk natten over.
- Den næste dag skal du lukke koblingsventilerne og derefter fjerne og skylle sprøjter med vand. Skyl flowcellen og linjerne med 4-800 μL vand med en strømningshastighed på 400-800 μL/h. Hvis der kræves mere anstrengende rengøring af flowceller, skal rengøringsopløsningen udskiftes med 6 M guanidiumhydrochlorid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den indledende test af fældejusteringen og styrken udføres med 1 μm, ikke-fluorescerende polystyrenperler. Da det meste af den forskning, der udføres i laboratoriet, bruger fluorescens, tester vi yderligere fældestyrke ved hjælp af 1 μm, Dragon grønne polystyrenperler (figur 1D, E). Herefter ændres arbejdet til optisk fangst af DNA-perlekomplekser, hvor DNA'et farves med det bis-interkalerende farvestof YOYO-114,29. Når disse komplekser er fanget 10-15 μm over dækslipoverfladen i en mikrofluidisk strømningscelle, strækker væskestrømmen forbi perlen DNA'et (figur 3B, C). Det er vigtigt at måle længden af det væskestrakte DNA for at sikre, at det strækkes til dets B-formlængde, hvilket er den forventede længde. For eksempel for bakteriofag lambda DNA er den fulde længde lidt længere end 16 μm, hvilket svarer til 48.504 bp14.
For at karakterisere væskestrømmen blev fluorescerende perler introduceret i flowceller med en fokushøjde på 15 μm over dækslipoverfladen ved hjælp af forskellige pumpehastigheder og i opløsninger med forskellig viskositet. Film af perleposition blev fanget, og perleposition blev sporet ved hjælp af billedanalysesoftware. Resultaterne viser, at for perler med en diameter på 1 μm kan lineær hastighed spores nøjagtigt ved en pumpestrømningshastighed på 100 μL/t i saccharoseopløsninger fra 10% -50% (figur 5A). Under lignende forhold kan kraften på perlen beregnes og findes at variere fra 10 til 400 pN, afhængigt af pumpens strømningshastighed og opløsningsviskositet (figur 5B). Endelig blev virkningen af perlediameter fra 120 til 970 nm på kraft evalueret i forskellige koncentrationer af saccharose. Dataene afslører, at kræfter fra 1-27 pN kunne måles ved at fastgøre perler med forskellig diameter til et motorprotein og bede motoren om at trække perlen mod væskestrømmen (figur 5C).
Figur 1: Optisk layout og demonstration af fangstaktivitet. (A) Skematisk af det optiske layout med IR-strålen i rødt og HeNe-strålen i sort. (B) Fotografi af optiske komponenter monteret på et breadboard. Komponentnumrene i panelerne A og B er som følger: 1), Stråleudvidelse; 2), Interferens spejl (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), Interferensspejle (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), interferensspejle (Rmax = 633 nm); 7), Interferens spejl (Rmax = 1064 nm; Tmaks. = 633 nm); 8), Interferens spejl (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), Interferens spejl (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), Interferens spejl (Rmax = 1064 nm); 11), objektiv linse, f = 110 nm; 12), Telan linse; 13), Galvaniske spejle; 14-16), rotatorer (/2); 17), IR-scanningskanal lukker; 18), Synlig kanal lukker; 19), IR fast kanal lukker; 20), Strålestop og 21), Interferensspejl (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Måling af effekt. Effekten fra laseren måles, før laserhovedet installeres i det optiske layout. Når fældejusteringen er udført, måles stråleeffekten efter 100x målet for hver fælde. (D) og (E) Billeder, der viser stabil, optisk fangst af 1 μm fluorescerende perler. F, fast fælde og M, mobilfælde med mobilfælden i scanningstilstand, der bevæger sig gennem en lille (D) eller stor (E) cirkel ved 30 mHz. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikrofluidiske flowceller. (A) Samling af en trekanals flowcelle fremstillet af borosilikatglas. (B) En manifold til stabilt at placere flowceller under konnektorbinding. Top, bunden af aluminiumsmanifolden med en 1 mm forsænket sektion for sideværts placering af flowcellen. De fire stolper (en i hvert hjørne) fører låget på manifolden på plads, mens de mere centralt placerede gevindbolte bruges til at klemme låget på plads. Bund, manifold låg med borede huller, der matcher stolperne og boltene på manifoldbunden. (1), møtrikker, der fastgøres til manifoldens bundbolte; (2) fjedre, der er placeret mellem møtrikkerne og manifoldlåget for at give let spænding under limningsprocessen. (C) Et nærbillede af konvergensen af indløbskanalerne til en fælles enkelt væskestrøm i en glasstrømningscelle med konnektorer, der allerede er fastgjort. En fjerdedel placeres ved siden af flowcellen som reference. (D) Et billede af PDMS-flowcellen. PDMS-lagene er 3 mm tykke. (E) En smeltet silicaflowcelle med luer-stik. (F) En borosilikatglasflowcelle med tryktilpasningsstik på plads. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Væskestrømningsegenskaber gennem en glasstrømningscelle. (A) Væskestrømmen i strømningscellen er laminær. Skemaet viser flowcellen fra toppen for at demonstrere, at diffusion mellem kanaler er den vigtigste kilde til blanding mellem tilstødende væskestrømme. Strømningsretningen er angivet med blå pile, og de enkelte strømme er farvet hvide, lysegrå og hvide. De bredere regioner med tværgående diffusion mellem kanaler er angivet med rødt. Indsatsen viser et fluorescensbillede af tilstødende væskestrømme ved 10x forstørrelse med fluorescerende mærkede DNA-perlekomplekser i den nedre strøm og buffer kun i den øvre strøm. De hvide pletter i den øvre strøm er skudstøj fra CCD-kameraet. (B) Strømningsprofilen (lys lilla) i laminære flowceller er parabolsk. Strømningscellen ses fra siden, og strømningsretningen er angivet over hver celle. De hurtigste væskehastigheder forekommer i flowcellen placeret i midten, mens de langsomste væskehastigheder forekommer ved siden af flowcelleoverfladerne. For et optisk fanget DNA-perlekompleks placeret i midten af flowcellen strækker væskestrømmen derfor bakteriofagen λ DNA-molekylet (48.504 bp) til 16 μm (B-form), så der kan foretages klar visualisering (venstre billede). I modsætning hertil oplever det samme molekyle placeret nær overfladen af strømningscellen lave strømningshastigheder og kan ikke strækkes ud. (C) Et enkelt DNA-perlekompleks er placeret i en flowcelle. Der kan anvendes forskellige dybdestrømsceller, men i hvert tilfælde kan strålejusteringerne indstilles, så optimal fangst sker 10-20 μm over dækslipoverfladen, hvilket eliminerer overfladeeffekter og har stabil strømning, så DNA-molekyler kan strækkes til B-form. Som angivet på venstre billede i (C) strækkes DNA'et for at muliggøre klar visualisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Flow- og reaktionskontrol af optisk fanget DNA i en flowcelle i mikroskopstadiet . (A) Parring af flowcellen til en sprøjtepumpe. Et fotografi af en trekanals flowcelle forbundet til en sprøjtepumpe via trevejskoblingsventiler præsenteres. Flowcellen holdes på plads på et motoriseret trin i et omvendt mikroskop. Flowcellen er forbundet til en affaldsledning (venstre) og koblingsventiler (stiplet cyancirkel) via orange, 500 μm rør (angivet med grøn tape). Ventilerne er stabilt monteret på en specialbygget manifold tilpasset sprøjtepumpeapparatet, der huser 1 ml gastætte sprøjter (gule pile afgrænser stempler). Affaldsledningerne bruges til at fjerne luftbobler, der kan fanges i skifteventilen under sprøjteskift. (B) Nærbillede af flowcellen med tre kanaler. For at lette visualisering af væskestrømme er de ydre blevet farvet med madfarve, hvor den centrale strøm kun indeholder vand. Det zoomede område angiver, hvordan et optisk fanget perle-DNA-molekylekompleks oversættes fra en væskestrøm til den næste (blå pil) ved at oversætte scenen vinkelret på strømmen (sort pil). C) Skemaer over trevejskoblingsventilerne med angivelse af deres driftspositioner. Bogstavbetegnelserne F, S og W svarer til retningsvæsken og kan strømme til henholdsvis flowcellen, sprøjten og affaldet. En port er permanent lukket som angivet med det sorte stik øverst i hvert skema. I åben eller operationel position (venstre panel) passerer væskestrømmen direkte gennem koblingsventilen fra sprøjten (S) til flowcellen (F). I lukket position (højre panel) drejes drejeknappen, så flowcellen er forseglet fra miljøet. I denne position ledes strømmen til affald, og sprøjter kan skiftes ud uden at indføre luftbobler i flowcellen. Da ventilerne har et dødvolumen på 6 μL, spildes meget lidt opløsning ved rensning af linjer, før de vender tilbage til den åbne konfiguration. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Perlebevægelse og modsatrettet kraft påvirkes af væskestrøm. (A) Lineær perlehastighed påvirkes af pumpehastighed og saccharosekoncentration. (B) Den modsatte kraft på en perle påvirkes af opløsningsviskositeten. (C) Perlediameter påvirker kraften på perler under strømning. I alle eksperimenter blev fluorescerende perler brugt (Dragon green). I (A) og (B) blev der anvendt perler med en diameter på 0,97 μm, og i (C) blev der anvendt perler med forskellig diameter. Saccharoseopløsninger blev fremstillet i ultrarent vand, filtreret gennem 0,2 μm filtre og brydningsindeks målt ved hjælp af et håndholdt refraktometer, med viskositet bestemt i centipoise ved hjælp af ISCO-tabeller og endelig konverteret til SI-enheder i mPa.s. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Strømningshastighed (μL/h)b | Tid pr. trin (min.) | Dispenseret volumen (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 eller derover | 1 eller derover |
| en. Disse er væskestrømningshastigheder beregnet af sprøjtepumpesoftwaren og er unikke for hver sprøjtediameter, der anvendes. Strømningshastighederne muliggør hurtig påfyldning af linjerne og flowkammeret (800 μl/t) efterfulgt af et gradvist fald til den ideelle strømningshastighed til diffusering og visualisering | ||
| b. Sprøjtepumpen kan styres fra tastaturet eller ved hjælp af software leveret af sælgeren. | ||
Tabel 1: Væskestrømningshastigheder for at minimere bobler og opnå stabil fangst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den omhyggelige samling af flowsystemet er afgørende for det vellykkede resultat af eksperimenter 4,6. Et af de mest udfordrende aspekter af protokollen er fastgørelsen af stik til glasoverfladen. Til dette bruger vi følgende to tilgange: press-fit fit slangestik og nanoport-samlinger. Press-fit-stik klæber let til glas efterfulgt af at skubbe PTFE-slanger ind i de præformede huller ved hjælp af tang. Når der kræves en mere stabil vedhæftning, foretrækkes binding af nanoport-samlinger. Ved omhyggelig brug og rengøring kan en enkelt glasstrømningscelle med permanente samlinger bruges i mere end 1 år. Hvis flowceller skal skiftes ud oftere, kan PDMS-flowceller bruges, da de er et fremragende og billigere alternativ. De kan genbruges, men PDMS er modtagelig for hævelse, hvilket kan ændre væskestrømningsadfærden over tid.
Både glas- og PDMS-flowceller er ikke uforgængelige. I laboratoriet er den maksimale strømningshastighed, der anvendes, 800 μL / t. Hvis dette overskrides dagligt og/eller i længere tid, kan flowcellevridning (glasflowceller) og forvrængning af PDMS forekomme. Mens den indledende befugtningsprocedure med methanol og vand tager tid, er det det værd, da alle bobler elimineres, og også lækager ved stik kan detekteres. De flowceller, der er beskrevet her, giver fleksibilitet til de eksperimenter, der udføres. Ved hjælp af disse tilgange til forskellige flowceller, slanger og fastgørelse af forskellige stik kan eksperimentelle forhold let tilpasses og hurtigt optimeres for at sikre, at der opnås optimale data. Y-formede kanalflowceller præsenteres, men et stort udvalg af mikrofluidiske enhedsdesign er tilgængelige fra flere virksomheder både uden og med stik fastgjort. Dette giver forskeren endnu større fleksibilitet i eksperimentelt design.
Brugen af firevejskoblingsventiler er en enkel og effektiv metode, der sikrer, at når flowsystemet er samlet og testet, bliver det effektivt et lukket miljø, hvor forurening er minimal, og bobler elimineres. Sidstnævnte er kritisk, da bobler har tendens til at komprimere og dekomprimere tilfældigt under et eksperiment, og dette forstyrrer væskestrømmen, hvilket får fangede DNA-molekyler til at bevæge sig på uventede måder og endda gå i stykker. Der skal udvises stor omhu for at sikre, at de forhindres i at dannes i systemet.
Endelig er det her beskrevne system optimeret til visuel biokemi, hvor omhyggelig analyse af DNA, perler knyttet til proteiner eller fluorescerende mærkede proteiner kan udføres. Selvom systemet ikke er designet til at udføre kraftmålinger med dobbeltfælder og tilsætning af kvadrantfotodetektorer, kan kræfter måles ved at fastgøre perler med forskellig diameter til DNA-motorproteiner, for eksempel, og bede motoren om at trække denne perle mod væskestrøm. Ved at variere opløsningsviskositet, væskeflow og perlediameter kan en lang række modsatrettede kræfter anvendes til at give detaljeret indsigt i motorisk proteinfunktion (figur 5). Dette er en enkel og billig måde at måle kræfter forbundet med biologiske transaktioner på, men det mangler den præcision, der er forbundet med mere følsomme tilgange. Når den visuelle biokemiske tilgang kombineres med følsomme kraftdetekteringsmetoder, kan der gives mere komplette billeder af biokemiske reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forskning i Bianco laboratoriet er støttet af NIH tilskud GM100156 og GM144414 til P.R.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M.
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
