Summary
Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.
Abstract
Visuele biochemie is een krachtige techniek voor het observeren van de stochastische eigenschappen van afzonderlijke enzymen of enzymcomplexen die worden verduisterd in de middeling die plaatsvindt in bulkfasestudies. Om visualisatie te bereiken, worden dubbele optische pincetten, waarbij de ene val vast is en de andere mobiel is, gericht in één kanaal van een multi-stream microfluïdische kamer die op het podium van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop is geplaatst. Het optische pincet vangt enkele moleculen van fluorescerend gelabeld DNA en vloeistof stroomt door de kamer en langs de gevangen kralen, rekt het DNA uit tot B-vorm (onder minimale kracht, d.w.z. 0 pN) waarbij het nucleïnezuur wordt waargenomen als een witte string tegen een zwarte achtergrond. DNA-moleculen worden van de ene stroom naar de andere verplaatst, door het stadium loodrecht op de stroom te vertalen om het initiëren van reacties op een gecontroleerde manier mogelijk te maken. Om succes te behalen, worden microfluïdische apparaten met optisch heldere kanalen gekoppeld aan glazen spuiten die op hun plaats worden gehouden in een spuitpomp. Optimale resultaten maken gebruik van connectoren die permanent aan de stroomcel zijn bevestigd, buizen die mechanisch stijf en chemisch resistent zijn en die zijn verbonden met schakelkleppen die bellen elimineren die laminaire stroming belemmeren.
Introduction
De mogelijkheid om eiwit-DNA-interacties op het niveau van één molecuul en in realtime te visualiseren, heeft een significant inzicht gegeven in de genoomstabiliteit 1,2. Naast het één voor één werken met enkele DNA-moleculen, biedt de mogelijkheid om transacties tussen individuele moleculen in de buurt te bekijken extra inzicht 3,4,5. De manipulatie van extra DNA-moleculen vereist zowel extra optische vallen als hoogwaardige, meerkanaals, microfluïdische stromingscellen6.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar om meer dan één optische val te genereren. Deze omvatten galvanometerscanspiegels, akoestische optische modulatoren en diffractieve optica, die holografische optische pincetten genereren 4,7,8,9. Vaak produceren scanspiegels en akoestische optische modulatoren vallen die timeshare zijn. In de hier beschreven opstelling wordt de straal van een enkele Nd:YAG-laser gesplitst op polarisatie en vervolgens bepalen galvanometerlaserscanspiegels de positie van wat de mobiele val wordt genoemd (figuur 1)4. Om de positionering van spiegels en filters te vergemakkelijken om de vangstraal naar de achterste opening van het microscoopobjectief te richten, wordt een HeNe-laser gebruikt. Dit maakt de algehele uitlijning gemakkelijker omdat de HeNe-straal zichtbaar is voor het blote oog, terwijl infraroodstralen dat niet zijn. De HeNe-straal is ook veiliger om mee te werken, waardoor de positionering van spiegels en andere componenten minder stressvol is. Aanvankelijk is het straalpad voor deze laser gescheiden van de 1064 nm-straal, maar wordt in hetzelfde straalpad en vervolgens in het microscoopobjectief geïntroduceerd. Zodra fysieke uitlijning is bereikt, wordt de 1064 nm-straal bovenop de HeNe-straal geplaatst en dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van een infraroodviewer en verschillende straalbeeldvormingstools om de positie en kwaliteit van de bundel te visualiseren. Vervolgens wordt de bundelexpander geïntroduceerd en wordt de resulterende uitgebreide infraroodstraal uitgelijnd op de achterste opening van het objectief. Ten slotte wordt het doel verwijderd en wordt het vermogen in elke gepolariseerde bundel gemeten en aangepast met behulp van λ/2 golfplaten om gelijk te zijn (figuur 1C). Vermogensmetingen worden ook gedaan zodra het doel is geretourneerd en meestal is er een vermogensverlies van 53%. Er is echter voldoende vermogen om stabiele vaste en bewegende optische vallen in het brandpuntsvlak te vormen (figuur 1D).
Om DNA-transacties in beeld te brengen, spelen microfluïdische stromingscellen een sleutelrol omdat ze gecontroleerde metingen op het niveau van één molecuul met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk maken (figuur 2). De term microfluïdisch verwijst naar het vermogen om vloeistoffen te manipuleren in een of meer kanalen met afmetingen variërend van 5-500 μm10,11. De term stroom verwijst naar de werkelijke vloeistof in een kanaal en het kanaal verwijst naar het fysieke kanaal waarin een vloeistofstroom of stromen bewegen. Single-channel flow cell design heeft een gemeenschappelijk, fysiek kanaal waar reacties worden waargenomen en er is meestal slechts één vloeistofstroom aanwezig. Deze ontwerpen staan dus bekend als single-stream flow cellen. Multi-stream flowcellen daarentegen worden gedefinieerd als een microfluïdisch apparaat waarin twee of meer toegangskanalen samenkomen in een enkel, gemeenschappelijk, fysiek kanaal (figuur 2A). Binnen het gemeenschappelijke kanaal stromen de vloeistofstromen die afkomstig zijn van de afzonderlijke kanalen parallel aan elkaar en blijven gescheiden met slechts minimale vermenging tussen hen als gevolg van diffusie (figuur 2B). In de meeste experimentele opstellingen duwt een enkele pomp vloeistoffen met dezelfde snelheid in elk kanaal. Wanneer daarentegen grensbesturing wordt gebruikt, duwen drie of meer onafhankelijk geregelde pompen vloeistoffen door de kanalen. Elke pomp werkt echter met een ander toerental, maar het nettodebiet in het gemeenschappelijke kanaal is constant12. Dit maakt de snelle uitwisseling van hoofdkanaalcomponenten mogelijk door simpelweg de pompsnelheid te wijzigen.
Naast laminaire stroming is een andere kritische factor het parabolische snelheidsprofiel in de laminaire vloeistofstroom. De hoogste stroomsnelheid vindt plaats in het midden van de stroom en de langzaamste vindt plaats naast de oppervlakken (figuur 2C)13. Dit profiel moet worden beschouwd als een volledig uitrekken van een DNA-molecuul dat is bevestigd aan een kraal die in de stroom wordt gehouden voor nauwkeurige visualisatie van fluorescerend DNA en nauwkeurige analyses van één molecuul. Hier wordt het DNA uitgerekt tot B-vorm en op zijn plaats gehouden onder 0 pN kracht. Om dit te bereiken, moet de focus van de optische valpositie op een positie zijn die 10-20 μm van het onderste coverslipoppervlak ligt (figuur 2D). Er moet voor worden gezorgd dat het DNA-molecuul niet verder wordt uitgerekt dan B-vorm, omdat dit enzymreacties kan remmen. Onder typische bufferomstandigheden is 1 μm = 3.000 bp DNA14. Bovendien wordt het DNA-complex, door 10-20 μm van de coverslip te vangen, ver van het oppervlak geplaatst, waardoor oppervlakte-interacties worden geminimaliseerd.
Veel methoden zijn gebruikt om microfluïdische apparaatkanalen te creëren en deze kunnen in het laboratorium worden gedaan of stroomcellen kunnen worden gekocht bij commerciële bronnen 6,15,16,17. De optimale materialen die worden gebruikt om de stromingscellen te construeren, moeten mechanisch stijf, optisch transparant met een lage fluorescentie en ongevoelig voor organische oplosmiddelenzijn 6. Vaak worden borosilicaat floatglas of gesmolten silica gebruikt om gedurende langere tijd een stabiele stroomomgeving te bieden die geschikt is voor optische vangmethoden, visualisatie en krachtdetectie. Deze materialen maken ook het gebruik van niet-waterige oplosmiddelen (bijv. methanol van spectrofotometrische kwaliteit) mogelijk om oppervlaktebevochtiging en verwijdering van luchtbellen te vereenvoudigen, en denaturanten (bijv. 6M guanidiniumhydrochloride) of detergentia om de stroomcel te reinigen. Ten slotte variëren de methoden die worden gebruikt om vloeistoffen in stroomcellen te introduceren van complexe vacuümpompsystemen tot pompen met één spuit 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. In de hier beschreven aanpak wordt een spuitpomp gebruikt die plaats biedt aan maximaal 10 spuiten (figuur 3A). Dit biedt flexibiliteit om eenkanaalsstroomcellen of stroomcellen met meerdere inlaatkanalen te gebruiken. Hier wordt een driekanaals flowcel gebruikt en gekoppeld aan spuiten die op hun plaats worden gehouden op de spuitpomp met behulp van poly-ether-ether-keton (PEEK) -slang (figuur 3A-C). De vloeistofstroom wordt geregeld door vierweg schakelkleppen en dient zo om de introductie van bellen in de stroomcel te minimaliseren (figuur 3A, D). Bovendien worden Hamilton gastdichte spuiten met stijve glazen wanden en polytetrafluorethyleen (PTFE)-gecoate plunjers aanbevolen omdat ze een uitzonderlijk soepele zuigerbeweging bieden die essentieel is voor het verkrijgen van een soepele stroom14,27.
In het beschreven experimentele systeem zijn flowcellen met twee tot vijf inlaatkanalen gebruikt. Het aantal inlaatkanalen wordt bepaald door het experiment dat wordt uitgevoerd. Voor het onderzoek van RecBCD en Hop2-Mnd1 waren twee stroomkanalen voldoende14,28. Voor de helicase werd het enzym gebonden aan het vrije uiteinde van het DNA en vertaald in een stroom met magnesium en ATP om translocatie en afwikkeling te initiëren. Voor Hop2-Mnd1 werd optisch gevangen DNA vertaald in de aangrenzende vloeistofstroom met eiwitten en buffer ± tweewaardige metaalionen. Het gebruik van driekanaals flowcellen stelt iemand in staat om DNA in stroom 1 te vangen, het DNA te vertalen naar stroom 2 om eiwitbinding mogelijk te maken en vervolgens 3 te streamen waar ATP aanwezig is, bijvoorbeeld om reacties te initiëren. Een variatie op het bovenstaande is om fluorescerend getagd eiwit in kanaal 2 te gebruiken, wat resulteert in een volledig witte vloeistofstroom en visualisatie van het DNA uitsluit. Wanneer dit molecuul wordt vertaald in stroom 3, zijn zowel eiwitten als DNA nu zichtbaar wanneer reacties worden geïnitieerd.
Het gebruik van vierweg schakelkleppen om de vloeistofstroom te regelen is een cruciaal onderdeel van het systeem om bellen in de stroomcellen te elimineren. Bellen zijn schadelijk voor een stabiele vloeistofstroom omdat ze samentrekken en op onvoorspelbare manieren uitzetten, wat resulteert in snelle veranderingen in stroomsnelheid en de introductie van turbulentie. Wanneer de kleppen tussen spuiten en inlaatslangen zijn geplaatst, wordt het stroompad losgekoppeld door de kleppositie te wijzigen wanneer spuiten worden vervangen. Wanneer de nieuwe spuit op zijn plaats wordt gezet, kan de zuiger handmatig worden ingedrukt, zodat >6 μL wordt uitgeworpen (het dode volume van de klep) en dit elimineert bijna volledig bubbels.
De bevestiging van connectoren aan stroomcellen is vaak de snelheidsbeperkende stap in het gebruik van stroomcellen. We beschrijven het gebruik van twee soorten connectoren: verwijderbaar bekend als press-fit en permanente connectoren (nanopoortassemblages). De verwijderbare connectoren zijn eenvoudig te hechten aan een flowcel en verschillende soorten flexibele buizen naast de aanbevolen PTFE kunnen met deze connectoren worden getest. Dit is een snelle en kosteneffectieve manier om slangen en connectoren te testen zonder duurdere glazen stromingscellen op te offeren. Nanopoortassemblages daarentegen worden permanent bevestigd, zijn bestand tegen drukken tot 1.000 psi en in onze handen is het gebruik ervan beperkt tot PEEK-buizen van verschillende diameters. Dit is geen nadeel aangezien peek buizen bij voorkeur worden gebruikt. Een enkele glazen flowcel met permanente assemblages kan bij zorgvuldig gebruik meer dan 1 jaar worden hergebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laserval uitlijning en testen met polystyreen kralen
OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 1A,B.
LET OP: De experimentalist moet geschikte beschermende brillen of laserveiligheidsbrillen dragen tijdens het uitlijnen van laserstralen. Aangezien het hierin beschreven optische pincetsysteem zowel HeNe- als IR-stralen gebruikt, zijn twee afzonderlijke sets laserveiligheidsglaswerk vereist.
- HeNe Beam uitlijning
- Plaats alle optische componenten op het breadboard. Lijn het breadboard zo uit dat het zo dicht mogelijk bij een hoek van 90° ligt ten opzichte van de microscoop.
- Bevestig de paringsbuis met daarin de objectief- en telanlens aan de microscoop (figuur 1A-11,12).
OPMERKING: De telanlens is een lenssysteem dat wordt gebruikt om het beeld scherp te stellen op het tussenliggende beeldvlak in de oculairs. - Schakel de HeNe-laser in en open de sluiter (figuur 1A-18). De bundel moet het filter raken (figuur 1A-3) op een hoogte van 54 mm die 50% van het licht reflecteert op spiegel 5 (figuur 1A-5). De overige 50% van de bundel raakt spiegel 4 (figuur 1A-4) op dezelfde hoogte als spiegel 3.
- Stel spiegel 4 (figuur 1A-4) zo in dat de bundel spiegel 6 (figuur 1A-6) op een hoogte van 51 mm raakt.
- Stel spiegel 6 (figuur 1A-6) zo in dat de bundel op een hoogte van 51 mm naar de onderste galvanische spiegel wordt gericht. De balk die uit de bovenste Galvanische spiegel komt, komt op 57,5 mm.
- Stel spiegel 3 (figuur 1A-3) zo in dat deze bundel spiegel 5 (figuur 1A-5) op een hoogte van 57,5 mm raakt. Eenmaal gereflecteerd door spiegel 5, moet de straal spiegel 9 (figuur 1A-9) op dezelfde hoogte raken. De bundel wordt effectief gerecombineerd bij spiegel 9, gaat door het objectief en het telan-lenssysteem naar spiegel 21 (figuur 1A-21), die het in het objectief reflecteert.
- Plaats een schone microscoopglaasje op het podium van de microscoop. Schakel de camera in en beeld de bundels van de vaste en scanstralen afzonderlijk op het scherm. Begin met spiegel 3, dan 5 en 9, ten slotte 21, voer kleine aanpassingen uit om de vaste straal in het midden van het scherm te plaatsen.
- Om ervoor te zorgen dat de hoek van de straal uit de spiegel 21 90° is, wijzigt u de Z-hoogte van de microscoop en plaatst u de afgebeelde bundel op de bovenste en onderste oppervlakken van de dia. Wanneer ze identiek zijn, bevindt de bundel zich in de juiste positie, die loodrecht op het podium staat. Sluit deze bundel met sluiter 19 (figuur 1A-19).
- Begin met spiegels 4 en 6 en voer kleine aanpassingen uit om de vaste straal in het midden van het scherm te plaatsen. Sluit deze balk.
- Infrarood (IR) Beam uitlijning
LET OP: Voer alle stappen uit bij een laag laservermogen om veiligheidsredenen.- Stel golfplaat 14 (figuur 1A-14) in om de verhouding aan te passen van de verzonden en gereflecteerde bundels die worden gesplitst bij de bundelsplitser 2 (figuur 1A-2). Beam splitter 2 reflecteert de s-component van de laserstraal en zendt de p-component uit.
- De straal die door 2 gaat, raakt spiegel 7 (figuur 1A-7), die de straal afbuigt naar de onderste galvanische spiegel. Het moet het pad van de HeNe-straal volgen op spiegel 21. Voer kleine bewegingen van spiegel 7 uit om deze positionering te bereiken.
- Stel spiegel 2 zo in dat de straal die wordt gereflecteerd door spiegel 2, spiegel 10 (figuur 1A-10) raakt op een hoogte van 57,5 mm.
- De bundel wordt gereflecteerd van spiegel 10 naar spiegel 8 (figuur 1A-8) op een hoogte van 57,5 mm. De volgende balk moet spiegel 9 op dezelfde hoogte raken. Zo niet, maak dan kleine aanpassingen aan spiegels 10 en 8 als dat nodig is.
- Verwijder het objectief en plaats de kop van de vermogensmeter over de poort in de objectiefkoepel.
- Gebruik platen 14, 15 en 16 (figuur 1A-14,15,16) om het vermogen van elke laserstraal aan te passen zodat ze gelijk zijn aan zoals weergegeven in figuur 1C.
- Zet beam expander 1 (Figuur 1A-1) op zijn plaats. Pas de uitgebreide laserstraal aan om cirkelvormig te zijn zonder coma of astigmatisme.
- Om de optische vallen te testen, maakt u een oplossing van 1 μm polystyreenparels gesuspendeerd in water. Leg vervolgens 10 μL van deze oplossing op een microscoopglaasje, leg er een deklip op en sluit af met nagellak. Plaats de dia op het microscoopstadium en test de optische vallen door deze kralen van 1 μm te vangen. Zorg ervoor dat de kralen in de vallen worden gezogen en stabiel worden vastgehouden wanneer het podium wordt verplaatst. Het vangen moet van alle kanten van de val even efficiënt plaatsvinden.
2. Microfluïdische kamervoorbereiding
- Als de stroomcel een commercieel geconstrueerd apparaat is dat is gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) op een coverslip, gaat u verder met stap 3. Als het een glazen apparaat is waaraan connectoren zijn bevestigd, gaat u verder met stap 4.
- Als de stroomcel geen connectoren heeft bevestigd, bevestigt u deze eerst aan de ingangsgaten op de microscoopglaasje. Zie stap 3 voor de stappen om connectoren te bevestigen.
3. Stroomcelverbindingen met behulp van een PDMS-stroomcel
OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 2D.
- Plaats de flowcel op een schoon vlak oppervlak. Houd de PTFE-buis 3 mm van het vrije uiteinde met een tang. Duw de buis in de voorgevormde poort (de poort kan 2 bar lijndruk ondersteunen).
- Herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten. Sluit de inlaatpoorten aan op de spuitpomp en de uitlaat op een afvalfles (figuur 4A,B).
- Vul elke glazen spuit met 1 ml spectrofotometrische methanol. Bevestig elke spuit aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat op afval is gericht op de klep en spoel elke lijn met 50 μL methanol (figuur 4C, gesloten positie).
- Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel (figuur 4C, open positie). Pomp 800 μL methanol door de stroomcel met een debiet van 100 μL/h om de oppervlakken nat te maken en bellen te elimineren.
- Herhaal dit proces de volgende dag met 800 μL ultrapuur water. De flowcel is nu klaar voor gebruik.
4. Bevestiging van persfitbuisconnectoren
OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 2F.
- Als u buisconnectoren voor persfitting wilt gebruiken, verwijdert u de plakband voorzichtig van één kant van de connector en plaatst u deze over het gat in de microscoopglaas. Druk een paar seconden naar beneden. Herhaal het proces voor de resterende connectoren.
- Plaats de flowcel op een schoon vlak oppervlak. Houd de PTFE-buis 3 mm van het vrije uiteinde met een tang. Duw de buis in het voorgevormde gat in de poort en herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten.
- Bevestig slangen van de inlaten aan de schakelkleppen. Ga verder met stap 7.
5. Bevestiging van permanente assemblages
OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 2A-C.
- Voer de bevestiging uit op een schoon, vlak oppervlak of op een op maat gemaakt spruitstuk om de stroomcel en connectoren op hun plaats te houden terwijl het verlijmen plaatsvindt.
- Plaats de flowcel op een schoon vlak oppervlak of in het verzonken gedeelte van het spruitstuk (figuur 2B). Plaats een kleine hoeveelheid glaslijm op de bodem van de assemblage en plaats de afdichting.
- Plaats de nanopoort boven een van de ingangsgaten op de microscoopglaasjes. Duw zachtjes naar beneden en houd op zijn plaats zonder zijdelingse beweging. Herhaal het proces voor de resterende poorten.
- Laat drogen of klem op zijn plaats in het spruitstuk. Verwijder de stroomcel voorzichtig uit het spruitstuk en zorg ervoor dat de assemblages goed zijn uitgelijnd met de ingangspoorten in de stroomcel. Ga verder met stap 7 wanneer u klaar bent.
6. Flow cel verbindingen en voorbereiding
OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 4A,B.
- Plaats een stroomcel op het microscoopstadium. Bevestig de slang met behulp van de vingervaste connectoren.
- Vul elke glazen spuit met 1 ml spectrofotometrische methanol. Bevestig elke spuit aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat op afval is gericht op de klep en spoel elke lijn met 50 μL methanol (figuur 4C, gesloten positie).
- Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel (figuur 4C, open positie). Pomp 800 μL methanol door de stroomcel met een debiet van 100 μL/h om de oppervlakken nat te maken en bellen te elimineren.
- Herhaal dit proces de volgende dag met 800 μL ultrapuur water. De flowcel is nu klaar voor gebruik.
7. Controle van de vloeistofstroom
- Draai de schakelkleppen in de gesloten stand (figuur 4C). Verwijder de spuiten, gooi het resterende water weg en vul de spuiten met experimentele oplossingen, bijvoorbeeld DNA-kralen; enzym; en ATP. Breng spuiten terug naar de pomp en sluit ze aan op de schakelkleppen.
- Dwing in deze positie de plunjers handmatig 5-10 μL naar beneden om eventuele bellen te verwijderen. Wijzig de positie van de schakelklep in Open.
- Gebruik het debietschema om een vloeistofstroomsnelheid te bereiken die optimaal is voor overvullen en visualiseren, zoals beschreven in tabel 1. De optimale vloeistofstroom voor optische vangwerking moet stabiele vangst van kralen mogelijk maken en zodra het DNA is uitgerekt, moet het B-vorm zijn (~ 3.000 bp / μm).
8. Vangen van polystyreenparels met enkele DNA-moleculen eraan vast
- Zoek bij 10x vergroting de grens tussen vloeistofstromen dicht bij de toegangspunten van het kanaal. Voeg olie toe aan het 100x-objectief en schakel over naar de hogere vergroting.
- Open de luiken voor de optische vallen (beide of één voor één). De gefocusseerde laserstralen moeten kralen vangen en DNA moet zich onmiddellijk uitstrekken.
- Zodra een complex is gevangen, vertaalt u het stadium loodrecht op de stroom (figuur 3A, C, inzet). Hierdoor wordt het gevangen complex verplaatst van de DNA-kraaloplossing naar stroom 2. Verdere vertaling zal het complex verplaatsen naar stream 3.
9. Flow cel reiniging
OPMERKING: Voer dit dagelijks uit.
- Schakel de pomp uit wanneer het experiment is voltooid. Draai de schakelkleppen in de gesloten stand (figuur 4C).
- Verwijder spuiten en leeg ze. Spoel drie keer met gefilterd gedestilleerd water.
- Vul de spuiten met een reinigingsoplossing. Plaats spuiten in de pomp en sluit deze aan op schakelkleppen.
- Spoel schakelkleppen en verander de positie om te openen. Pomp 800 μL reinigingsoplossing bij een debiet van 100 μL/h, doorgaans 's nachts.
- Sluit de volgende dag de schakelkleppen en verwijder en spoel spuiten vervolgens met water. Spoel de stroomcel en leidingen met 4-800 μL water bij een debiet van 400-800 μL/h. Als een inspannender reiniging van de stromingscellen nodig is, vervangt u de reinigingsoplossing door 6 M guanidiumhydrochloride.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste tests van de uitlijning en sterkte van de val worden uitgevoerd met 1 μm, niet-fluorescerende polystyreenparels. Omdat het grootste deel van het onderzoek dat in het laboratorium wordt gedaan fluorescentie gebruikt, testen we de valsterkte verder met behulp van 1 μm, Dragon groene polystyreen kralen (figuur 1D, E). Daarna verandert het werk in optische vangst van DNA-kraalcomplexen waarbij het DNA wordt gekleurd met de bis-intercalerende kleurstof YOYO-114,29. Wanneer deze complexen 10-15 μm boven het coverslipoppervlak in een microfluïdische stromingscel worden gevangen, strekt de vloeistofstroom langs de kraal het DNA uit (figuren 3B, C). Het is belangrijk om de lengte van het vloeistof uitgerekte DNA te meten om ervoor te zorgen dat het wordt uitgerekt tot de B-vormlengte, wat de verwachte lengte is. Voor bacteriofaag lambda-DNA is de volledige lengte bijvoorbeeld iets langer dan 16 μm, wat overeenkomt met 48.504 bp14.
Om de vloeistofstroom te karakteriseren, werden fluorescerende kralen in stromingscellen gebracht met een focushoogte van 15 μm boven het coverslipoppervlak met behulp van verschillende pompsnelheden en in oplossingen met verschillende viscositeit. Films van de kraalpositie werden vastgelegd en de kraalpositie werd gevolgd met behulp van beeldanalysesoftware. De resultaten tonen aan dat voor kralen met een diameter van 1 μm de lineaire snelheid nauwkeurig kan worden gevolgd bij een pompdebiet van 100 μL/h in sucroseoplossingen variërend van 10% -50% (figuur 5A). Onder vergelijkbare omstandigheden kan de kracht op de kraal worden berekend en gevonden van 10 tot 400 pN, afhankelijk van het pompdebiet en de viscositeit van de oplossing (figuur 5B). Ten slotte werd het effect van de kraaldiameter variërend van 120 tot 970 nm op kracht geëvalueerd in verschillende concentraties sucrose. Uit de gegevens blijkt dat krachten variërend van 1-27 pN kunnen worden gemeten door kralen van verschillende diameter aan een motoreiwit te bevestigen en de motor te vragen die kraal tegen de vloeistofstroom in te trekken (figuur 5C).
Figuur 1: Optische lay-out en demonstratie van vangactiviteit. (A) Schema van de optische lay-out met de IR-bundel in rood en HeNe-straal in zwart. (B) Foto van optische componenten gemonteerd op een breadboard. De componentnummers in de panelen A en B zijn als volgt: 1), Beam expander; 2), Interferentiespiegel (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), Interferentiespiegels (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), Interferentiespiegels (Rmax = 633 nm); 7), Interferentiespiegel (Rmax = 1064 nm; Tmax= 633 nm); 8), Interferentiespiegel (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), Interferentiespiegel (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), Interferentiespiegel (Rmax = 1064 nm); 11), Objectieflens, f = 110 nm; 12), Telan lens; 13), Galvanische spiegels; 14-16), Rotatoren (/2); 17), IR-scankanaalsluiter; 18), zichtbare kanaal sluiter; 19), IR vaste kanaal sluiter; 20), Beam stops en 21), Interferentiespiegel (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Meting van het uitgangsvermogen. Het uitgangsvermogen van de laser wordt gemeten voordat de laserkop in de optische lay-out wordt geïnstalleerd. Zodra de valuitlijning is voltooid, wordt het straalvermogen gemeten na het 100x-doel voor elke val. (D) en (E) Afbeeldingen die stabiele, optische vangwerking van fluorescerende kralen van 1 μm aantonen. F, fixed trap en M, mobiele val met de mobiele val in scanmodus die door een kleine (D) of grote (E) cirkel op 30 mHz beweegt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microfluïdische stromingscellen. (A) Montage van een driekanaals stromingscel gemaakt van borosilicaatglas. (B) Een spruitstuk om stromingscellen stabiel te positioneren tijdens connectorbinding. Boven, de basis van het aluminium spruitstuk met een verzonken gedeelte van 1 mm om de stroomcel zijdelings te positioneren. De vier palen (één in elke hoek) leiden het deksel van het spruitstuk in positie, terwijl de meer centraal geplaatste bouten met schroefdraad worden gebruikt om het deksel op zijn plaats te klemmen. Bodem, spruitstukdeksel met geboorde gaten om overeen te komen met de palen en bouten op de spruitstukbasis. (1), moeren die aan de basisbouten van het spruitstuk worden bevestigd; (2) veren die tussen de moeren en het spruitstukdeksel worden geplaatst om lichte spanning te leveren tijdens het hechtingsproces. (C) Een close-up van de convergentie van de inlaatkanalen in een gemeenschappelijke enkele vloeistofstroom in een glazen stroomcel met reeds bevestigde connectoren. Een kwart wordt als referentie naast de stroomcel geplaatst. (D) Een afbeelding van de PDMS-stroomcel. De PDMS-lagen zijn 3 mm dik. (E) Een gesmolten silicastroomcel met luerconnectoren. (F) Een stromingscel van borosilicaatglas met press-fit connectoren op zijn plaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vloeistofstroomkarakteristieken door een glazen stromingscel. (A) De vloeistofstroom in de stroomcel is laminair. Het schema toont de stroomcel van bovenaf om aan te tonen dat interkanaaldiffusie de belangrijkste bron is van vermenging tussen aangrenzende vloeistofstromen. De stroomrichting wordt aangegeven met blauwe pijlen en de afzonderlijke stromen zijn wit, lichtgrijs en wit gekleurd. De verbredingsgebieden van transversale diffusie tussen kanalen worden rood aangegeven. De inzet toont een fluorescentiebeeld van aangrenzende vloeistofstromen bij 10x vergroting met fluorescerend gelabelde DNA-kraalcomplexen in de onderste stroom en buffer alleen in de bovenste stroom. De witte vlekken in de bovenste stroom zijn geschoten ruis van de CCD-camera. (B) Het stromingsprofiel (lichtpaars) in laminaire stromingscellen is parabolisch. De stroomcel wordt vanaf de zijkant bekeken en de richting van de stroom wordt boven elke cel aangegeven. De snelste vloeistofsnelheden vinden plaats in de stroomcel in het midden, terwijl de langzaamste vloeistofsnelheden naast de stroomceloppervlakken plaatsvinden. Bijgevolg rekt de vloeistofstroom voor een optisch gevangen DNA-kraalcomplex in het midden van de stroomcel het bacteriofaag λ DNA-molecuul (48.504 bp) uit tot 16 μm (B-vorm) zodat een duidelijke visualisatie kan worden gemaakt (linker afbeelding). Daarentegen ervaart hetzelfde molecuul dat zich in de buurt van het oppervlak van de stroomcel bevindt lage stroomsnelheden en kan het niet worden uitgerekt. (C) Een enkel DNA-kralencomplex bevindt zich in een stroomcel. Verschillende dieptestroomcellen kunnen worden gebruikt, maar in elk geval kunnen de bundeluitlijningen zo worden ingesteld dat optimale vangst plaatsvindt 10-20 μm boven het coverslipoppervlak, wat oppervlakte-effecten elimineert en een stabiele stroom heeft, zodat DNA-moleculen kunnen worden uitgerekt tot B-vorm. Zoals aangegeven in de linker afbeelding in (C), wordt het DNA uitgerekt om een duidelijke visualisatie mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Stromings- en reactiecontrole van optisch gevangen DNA in een stroomcel in de microscoopfase. (A) Paring van de stroomcel met een spuitpomp. Een foto van een driekanaals flowcel verbonden met een spuitpomp via drieweg schakelkleppen wordt gepresenteerd. De stroomcel wordt op zijn plaats gehouden op een gemotoriseerd podium in een omgekeerde microscoop. De stroomcel is verbonden met een afvalleiding (links) en schakelkleppen (onderbroken cyaancirkel) via oranje buizen van 500 μm (aangegeven met groene tape). De kleppen zijn stabiel gemonteerd op een op maat gemaakt spruitstuk aangepast aan het spuitpompapparaat, dat 1 ml gasdichte spuiten herbergt (gele pijlen bakenen plunjers af). De afvalleidingen worden gebruikt om luchtbellen te verwijderen die tijdens het wisselen van de spuit in de schakelklep kunnen worden opgesloten. (B) Close-up weergave van de driekanaals flowcel. Om de visualisatie van vloeistofstromen te vergemakkelijken, zijn de buitenste gekleurd met voedselkleuring met de centrale stroom die alleen water bevat. Het ingezoomde gebied geeft aan hoe een optisch gevangen kraal-DNA-molecuulcomplex van de ene vloeistofstroom naar de volgende (blauwe pijl) wordt vertaald door het stadium loodrecht op de stroom te vertalen (zwarte pijl). (C) Schema's van de drieweg schakelkleppen die hun operationele posities aangeven. De letteraanduidingen F, S en W komen overeen met de richtingsvloeistof en kunnen respectievelijk naar de stroomcel, spuit en afval stromen. Eén poort is permanent gesloten zoals aangegeven door de zwarte stekker aan de bovenkant van elk schema. In de open of operationele positie (linkerpaneel) gaat de vloeistofstroom rechtstreeks door de schakelklep van de spuit (S) naar de stroomcel (F). In de gesloten positie (rechterpaneel) wordt de draaiknop zo gedraaid dat de stroomcel is afgesloten van de omgeving. In deze positie wordt de stroom naar afval geleid en kunnen spuiten worden uitgeschakeld zonder luchtbellen in de stroomcel te brengen. Omdat de kleppen een dood volume van 6 μL hebben, wordt er zeer weinig oplossing verspild bij het zuiveren van leidingen voordat ze terugkeren naar de Open-configuratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kraalbeweging en tegengestelde kracht worden beïnvloed door vloeistofstroming. (A) Lineaire kraalsnelheid wordt beïnvloed door pompsnelheid en sucroseconcentratie. (B) De tegengestelde kracht op een kraal wordt beïnvloed door de viscositeit van de oplossing. (C) De diameter van de kraal beïnvloedt de kracht op kralen onder stroming. In alle experimenten werden fluorescerende kralen gebruikt (Dragon green). In (A) en (B) werden kralen met een diameter van 0,97 μm gebruikt en in (C) werden kralen met een verschillende diameter gebruikt. Sucrose-oplossingen werden gemaakt in ultrapuur water, gefilterd door 0,2 μm filters en brekingsindex gemeten met behulp van een handheld refractometer, met viscositeit bepaald in duizendpoot met behulp van ISCO-tabellen en uiteindelijk omgezet in SI-eenheden in mPa.s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Debiet (μL/h)b | Tijd per stap (min) | Volume afgegeven (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 of meer | 1 of meer |
| een. Dit zijn vloeistofdebieten berekend door de spuitpompsoftware en zijn uniek voor elke gebruikte spuitdiameter. De stroomsnelheden maken een snelle vulling van de lijnen en de stroomkamer (800 μl/uur) mogelijk, gevolgd door een geleidelijke afname tot het ideale debiet voor het vangen en visualiseren | ||
| b. De spuitpomp kan worden bediend vanaf het toetsenbord of met behulp van software die door de leverancier wordt geleverd. | ||
Tabel 1: Vloeistofdebieten om bellen te minimaliseren en stabiele vangwaarden te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zorgvuldige assemblage van het stroomsysteem is van cruciaal belang voor het succesvolle resultaat van experimenten 4,6. Een van de meest uitdagende aspecten van het protocol is de bevestiging van connectoren aan het glasoppervlak. Hiervoor gebruiken we de volgende twee benaderingen: press-fit tubing connectoren en nanoport assemblies. Press-fit connectoren hechten zich gemakkelijk aan glas, gevolgd door het duwen van PTFE-buizen in de voorgevormde gaten met behulp van een tang. Wanneer een stabielere bevestiging vereist is, heeft de verlijming van nanopoortassemblages de voorkeur. Bij zorgvuldig gebruik en reiniging kan een enkele glazen flowcel met permanente assemblages meer dan 1 jaar worden gebruikt. Als flowcellen vaker moeten worden uitgeschakeld, kunnen PDMS-flowcellen worden gebruikt omdat ze een uitstekend en goedkoper alternatief zijn. Ze kunnen worden hergebruikt, maar PDMS is gevoelig voor zwelling, wat het gedrag van de vloeistofstroom in de loop van de tijd kan veranderen.
Zowel glas- als PDMS-flowcellen zijn niet onverwoestbaar. In het laboratorium is het maximale gebruikte debiet 800 μL/h. Als dit dagelijks en/of gedurende langere tijd wordt overschreden, kunnen flow cell warping (glass flow cells) en vervorming van PDMS optreden. Hoewel de initiële bevochtigingsprocedure met methanol en water tijd kost, is het de moeite waard omdat alle bellen worden geëlimineerd en ook lekken bij connectoren kunnen worden gedetecteerd. De hier beschreven stroomcellen bieden flexibiliteit aan de experimenten die worden uitgevoerd. Met behulp van deze benaderingen van verschillende stroomcellen, buizen en bevestiging van verschillende connectoren, kunnen experimentele omstandigheden gemakkelijk worden aangepast en snel worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat optimale gegevens worden verkregen. Y-vormige kanaalstroomcellen worden gepresenteerd, maar een groot aantal microfluïdische apparaatontwerpen is verkrijgbaar bij meerdere bedrijven, zowel zonder als met connectoren bevestigd. Dit biedt de onderzoeker nog meer flexibiliteit in experimenteel ontwerp.
Het gebruik van vierweg schakelkleppen is een eenvoudige en effectieve methode die ervoor zorgt dat zodra het stroomsysteem is geassembleerd en getest, het effectief een gesloten omgeving wordt, waar de vervuiling minimaal is en bellen worden geëlimineerd. Dit laatste is van cruciaal belang omdat bubbels de neiging hebben om willekeurig te comprimeren en te decomprimeren tijdens een experiment en dit verstoort de vloeistofstroom waardoor gevangen DNA-moleculen op onverwachte manieren bewegen en zelfs breken. Er moet grote zorg worden besteed om ervoor te zorgen dat ze zich niet in het systeem kunnen vormen.
Ten slotte is het hier beschreven systeem geoptimaliseerd voor visuele biochemie waarbij zorgvuldige analyse van DNA, kralen gehecht aan eiwitten of fluorescerende eiwitten kan worden uitgevoerd. Hoewel het systeem niet is ontworpen om krachtmetingen uit te voeren met de dubbele vallen en toevoeging van kwadrantfotodetectoren, kunnen krachten worden gemeten door bijvoorbeeld kralen van verschillende diameter aan DNA-motoreiwitten te bevestigen en de motor te vragen deze kraal tegen de vloeistofstroom in te trekken. Door de viscositeit van de oplossing, de vloeistofstroom en de kraaldiameter te variëren, kan een groot aantal tegengestelde krachten worden toegepast om gedetailleerd inzicht te geven in de motoreiwitfunctie (figuur 5). Dit is een eenvoudige en goedkope manier om krachten te meten die verband houden met biologische transacties, maar het mist de precisie die gepaard gaat met meer gevoelige benaderingen. Wanneer de visuele biochemische benadering wordt gecombineerd met detectiemethoden voor gevoelige krachten, kunnen completere beelden van biochemische reacties worden gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Onderzoek in het Bianco-laboratorium wordt ondersteund door NIH-subsidies GM100156 en GM144414 aan P.R.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M.
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
