Summary
Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.
Abstract
Die visuelle Biochemie ist eine leistungsfähige Technik zur Beobachtung der stochastischen Eigenschaften einzelner Enzyme oder Enzymkomplexe, die in der Mittelung in Massenphasenstudien verdeckt werden. Um eine Visualisierung zu erreichen, werden zwei optische Pinzetten, bei denen eine Falle fest und die andere beweglich ist, in einen Kanal einer Multi-Stream-Mikrofluidikkammer fokussiert, die auf dem Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops positioniert ist. Die optische Pinzette fängt einzelne Moleküle fluoreszenzmarkierter DNA ein und Flüssigkeit fließt durch die Kammer und vorbei an den gefangenen Perlen, dehnt die DNA in B-Form (unter minimaler Kraft, dh 0 pN), wobei die Nukleinsäure als weiße Schnur vor einem schwarzen Hintergrund beobachtet wird. DNA-Moleküle werden von einem Strom zum nächsten bewegt, indem die Stufe senkrecht zum Fluss übersetzt wird, um die Einleitung von Reaktionen auf kontrollierte Weise zu ermöglichen. Um erfolgreich zu sein, werden mikrofluidische Geräte mit optisch klaren Kanälen mit Glasspritzen verbunden, die in einer Spritzenpumpe gehalten werden. Optimale Ergebnisse sind fest mit der Durchflusszelle verbundene Steckverbinder, mechanisch steife und chemisch beständige Schläuche, die mit Schaltventilen verbunden sind, die Blasen eliminieren, die eine laminare Strömung verhindern.
Introduction
Die Fähigkeit, Protein-DNA-Interaktionen auf Einzelmolekülebene und in Echtzeit zu visualisieren, hat einen signifikanten Einblick in die Genomstabilität geliefert 1,2. Zusätzlich zur Arbeit mit einzelnen DNA-Molekülen bietet die Möglichkeit, Transaktionen zwischen einzelnen Molekülen in der Nähe anzuzeigen, zusätzliche Einblicke 3,4,5. Die Manipulation zusätzlicher DNA-Moleküle erfordert sowohl zusätzliche optische Fallen als auch hochwertige, mehrkanalige, mikrofluidische Flusszellen6.
Es gibt mehrere Methoden, um mehr als eine optische Falle zu erzeugen. Dazu gehören Galvanometer-Scanning-Spiegel, akustische optische Modulatoren und diffraktive Optiken, die holographische optische Pinzetten 4,7,8,9 erzeugen. Oft erzeugen scannende Spiegel und akustische optische Modulatoren Fallen, die Timesharing ermöglichen. In dem hier beschriebenen Aufbau wird der Strahl eines einzelnen Nd:YAG-Lasers auf Polarisation aufgeteilt, und dann steuern Galvanometer-Laserscanning-Spiegel die Position der sogenannten mobilen Falle (Abbildung 1)4. Um die Positionierung von Spiegeln und Filtern zu erleichtern, um den Einfangstrahl auf die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs zu lenken, wird ein HeNe-Laser verwendet. Dies erleichtert die Gesamtausrichtung, da der HeNe-Strahl mit bloßem Auge sichtbar ist, Infrarotstrahlen hingegen nicht. Der HeNe-Strahl ist auch sicherer zu arbeiten, wodurch die Positionierung von Spiegeln und anderen Komponenten weniger belastend wird. Zunächst ist der Strahlengang für diesen Laser vom 1064-nm-Strahl getrennt, wird aber in denselben Strahlengang und dann in das Mikroskopobjektiv eingeführt. Sobald die physikalische Ausrichtung erreicht ist, wird der 1064-nm-Strahl auf dem HeNe-Strahl positioniert, was durch die Verwendung eines Infrarot-Viewers und verschiedener Strahlbildgebungswerkzeuge zur Visualisierung der Strahlposition und -qualität erleichtert wird. Dann wird der Strahlexpander eingeführt und der resultierende erweiterte Infrarotstrahl wird auf die hintere Öffnung des Objektivs ausgerichtet. Schließlich wird das Objektiv entfernt und die Leistung in jedem polarisierten Strahl wird gemessen und unter Verwendung von λ/2-Wellenplatten so eingestellt, dass sie gleich ist (Abbildung 1C). Leistungsmessungen werden auch durchgeführt, sobald das Objektiv zurückgegeben wird, und in der Regel gibt es einen Leistungsverlust von 53%. Es ist jedoch genügend Energie vorhanden, um stabile feste und bewegliche optische Fallen in der Brennebene zu bilden (Abbildung 1D).
Für die Abbildung von DNA-Transaktionen spielen mikrofluidische Flusszellen eine Schlüsselrolle, da sie kontrollierte Messungen auf Einzelmolekülebene mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen (Abbildung 2). Der Begriff Mikrofluidik bezieht sich auf die Fähigkeit, Flüssigkeiten in einem oder mehreren Kanälen mit Abmessungen von 5-500 μm10,11 zu manipulieren. Der Begriff Strom bezieht sich auf die tatsächliche Flüssigkeit innerhalb eines Kanals und der Kanal bezieht sich auf den physikalischen Kanal, in dem sich ein oder mehrere Flüssigkeitsströme bewegen. Einkanal-Durchflusszellendesign hat einen gemeinsamen, physikalischen Kanal, in dem Reaktionen beobachtet werden und typischerweise nur ein Flüssigkeitsstrom vorhanden ist. Daher werden diese Designs als Single-Stream-Durchflusszellen bezeichnet. Im Gegensatz dazu sind Multi-Stream-Durchflusszellen als mikrofluidische Vorrichtung definiert, bei der zwei oder mehr Eintrittskanäle zu einem einzigen, gemeinsamen, physikalischen Kanal konvergieren (Abbildung 2A). Innerhalb des gemeinsamen Kanals fließen die aus den einzelnen Kanälen stammenden Flüssigkeitsströme parallel zueinander und bleiben getrennt, wobei aufgrund der Diffusion nur eine minimale Durchmischung zwischen ihnen auftritt (Abbildung 2B). In den meisten Versuchsaufbauten drückt eine einzige Pumpe Flüssigkeiten mit der gleichen Geschwindigkeit in jeden Kanal. Im Gegensatz dazu drücken bei der Grenzlenkung drei oder mehr unabhängig voneinander gesteuerte Pumpen Flüssigkeiten durch die Kanäle. Jede Pumpe arbeitet jedoch mit einer anderen Drehzahl, aber der Nettodurchfluss im gemeinsamen Kanal ist konstant12. Dies ermöglicht den schnellen Austausch von Hauptkanalkomponenten durch einfache Änderung der Pumpendrehzahl.
Neben der laminaren Strömung ist ein weiterer kritischer Faktor das parabolische Geschwindigkeitsprofil innerhalb des laminaren Strömungsstroms. Die höchste Strömungsgeschwindigkeit tritt in der Mitte des Stroms auf, die langsamste in der Nähe der Oberflächen (Abbildung 2C)13. Dieses Profil muss berücksichtigt werden, um ein DNA-Molekül, das an eine im Strom gehaltene Perle gebunden ist, vollständig zu dehnen, um fluoreszierende DNA präzise zu visualisieren und genaue Einzelmolekülanalysen durchzuführen. Hier wird die DNA zur B-Form gestreckt und unter 0 pN Kraft an Ort und Stelle gehalten. Um dies zu erreichen, sollte die Fokussierung der optischen Fallenposition auf eine Position 10-20 μm von der unteren Deckglasoberfläche erfolgen (Abbildung 2D). Es muss darauf geachtet werden, dass das DNA-Molekül nicht über die B-Form hinaus gestreckt wird, da dies Enzymreaktionen hemmen kann. Unter typischen Pufferbedingungen ist 1 μm = 3.000 bp DNA14. Darüber hinaus wird der DNA-Komplex durch das Einfangen von 10-20 μm vom Deckglas weit von der Oberfläche entfernt, wodurch Oberflächeninteraktionen minimiert werden.
Viele Methoden wurden verwendet, um mikrofluidische Gerätekanäle zu erzeugen, und diese können im Labor durchgeführt werden oder Durchflusszellen können aus kommerziellen Quellen gekauft werden 6,15,16,17. Die optimalen Materialien, die für die Konstruktion der Durchflusszellen verwendet werden, müssen mechanisch steif, optisch transparent mit geringer Fluoreszenz und undurchlässig für organische Lösungsmittel sein6. Häufig wird Borosilikat-Floatglas oder Quarzglas verwendet, um eine stabile Strömungsumgebung für eine längere Zeit bereitzustellen, die für optisches Einfangen, Visualisierung und Krafterkennung geeignet ist. Diese Materialien ermöglichen auch die Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmitteln (z. B. spektrophotometrisches Methanol), um die Oberflächenbenetzung und Entfernung von Luftblasen zu vereinfachen, und Denaturierungsmitteln (z. B. 6M Guanidiniumhydrochlorid) oder Reinigungsmitteln zur Reinigung der Durchflusszelle. Schließlich variieren die Methoden zum Einbringen von Flüssigkeiten in Durchflusszellen von komplexen Vakuumpumpensystemen bis hin zu einzelnen Spritzenpumpen 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Bei dem hier beschriebenen Ansatz wird eine Spritzenpumpe verwendet, die bis zu 10 Spritzen aufnehmen kann (Abbildung 3A). Dies bietet Flexibilität für den Einsatz von einkanaligen Durchflusszellen oder Durchflusszellen mit mehreren Einlasskanälen. Hier wird eine dreikanalige Durchflusszelle verwendet, die mit Spritzen verbunden ist, die an der Spritzenpumpe mit Polyetherether-Keton-Schläuchen (PEEK) befestigt sind (Abbildung 3A-C). Der Durchfluss von Flüssigkeiten wird durch Vierwegeschaltventile gesteuert und dient somit dazu, das Einbringen von Blasen in die Durchflusszelle zu minimieren (Bild 3A,D). Darüber hinaus werden gasdichte Hamilton-Spritzen mit steifen Glaswänden und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Kolben empfohlen, da sie eine außergewöhnlich gleichmäßige Kolbenbewegung bieten, die für einen reibungslosen Fluss unerlässlich ist14,27.
In dem beschriebenen Versuchssystem wurden Flusszellen mit zwei bis fünf Einlasskanälen eingesetzt. Die Anzahl der Einlasskanäle wird durch das durchgeführte Experiment bestimmt. Für die Untersuchung von RecBCD und Hop2-Mnd1 waren zwei Stromkanäle ausreichend14,28. Für die Helikase wurde das Enzym an das freie Ende der DNA gebunden und in einen Strom mit Magnesium und ATP übersetzt, um die Translokation und den Abbau einzuleiten. Für Hop2-Mnd1 wurde optisch eingeschlossene DNA in den angrenzenden Flüssigkeitsstrom übersetzt, der Proteine und Puffer ± zweiwertigen Metallionen enthält. Die Verwendung von Dreikanal-Flusszellen ermöglicht es, DNA in Strom 1 einzufangen, die DNA in Strom 2 zu übersetzen, um eine Proteinbindung zu ermöglichen, und dann in Strom 3, wo ATP vorhanden ist, um beispielsweise Reaktionen auszulösen. Eine Variation des oben Gesagten besteht darin, fluoreszierendes Protein in Kanal 2 zu verwenden, was dazu führt, dass der Flüssigkeitsstrom vollständig weiß ist und die Visualisierung der DNA ausschließt. Wenn dieses Molekül in Strom 3 übersetzt wird, sind nun sowohl Proteine als auch DNA sichtbar, wenn Reaktionen ausgelöst werden.
Die Verwendung von Vierwege-Schaltventilen zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses ist eine kritische Komponente des Systems, um Blasen in den Durchflusszellen zu eliminieren. Blasen sind schädlich für eine stabile Flüssigkeitsströmung, da sie sich auf unvorhersehbare Weise zusammenziehen und ausdehnen, was zu schnellen Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit und der Einführung von Turbulenzen führt. Wenn die Ventile zwischen Spritzen und Einlassschlauch positioniert sind, wird der Durchflusspfad durch Umschalten der Ventilposition beim Spritzenwechsel getrennt. Wenn die neue Spritze eingesetzt wird, kann der Kolben manuell gedrückt werden, so dass >6 μL (das Totvolumen des Ventils) ausgestoßen werden und Blasen fast vollständig eliminiert werden.
Die Befestigung von Steckverbindern an Durchflusszellen ist häufig der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt bei der Verwendung von Durchflusszellen. Wir beschreiben die Verwendung von zwei Arten von Steckverbindern: abnehmbare sogenannte Press-Fit-Steckverbinder und permanente (Nanoport-Baugruppen). Die abnehmbaren Verbinder lassen sich einfach auf eine Durchflusszelle kleben und mit diesen Steckverbindern können neben dem empfohlenen PTFE auch verschiedene Arten von flexiblen Schläuchen getestet werden. Dies ist eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Schläuche und Steckverbinder zu testen, ohne auf teurere Glasdurchflusszellen verzichten zu müssen. Im Gegensatz dazu sind Nanoport-Baugruppen dauerhaft angebracht, halten Drücken bis zu 1.000 psi stand und in unseren Händen ist ihre Verwendung auf PEEK-Schläuche unterschiedlicher Durchmesser beschränkt. Dies ist kein Nachteil, da vorzugsweise PEEK-Schläuche verwendet werden. Eine einzelne Glasdurchflusszelle mit festen Baugruppen kann bei sorgfältigem Gebrauch länger als 1 Jahr wiederverwendet werden.
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Protocol
1. Laserfallenausrichtung und Prüfung mit Styroporperlen
HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 1A,B.
ACHTUNG: Der Experimentator sollte während der Laserstrahlausrichtung eine geeignete Schutzbrille oder Laserschutzbrille tragen. Da das hierin beschriebene optische Pinzettensystem sowohl HeNe- als auch IR-Strahlen verwendet, sind zwei separate Sätze von Laserschutzgläsern erforderlich.
- HeNe-Strahl-Ausrichtung
- Positionieren Sie alle optischen Komponenten auf dem Steckbrett. Richten Sie das Steckbrett so aus, dass es so nah wie möglich an einem 90°-Winkel relativ zum Mikroskop ist.
- Befestigen Sie das Gegenrohr mit dem Objektiv und der Telanlinse am Mikroskop (Abbildung 1A-11,12).
HINWEIS: Das Telan-Objektiv ist ein Linsensystem, das verwendet wird, um das Bild auf der Zwischenbildebene in den Okularen zu fokussieren. - Schalten Sie den HeNe-Laser ein, und öffnen Sie den Verschluss (Abbildung 1A-18). Der Strahl sollte in einer Höhe von 54 mm auf den Filter (Abbildung 1A-3) treffen und 50 % des Lichts auf Spiegel 5 reflektieren (Abbildung 1A-5). Die restlichen 50 % des Strahls treffen auf Spiegel 4 (Abbildung 1A-4) auf der gleichen Höhe wie Spiegel 3.
- Stellen Sie Spiegel 4 (Abbildung 1A-4) so ein, dass der Strahl in einer Höhe von 51 mm auf Spiegel 6 (Abbildung 1A-6) trifft.
- Stellen Sie Spiegel 6 (Abbildung 1A-6) so ein, dass der Strahl in 51 mm Höhe auf den unteren galvanischen Spiegel gerichtet wird. Der Strahl, der aus dem oberen galvanischen Spiegel austritt, beträgt 57,5 mm.
- Stellen Sie Spiegel 3 (Abbildung 1A-3) so ein, dass dieser Strahl in einer Höhe von 57,5 mm auf Spiegel 5 (Abbildung 1A-5) trifft. Nach der Reflexion von Spiegel 5 sollte der Strahl in gleicher Höhe auf Spiegel 9 (Abbildung 1A-9) treffen. Der Strahl wird effektiv am Spiegel 9 rekombiniert, geht durch das Objektiv und das Telan-Linsensystem auf den Spiegel 21 (Abbildung 1A-21), der ihn in das Objektiv reflektiert.
- Legen Sie einen sauberen Objektträger auf den Tisch des Mikroskops. Schalten Sie die Kamera ein und bilden Sie die Strahlen der festen und scannenden Strahlen einzeln auf dem Bildschirm ab. Beginnend mit Spiegel 3, dann 5 und 9, schließlich 21, führen Sie kleine Anpassungen durch, um den festen Strahl in der Mitte des Bildschirms zu positionieren.
- Um sicherzustellen, dass der Winkel des Strahlaustritts aus dem Spiegel 21 90° beträgt, ändern Sie die Z-Höhe des Mikroskops und positionieren Sie den abgebildeten Strahl auf der Ober- und Unterseite des Objektträgers. Wenn sie identisch sind, befindet sich der Strahl in der richtigen Position, die senkrecht zur Bühne steht. Schließen Sie diesen Strahl mit Verschluss 19 (Abbildung 1A-19).
- Beginnen Sie mit den Spiegeln 4 und 6, führen Sie kleine Anpassungen durch, um den festen Strahl in der Mitte des Bildschirms zu positionieren. Schließen Sie diesen Strahl.
- Infrarot (IR) Strahlausrichtung
ACHTUNG: Führen Sie alle Schritte aus Sicherheitsgründen bei geringer Laserleistung durch.- Stellen Sie die Wellenplatte 14 (Abbildung 1A-14) ein, um das Verhältnis von übertragenen und reflektierten Strahlen einzustellen, die am Strahlteiler 2 aufgeteilt werden (Abbildung 1A-2). Der Strahlteiler 2 reflektiert die s-Komponente des Laserstrahls und überträgt die p-Komponente.
- Der Strahl, der durch 2 hindurchgeht, trifft auf Spiegel 7 (Abbildung 1A-7), der den Strahl auf den unteren galvanischen Spiegel ablenkt. Es sollte dem Weg des HeNe-Strahls auf Spiegel 21 folgen. Führen Sie kleine Bewegungen des Spiegels 7 aus, um diese Positionierung zu erreichen.
- Stellen Sie Spiegel 2 so ein, dass der von Spiegel 2 reflektierte Strahl in einer Höhe von 57,5 mm auf Spiegel 10 trifft (Abbildung 1A-10).
- Der Strahl wird von Spiegel 10 auf Spiegel 8 (Abbildung 1A-8) in einer Höhe von 57,5 mm reflektiert. Der nachfolgende Strahl sollte auf gleicher Höhe auf Spiegel 9 treffen. Wenn nicht, nehmen Sie bei Bedarf kleine Anpassungen an den Spiegeln 10 und 8 vor.
- Entfernen Sie das Objektiv und platzieren Sie den Kopf des Leistungsmessers über dem Port im Objektivturm.
- Verwenden Sie die Platten 14, 15 und 16 (Abbildung 1A-14,15,16), um die Leistung jedes Laserstrahls so einzustellen, dass sie gleich sind, wie in Abbildung 1C gezeigt.
- Setzen Sie den Strahlaufweiter 1 (Abbildung 1A-1) ein. Stellen Sie den expandierten Laserstrahl so ein, dass er kreisförmig ohne Koma oder Astigmatismus ist.
- Um die optischen Fallen zu testen, stellen Sie eine Lösung aus 1 μm Polystyrolperlen her, die in Wasser suspendiert sind. Geben Sie dann 10 μL dieser Lösung auf einen Objektträger, legen Sie ein Deckglas darauf und verschließen Sie es mit Nagellack. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und testen Sie die optischen Fallen, indem Sie diese 1 μm Perlen einfangen. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in die Fallen gesaugt und stabil gehalten werden, wenn die Bühne bewegt wird. Das Fangen sollte von allen Seiten der Falle gleichermaßen effizient erfolgen.
2. Mikrofluidische Kammervorbereitung
- Wenn es sich bei der Durchflusszelle um ein kommerziell hergestelltes Gerät aus Polydimethylsiloxan (PDMS) auf einem Deckglas handelt, fahren Sie mit Schritt 3 fort. Wenn es sich um ein Glasgerät mit angeschlossenen Anschlüssen handelt, fahren Sie mit Schritt 4 fort.
- Wenn an der Durchflusszelle keine Anschlüsse angebracht sind, verkleben Sie diese zuerst mit den Eintrittslöchern am Objektträger. Die Schritte zum Anschließen von Steckverbindern finden Sie in Schritt 3.
3. Flusszellenverbindungen mit einer PDMS-Durchflusszelle
HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 2D.
- Stellen Sie die Durchflusszelle auf eine saubere, ebene Oberfläche. Halten Sie den PTFE-Schlauch mit einer Pinzette 3 mm vom freien Ende entfernt. Schieben Sie den Schlauch in den vorgeformten Anschluss (der Anschluss kann einen Leitungsdruck von 2 bar unterstützen).
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Ports. Schließen Sie die Einlassöffnungen an die Spritzenpumpe und den Auslass an eine Abfallflasche an (Abbildung 4A,B).
- Füllen Sie jede Glasspritze mit 1 ml spektrophotometrischem Methanol. Befestigen Sie jede Spritze an einem Schaltventil. Stellen Sie sicher, dass der Auslass des Ventils auf Abfall gerichtet ist, und spülen Sie jede Leitung mit 50 μl Methanol (Abbildung 4C, geschlossene Position).
- Schalten Sie die Ausgangsposition auf die Durchflusszelle (Abbildung 4C, offene Position). Pumpen Sie 800 μL Methanol mit einer Durchflussrate von 100 μL/h durch die Durchflusszelle, um die Oberflächen zu benetzen und Blasen zu beseitigen.
- Am nächsten Tag wiederholen Sie diesen Vorgang mit 800 μL Reinstwasser. Die Durchflusszelle ist nun einsatzbereit.
4. Befestigung von Einpressschlauchverbindern
HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 2F.
- Wenn Einpressschlauchverbinder verwendet werden sollen, entfernen Sie vorsichtig das Klebeband von einer Seite des Steckers und legen Sie es über das Loch im Objektträger. Drücken Sie einige Sekunden lang nach unten. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Konnektoren.
- Stellen Sie die Durchflusszelle auf eine saubere, ebene Oberfläche. Halten Sie den PTFE-Schlauch mit einer Pinzette 3 mm vom freien Ende entfernt. Schieben Sie den Schlauch in das vorgeformte Loch im Anschluss, und wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Anschlüsse.
- Befestigen Sie die Schläuche von den Einlässen an den Schaltventilen. Fahren Sie mit Schritt 7 fort.
5. Befestigung von ständigen Versammlungen
HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 2A-C.
- Führen Sie die Befestigung entweder auf einer sauberen, ebenen Oberfläche oder auf einem speziell angefertigten Verteiler durch, um die Durchflusszelle und die Anschlüsse während der Verklebung an Ort und Stelle zu halten.
- Stellen Sie die Durchflusszelle auf eine saubere, ebene Fläche oder in den vertieften Bereich des Verteilers (Abbildung 2B). Legen Sie eine kleine Menge Glaskleber auf den Boden der Baugruppe und setzen Sie die Dichtung ein.
- Positionieren Sie den Nanoport über einem der Eintrittslöcher auf dem Objektträger. Drücken Sie vorsichtig nach unten und halten Sie es ohne seitliche Bewegung fest. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Ports.
- Im Krümmer trocknen lassen oder festklemmen. Entfernen Sie die Durchflusszelle vorsichtig aus dem Verteiler und stellen Sie sicher, dass die Baugruppen gut an den Eingangsöffnungen in der Durchflusszelle ausgerichtet sind. Fahren Sie mit Schritt 7 fort, wenn Sie fertig sind.
6. Flusszellenanschlüsse und Aufbereitung
HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 4A,B.
- Legen Sie eine Durchflusszelle auf den Mikroskoptisch. Befestigen Sie den Schlauch mit den fingerfesten Anschlüssen.
- Füllen Sie jede Glasspritze mit 1 ml spektrophotometrischem Methanol. Befestigen Sie jede Spritze an einem Schaltventil. Stellen Sie sicher, dass der Auslass des Ventils auf Abfall gerichtet ist, und spülen Sie jede Leitung mit 50 μl Methanol (Abbildung 4C, geschlossene Position).
- Schalten Sie die Ausgangsposition auf die Durchflusszelle (Abbildung 4C, offene Position). Pumpen Sie 800 μL Methanol mit einer Durchflussrate von 100 μL/h durch die Durchflusszelle, um die Oberflächen zu benetzen und Blasen zu beseitigen.
- Am nächsten Tag wiederholen Sie diesen Vorgang mit 800 μL Reinstwasser. Die Durchflusszelle ist nun einsatzbereit.
7. Steuerung des Flüssigkeitsflusses
- Drehen Sie die Schaltventile in die geschlossene Stellung (Abbildung 4C). Entfernen Sie die Spritzen, entsorgen Sie das Restwasser und füllen Sie die Spritzen mit experimentellen Lösungen, z. B. DNA-Perlen; Enzym; und ATP. Bringen Sie die Spritzen zur Pumpe zurück und schließen Sie sie an die Schaltventile an.
- In dieser Position drücken Sie die Kolben manuell 5-10 μL nach unten, um Blasen zu entfernen. Ändern Sie die Schaltventilstellung auf Offen.
- Verwenden Sie das Durchflussrateschema, um eine optimale Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit für das Abfangen und die Visualisierung zu erreichen, wie in Tabelle 1 beschrieben. Der optimale Flüssigkeitsfluss für das optische Einfangen sollte ein stabiles Einfangen von Perlen ermöglichen und sobald die DNA gedehnt ist, sollte sie B-Form haben (~ 3.000 bp / μm).
8. Einfangen von Polystyrolperlen mit einzelnen DNA-Molekülen
- Lokalisieren Sie bei 10-facher Vergrößerung die Grenze zwischen den Flüssigkeitsströmen in der Nähe der Kanaleintrittspunkte. Öl in das 100-fache Objektiv geben und zur höheren Vergrößerung wechseln.
- Öffnen Sie die Verschlüsse für die optischen Fallen (entweder beide oder eine gleichzeitig). Die fokussierten Laserstrahlen sollten Perlen einfangen und DNA sollte sich sofort ausdehnen.
- Sobald ein Komplex eingeschlossen wurde, übersetzen Sie die Stufe senkrecht zur Strömung (Abbildung 3A, C, Einschub). Dadurch wird der eingeschlossene Komplex aus der DNA-Perlenlösung in Strom 2 verschoben. Durch die weitere Übersetzung wird der Komplex in Stream 3 verschoben.
9. Durchflusszellenreinigung
HINWEIS: Führen Sie dies täglich durch.
- Schalten Sie die Pumpe aus, wenn das Experiment abgeschlossen ist. Drehen Sie die Schaltventile in die geschlossene Stellung (Abbildung 4C).
- Entfernen Sie die Spritzen und leeren Sie sie. Dreimal mit gefiltertem destilliertem Wasser abspülen.
- Füllen Sie die Spritzen mit Reinigungslösung. Setzen Sie Spritzen in die Pumpe ein und schließen Sie die Schaltventile an.
- Spülen Sie die Schaltventile und ändern Sie die Position zum Öffnen. Pumpen Sie 800 μL Reinigungslösung bei einer Durchflussrate von 100 μL/h typischerweise über Nacht.
- Schließen Sie am nächsten Tag die Schaltventile, entfernen und spülen Sie die Spritzen mit Wasser ab. Spülen Sie die Durchflusszelle und die Leitungen mit 4-800 μL Wasser bei einer Durchflussrate von 400-800 μL/h. Wenn eine anstrengendere Reinigung der Durchflusszellen erforderlich ist, ersetzen Sie die Reinigungslösung durch 6 M Guanidiumhydrochlorid.
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Representative Results
Die erste Prüfung der Fallenausrichtung und -festigkeit erfolgt mit 1 μm, nicht fluoreszierenden Polystyrolperlen. Da der Großteil der im Labor durchgeführten Forschung Fluoreszenz verwendet, testen wir die Fallenstärke mit 1 μm, Dragon grünen Polystyrolperlen (Abbildung 1D, E). Danach wechseln die Arbeiten zum optischen Einfangen von DNA-Perlenkomplexen, bei denen die DNA mit dem bis-interkalierenden Farbstoff YOYO-114,29 angefärbt wird. Wenn diese Komplexe 10-15 μm über der Deckglasoberfläche in einer mikrofluidischen Flusszelle eingeschlossen werden, dehnt der Flüssigkeitsfluss an der Perle vorbei die DNA aus (Abbildungen 3B,C). Es ist wichtig, die Länge der flüssigkeitsgestreckten DNA zu messen, um sicherzustellen, dass sie auf ihre B-Form-Länge gestreckt wird, was der erwarteten Länge entspricht. Zum Beispiel ist für Bakteriophagen-Lambda-DNA die Gesamtlänge etwas länger als 16 μm, was 48.504 bp14 entspricht.
Zur Charakterisierung der Flüssigkeitsströmung wurden fluoreszierende Beads in Durchflusszellen mit einer Fokushöhe von 15 μm über der Deckglasoberfläche mit unterschiedlichen Pumpendrehzahlen und in Lösungen unterschiedlicher Viskosität eingebracht. Filme der Perlenposition wurden erfasst und die Perlenposition wurde mit einer Bildanalysesoftware verfolgt. Die Ergebnisse zeigen, dass für Perlen mit einem Durchmesser von 1 μm die lineare Geschwindigkeit bei einer Pumpendurchflussrate von 100 μL/h in Saccharoselösungen im Bereich von 10% bis 50% genau verfolgt werden kann (Abbildung 5A). Unter ähnlichen Bedingungen kann die Kraft auf die Wulst berechnet und in Abhängigkeit von der Pumpendurchflussrate und der Lösungsviskosität zwischen 10 und 400 pN liegen (Abbildung 5B). Schließlich wurde der Einfluss des Perlendurchmessers von 120 bis 970 nm auf die Kraft in verschiedenen Saccharosekonzentrationen bewertet. Die Daten zeigen, dass Kräfte im Bereich von 1-27 pN gemessen werden können, indem Perlen unterschiedlichen Durchmessers an einem Motorprotein befestigt werden und der Motor aufgefordert wird, diese Perle gegen den Flüssigkeitsstrom zu ziehen (Abbildung 5C).
Abbildung 1: Optisches Layout und Demonstration der Fangaktivität. (A) Schematische Darstellung der optischen Anordnung mit dem IR-Strahl in rot und dem HeNe-Strahl in schwarz. (B) Foto der optischen Komponenten, die auf einem Steckbrett montiert sind. Die Komponentennummern in den Feldern A und B lauten wie folgt: 1), Strahlexpander; 2), Interferenzspiegel (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), Interferenzspiegel (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), Interferenzspiegel (Rmax = 633 nm); 7), Interferenzspiegel (Rmax = 1064 nm; Tmax= 633 nm); 8), Interferenzspiegel (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), Interferenzspiegel (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), Interferenzspiegel (Rmax = 1064 nm); 11), Objektiv, f = 110 nm; 12), Telan-Linse; 13), galvanische Spiegel; 14-16), Rotatoren (/2); 17), IR-Scanning-Kanalverschluss; 18), Sichtbarer Kanalverschluss; 19), IR-Shutter mit festem Kanal; 20), Strahlstopps und 21), Interferenzspiegel (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Messung der Leistungsabgabe. Die Leistungsabgabe des Lasers wird gemessen, bevor der Laserkopf in das optische Layout eingebaut wird. Sobald die Fallenausrichtung abgeschlossen ist, wird die Strahlleistung nach dem 100x-Objektiv für jede Falle gemessen. (D) und (E) Bilder, die einen stabilen, optischen Einfang von 1 μm fluoreszierenden Perlen zeigen. F, feste Falle und M, mobile Falle, wobei sich die mobile Falle im Scanmodus durch einen kleinen (D) oder großen (E) Kreis bei 30 mHz bewegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikrofluidische Durchflusszellen. (A) Montage einer Dreikanal-Durchflusszelle aus Borosilikatglas. (B) Ein Verteiler zur stabilen Positionierung von Durchflusszellen während des Steckverbinderverklebens. Oberseite, die Basis des Aluminiumverteilers mit einem 1 mm Einbauquerschnitt zur seitlichen Positionierung der Durchflusszelle. Die vier Pfosten (einer in jeder Ecke) führen den Deckel des Krümmers in Position, während die mittiger platzierten Gewindebolzen zum Einklemmen des Deckels verwendet werden. Boden, Verteilerdeckel mit Bohrungen passend zu den Pfosten und Bolzen auf der Verteilerbasis. (1), Muttern, die an den Verteilerschrauben befestigt werden; (2) Federn, die zwischen den Muttern und dem Krümmerdeckel platziert sind, um während des Klebevorgangs eine leichte Spannung zu erzeugen. (C) Nahaufnahme der Konvergenz der Einlasskanäle zu einem gemeinsamen einzelnen Flüssigkeitsstrom in einer Glasdurchflusszelle mit bereits angebrachten Anschlüssen. Ein Viertel wird als Referenz neben der Durchflusszelle platziert. (D) Ein Bild der PDMS-Durchflusszelle. Die PDMS-Schichten sind 3 mm dick. (E) Eine Quarzglas-Durchflusszelle mit Luer-Anschlüssen. (F) Eine Durchflusszelle aus Borosilikatglas mit Einpressverbindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Strömungsverhalten von Flüssigkeiten durch eine Glasdurchflusszelle. (A) Der Flüssigkeitsstrom innerhalb der Durchflusszelle ist laminar. Das Schema zeigt die Durchflusszelle von oben, um zu zeigen, dass die Zwischenkanaldiffusion die Hauptquelle für die Vermischung zwischen benachbarten Flüssigkeitsströmen ist. Die Fließrichtung wird durch blaue Pfeile angezeigt und die einzelnen Bäche sind weiß, hellgrau und weiß eingefärbt. Die sich erweiternden Bereiche der Querdiffusion zwischen den Kanälen sind rot dargestellt. Der Einschub zeigt ein Fluoreszenzbild benachbarter Flüssigkeitsströme bei 10-facher Vergrößerung mit fluoreszenzmarkierten DNA-Perlenkomplexen im unteren Strom und Puffer nur im oberen Strom. Die weißen Flecken im oberen Strom sind Aufnahmerauschen der CCD-Kamera. (B) Das Strömungsprofil (hellviolett) in laminaren Flusszellen ist parabolisch. Die Durchflusszelle wird von der Seite betrachtet und die Richtung der Strömung wird über jeder Zelle angezeigt. Die schnellsten Flüssigkeitsgeschwindigkeiten treten in der Durchflusszelle in der Mitte auf, während die langsamsten Flüssigkeitsgeschwindigkeiten neben den Strömungszellenoberflächen auftreten. Folglich dehnt der Flüssigkeitsstrom für einen optisch eingeschlossenen DNA-Perlenkomplex, der sich im Zentrum der Flusszelle befindet, das Bakteriophagen-λ-DNA-Molekül (48.504 bp) auf 16 μm (B-Form) aus, so dass eine klare Visualisierung möglich ist (linkes Bild). Im Gegensatz dazu weist das gleiche Molekül, das sich in der Nähe der Oberfläche der Flusszelle befindet, geringe Flussraten auf und kann nicht gestreckt werden. (C) Ein einzelner DNA-Perlenkomplex befindet sich innerhalb einer Flusszelle. Es können verschiedene Tiefenflusszellen verwendet werden, aber in jedem Fall können die Strahlausrichtungen so eingestellt werden, dass ein optimales Einfangen 10-20 μm über der Deckglasoberfläche erfolgt, wodurch Oberflächeneffekte eliminiert werden und ein stabiler Fluss besteht, so dass DNA-Moleküle in B-Form gedehnt werden können. Wie im linken Bild in (C) dargestellt, wird die DNA gedehnt, um eine klare Visualisierung zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Fluss- und Reaktionskontrolle von optisch eingeschlossener DNA innerhalb einer Flusszelle im Mikroskoptisch . (A) Stecken der Durchflusszelle an eine Spritzenpumpe. Gezeigt wird das Foto einer dreikanaligen Durchflusszelle, die über Dreiwegeschaltventile mit einer Spritzenpumpe verbunden ist. Die Flusszelle wird auf einem motorisierten Tisch in einem inversen Mikroskop gehalten. Die Durchflusszelle ist über einen orangefarbenen, 500 μm Schlauch (grünes Klebeband gekennzeichnet) mit einer Abwasserleitung (links) und Schaltventilen (gestrichelter Cyankreis) verbunden. Die Ventile sind stabil auf einem speziell angefertigten Verteiler montiert, der an den Spritzenpumpenapparat angepasst ist und 1 ml gasdichte Spritzen beherbergt (gelbe Pfeile markieren die Kolben). Die Abfallleitungen werden verwendet, um Luftblasen zu entfernen, die beim Spritzenwechsel im Schaltventil eingeschlossen werden können. (B) Nahaufnahme der dreikanaligen Durchflusszelle. Um die Visualisierung von Flüssigkeitsströmen zu erleichtern, wurden die äußeren mit Lebensmittelfarbe eingefärbt, wobei der zentrale Strom nur Wasser enthält. Der gezoomte Bereich zeigt an, wie ein optisch eingeschlossener Perlen-DNA-Molekülkomplex von einem Flüssigkeitsstrom zum nächsten übersetzt wird (blauer Pfeil), indem die Stufe senkrecht zur Strömung übersetzt wird (schwarzer Pfeil). (C) Schematische Darstellung der Dreiwegeschaltventile mit Angabe ihrer Betriebsstellungen. Die Buchstabenbezeichnungen F, S und W entsprechen der Richtungsflüssigkeit und können zur Durchflusszelle, Spritze bzw. zum Abfall fließen. Ein Port ist dauerhaft geschlossen, wie durch den schwarzen Stecker auf der Oberseite jedes Schaltplans angezeigt. In der offenen oder betriebsbereiten Position (linkes Feld) fließt der Flüssigkeitsstrom direkt durch das Schaltventil von der Spritze (S) zur Durchflusszelle (F). In der Position Closed (rechtes Bild) wird das Zifferblatt so gedreht, dass die Durchflusszelle von der Umgebung abgedichtet ist. In dieser Position wird der Strom auf Abfall geleitet und Spritzen können ausgetauscht werden, ohne Luftblasen in die Durchflusszelle einzuführen. Da die Ventile ein Totvolumen von 6 μL haben, wird beim Spülen von Leitungen vor der Rückkehr zur Open-Konfiguration nur sehr wenig Lösung verschwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Die Raupenbewegung und die Gegenkraft werden durch die Strömung der Flüssigkeit beeinflusst. (A) Die lineare Raupengeschwindigkeit wird durch die Pumpgeschwindigkeit und die Saccharosekonzentration beeinflusst. (B) Die Gegenkraft auf eine Perle wird durch die Lösungsviskosität beeinflusst. (C) Der Perlendurchmesser beeinflusst die Kraft auf Perlen im Fluss. In allen Experimenten wurden fluoreszierende Perlen verwendet (Dragon green). In (A) und (B) wurden Perlen mit einem Durchmesser von 0,97 μm und in (C) Perlen unterschiedlichen Durchmessers verwendet. Saccharoselösungen wurden in Reinstwasser hergestellt, durch 0,2-μm-Filter gefiltert und der Brechungsindex mit einem Handrefraktometer gemessen, wobei die Viskosität in Zentipois mit ISCO-Tabellen bestimmt und schließlich in SI-Einheiten in mPa.s umgewandelt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Durchfluss (μL/h)b | Zeit pro Schritt (min) | Volumen dosiert (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 oder mehr | 1 oder mehrere |
| ein. Dies sind Flüssigkeitsdurchflussraten, die von der Spritzenpumpensoftware berechnet werden und für jeden verwendeten Spritzendurchmesser einzigartig sind. Die Durchflussraten ermöglichen eine schnelle Befüllung der Leitungen und der Durchflusskammer (800 μl/h), gefolgt von einer allmählichen Abnahme auf die ideale Durchflussrate für das Abfangen und die Visualisierung | ||
| b. Die Spritzenpumpe kann über die Tastatur oder über die vom Hersteller bereitgestellte Software gesteuert werden. | ||
Tabelle 1: Flüssigkeitsdurchflussraten zur Minimierung von Blasen und stabilem Einfangen.
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Discussion
Die sorgfältige Montage des Strömungssystems ist entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis der Experimente 4,6. Einer der schwierigsten Aspekte des Protokolls ist die Befestigung von Steckern an der Glasoberfläche. Dazu verwenden wir die folgenden zwei Ansätze: Einpressschlauchverbinder und Nanoport-Baugruppen. Einpressverbinder haften leicht auf Glas, gefolgt von PTFE-Schläuchen in die vorgeformten Löcher mit einer Pinzette. Wenn eine stabilere Befestigung erforderlich ist, wird die Verklebung von Nanoport-Baugruppen bevorzugt. Bei sorgfältiger Verwendung und Reinigung kann eine einzelne Glasdurchflusszelle mit festen Baugruppen länger als 1 Jahr verwendet werden. Wenn Durchflusszellen häufiger ausgetauscht werden müssen, können PDMS-Durchflusszellen eingesetzt werden, da sie eine hervorragende und kostengünstige Alternative darstellen. Sie können wiederverwendet werden, aber PDMS ist anfällig für Quellungen, die das Strömungsverhalten der Flüssigkeit im Laufe der Zeit verändern können.
Sowohl Glas- als auch PDMS-Durchflusszellen sind nicht unzerstörbar. Im Labor beträgt die maximale Durchflussrate 800 μL/h. Wird diese täglich und/oder über längere Zeiträume überschritten, kann es zu Flusszellenverzug (Glasdurchflusszellen) und Verzerrungen des PDMS kommen. Während der anfängliche Benetzungsvorgang mit Methanol und Wasser Zeit in Anspruch nimmt, lohnt es sich, da alle Blasen eliminiert werden und auch Leckagen an Steckern erkannt werden können. Die hier beschriebenen Flusszellen bieten Flexibilität für die durchgeführten Experimente. Mit diesen Ansätzen verschiedener Durchflusszellen, Schläuche und der Befestigung verschiedener Steckverbinder können die experimentellen Bedingungen leicht angepasst und schnell optimiert werden, um optimale Daten zu erhalten. Y-förmige Kanalflusszellen werden vorgestellt, aber eine große Auswahl an mikrofluidischen Gerätedesigns ist von mehreren Unternehmen sowohl ohne als auch mit angeschlossenen Anschlüssen erhältlich. Dies bietet dem Prüfer eine noch größere Flexibilität im experimentellen Design.
Die Verwendung von Vier-Wege-Schaltventilen ist eine einfache und effektive Methode, die sicherstellt, dass das Durchflusssystem nach der Montage und Prüfung effektiv zu einer geschlossenen Umgebung wird, in der die Kontamination minimal ist und Blasen eliminiert werden. Letzteres ist kritisch, da Blasen dazu neigen, sich während eines Experiments zufällig zu komprimieren und zu dekomprimieren, und dies den Flüssigkeitsfluss stört, wodurch sich eingeschlossene DNA-Moleküle auf unerwartete Weise bewegen und sogar brechen. Es sollte sehr darauf geachtet werden, dass sie sich nicht im System bilden.
Schließlich ist das hier beschriebene System für die visuelle Biochemie optimiert, bei der eine sorgfältige Analyse von DNA, an Proteinen befestigten Perlen oder fluoreszenzmarkierten Proteinen durchgeführt werden kann. Obwohl das System nicht für Kraftmessungen mit den dualen Fallen und der Zugabe von Quadrantenphotodetektoren ausgelegt ist, können Kräfte gemessen werden, indem beispielsweise Perlen unterschiedlichen Durchmessers an DNA-Motorproteine angebracht werden und der Motor aufgefordert wird, diese Perle gegen den Flüssigkeitsfluss zu ziehen. Durch Variation der Lösungsviskosität, des Flüssigkeitsflusses und des Raupendurchmessers kann ein großer Bereich gegensätzlicher Kräfte angewendet werden, um detaillierte Einblicke in die Funktion des Motorproteins zu erhalten (Abbildung 5). Dies ist eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Kräfte zu messen, die mit biologischen Transaktionen verbunden sind, aber es fehlt die Präzision, die mit empfindlicheren Ansätzen verbunden ist. Wenn der visuelle biochemische Ansatz mit empfindlichen Kraftdetektionsmethoden kombiniert wird, können vollständigere Bilder biochemischer Reaktionen geliefert werden.
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Disclosures
Der Autor erklärt keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Forschung im Bianco-Labor wird durch die NIH-Zuschüsse GM100156 und GM144414 an P.R.B. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
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