Summary
La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.
Abstract
La biochimica visiva è una potente tecnica per osservare le proprietà stocastiche di singoli enzimi o complessi enzimatici che sono oscurati nella media che avviene negli studi in fase di massa. Per ottenere la visualizzazione, le pinzette ottiche doppie, in cui una trappola è fissa e l'altra è mobile, sono focalizzate in un canale di una camera microfluidica multi-flusso posizionata sul palco di un microscopio a fluorescenza invertita. Le pinzette ottiche intrappolano singole molecole di DNA marcato fluorescentmente e il fluido scorre attraverso la camera e oltre le perle intrappolate, allunga il DNA in forma B (sotto una forza minima, cioè 0 pN) con l'acido nucleico osservato come una stringa bianca su uno sfondo nero. Le molecole di DNA vengono spostate da un flusso all'altro, traslando lo stadio perpendicolarmente al flusso per consentire l'avvio delle reazioni in modo controllato. Per raggiungere il successo, i dispositivi microfluidici con canali otticamente trasparenti sono accoppiati a siringhe di vetro tenute in posizione in una pompa a siringa. I risultati ottimali utilizzano connettori legati in modo permanente alla cella di flusso, tubi meccanicamente rigidi e resistenti agli agenti chimici e collegati a valvole di commutazione che eliminano le bolle che impediscono il flusso laminare.
Introduction
La capacità di visualizzare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola e in tempo reale ha fornito informazioni significative sulla stabilità del genoma 1,2. Oltre a lavorare con singole molecole di DNA una alla volta, la possibilità di visualizzare le transazioni tra singole molecole vicine fornisce ulteriori informazioni 3,4,5. La manipolazione di ulteriori molecole di DNA richiede sia trappole ottiche aggiuntive che celle a flusso microfluidico multicanale di alta qualità6.
Esistono diversi metodi disponibili per generare più di una trappola ottica. Questi includono specchi a scansione galvanometrica, modulatori ottici acustici e ottiche diffrattive, che generano pinzette ottiche olografiche 4,7,8,9. Spesso, specchi a scansione e modulatori ottici acustici producono trappole che multiproprietà. Nella configurazione qui descritta, il fascio di un singolo laser Nd: YAG viene diviso sulla polarizzazione, e quindi gli specchi di scansione laser galvanometrici controllano la posizione di quella che viene definita la trappola mobile (Figura 1) 4. Per facilitare il posizionamento di specchi e filtri per dirigere il fascio di intrappolamento verso l'apertura posteriore dell'obiettivo del microscopio, viene utilizzato un laser HeNe. Ciò rende più facile l'allineamento generale in quanto il fascio HeNe è visibile ad occhio nudo, mentre i raggi infrarossi non lo sono. Il fascio HeNe è anche più sicuro da lavorare rendendo il posizionamento di specchi e altri componenti meno stressante. Inizialmente, il percorso del fascio per questo laser è separato dal raggio di 1064 nm, ma viene introdotto nello stesso percorso del fascio e quindi nell'obiettivo del microscopio. Una volta raggiunto l'allineamento fisico, viene eseguito il posizionamento del fascio di 1064 nm sopra il fascio HeNe e questo è facilitato dall'uso di un visualizzatore a infrarossi e vari strumenti di imaging del fascio per visualizzare la posizione e la qualità del fascio. Quindi, viene introdotto l'espansore del fascio e il raggio infrarosso espanso risultante viene allineato sull'apertura posteriore dell'obiettivo. Infine, l'obiettivo viene rimosso e la potenza in ciascun fascio polarizzato viene misurata e regolata utilizzando piastre d'onda λ/2 per essere uguale (Figura 1C). Le misurazioni della potenza vengono eseguite anche una volta restituito l'obiettivo e in genere c'è una perdita di potenza del 53%. C'è, tuttavia, una potenza sufficiente per formare trappole ottiche fisse e mobili stabili nel piano focale (Figura 1D).
Per visualizzare le transazioni del DNA, le celle a flusso microfluidico svolgono un ruolo chiave in quanto consentono misurazioni controllate a livello di singola molecola con un'elevata risoluzione spaziale e temporale (Figura 2). Il termine microfluidica si riferisce alla capacità di manipolare fluidi in uno o più canali con dimensioni comprese tra 5-500 μm10,11. Il termine flusso si riferisce al fluido effettivo all'interno di un canale e il canale si riferisce al canale fisico in cui si muovono uno o più flussi di fluidi. Il design della cella di flusso a canale singolo ha un canale fisico comune in cui vengono osservate le reazioni e in genere è presente un solo flusso di fluido. Pertanto, questi progetti sono noti come celle di flusso a flusso singolo. Al contrario, le celle a flusso multi-stream sono definite come un dispositivo microfluidico in cui due o più canali di ingresso convergono in un singolo canale fisico comune (Figura 2A). All'interno del canale comune, i flussi fluidi che hanno origine dai singoli canali fluiscono paralleli l'uno all'altro e rimangono separati con una miscelazione minima tra loro che si verifica a causa della diffusione (Figura 2B). Nella maggior parte delle configurazioni sperimentali, una singola pompa spinge i fluidi in ciascun canale alla stessa velocità. Al contrario, quando viene utilizzato lo sterzo di confine, tre o più pompe a controllo indipendente spingono i fluidi attraverso i canali. Tuttavia, ogni pompa funziona a una velocità diversa, ma la portata netta nel canale comune è costante12. Ciò consente la rapida sostituzione dei componenti del canale principale semplicemente modificando la velocità della pompa.
Oltre al flusso laminare, un altro fattore critico è il profilo di velocità parabolica all'interno del flusso di fluido laminare. La velocità di flusso più elevata si verifica nel mezzo del flusso e la più lenta si verifica vicino alle superfici (Figura 2C)13. Questo profilo deve essere considerato per allungare completamente una molecola di DNA che è attaccata a una perla tenuta nel flusso per una visualizzazione precisa del DNA fluorescente e accurate analisi di singole molecole. Qui, il DNA è allungato in forma B e viene tenuto in posizione sotto 0 pN di forza. Per raggiungere questo obiettivo, la messa a fuoco della posizione della trappola ottica dovrebbe essere in una posizione di 10-20 μm dalla superficie inferiore del coperchio (Figura 2D). Bisogna fare attenzione in modo che la molecola di DNA non sia allungata oltre la forma B in quanto ciò può inibire le reazioni enzimatiche. In condizioni tampone tipiche, 1 μm = 3.000 bp di DNA14. Inoltre, intrappolando 10-20 μm dal vetrino, il complesso del DNA viene posizionato lontano dalla superficie, riducendo così al minimo le interazioni superficiali.
Molti metodi sono stati utilizzati per creare canali di dispositivi microfluidici e questi possono essere fatti in laboratorio o celle di flusso possono essere acquistati da fonti commerciali 6,15,16,17. I materiali ottimali utilizzati per costruire le celle di flusso devono essere meccanicamente rigidi, otticamente trasparenti con bassa fluorescenza e impermeabili ai solventi organici6. Spesso, il vetro float borosilicato o la silice fusa vengono utilizzati per fornire un ambiente di flusso stabile per un tempo prolungato adatto per l'intrappolamento ottico, la visualizzazione e il rilevamento della forza. Questi materiali consentono anche l'uso di solventi non acquosi (ad esempio, metanolo spettrofotometrico) per semplificare la bagnatura superficiale e la rimozione delle bolle d'aria e denaturanti (ad esempio, 6M guanidinium cloridrato) o detergenti per pulire la cella di flusso. Infine, i metodi utilizzati per introdurre fluidi nelle celle di flusso variano da complessi sistemi di pompe per vuoto a pompe a siringa singola 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Nell'approccio qui descritto, viene utilizzata una pompa a siringa che può contenere fino a 10 siringhe (Figura 3A). Ciò offre la flessibilità di utilizzare celle di flusso a canale singolo o celle di flusso con più canali di ingresso. Qui, viene utilizzata una cella di flusso a tre canali che viene accoppiata a siringhe tenute in posizione sulla pompa a siringa utilizzando tubi in poli-etere-etere-chetone (PEEK) (Figura 3A-C). Il flusso dei fluidi è controllato da valvole di commutazione a quattro vie e serve quindi a ridurre al minimo l'introduzione di bolle nella cella di flusso (Figura 3A,D). Inoltre, si raccomandano siringhe a tenuta di gas Hamilton con pareti di vetro rigide e stantuffi rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE), in quanto forniscono un movimento eccezionalmente regolare dello stantuffo che è essenziale per ottenere un flusso regolare14,27.
Nel sistema sperimentale descritto sono state utilizzate celle di flusso con canali di ingresso da due a cinque. Il numero di canali di ingresso è dettato dall'esperimento in corso. Per lo studio di RecBCD e Hop2-Mnd1, due canali di flusso erano sufficienti14,28. Per l'elicasi, l'enzima è stato legato all'estremità libera del DNA e tradotto in un flusso contenente magnesio e ATP per avviare la traslocazione e lo svolgimento. Per Hop2-Mnd1, il DNA intrappolato otticamente è stato tradotto nel flusso fluido adiacente contenente proteine e tampone ± ioni metallici bivalenti. L'uso di cellule a flusso a tre canali consente di intrappolare il DNA nel flusso 1, tradurre il DNA nel flusso 2 per consentire il legame proteico e quindi di flusso 3 dove è presente ATP, ad esempio, per avviare reazioni. Una variazione di quanto sopra è quella di utilizzare proteine marcate con fluorescenza nel canale 2, che si traduce in un flusso fluido completamente bianco e preclude la visualizzazione del DNA. Quando questa molecola viene tradotta nel flusso 3, sia le proteine che il DNA sono ora visibili quando vengono avviate le reazioni.
L'uso di valvole di commutazione a quattro vie per controllare il flusso del fluido è un componente critico del sistema per eliminare le bolle nelle celle di flusso. Le bolle sono dannose per il flusso stabile del fluido in quanto si contraggono e si espandono in modi imprevedibili con conseguenti rapidi cambiamenti nella velocità del flusso e l'introduzione di turbolenza. Quando le valvole sono posizionate tra siringhe e tubi di ingresso, il percorso del flusso viene scollegato cambiando la posizione della valvola quando le siringhe vengono sostituite. Quando la nuova siringa viene posizionata, lo stantuffo può essere premuto manualmente in modo che vengano espulsi >6 μL (il volume morto della valvola) e questo elimina quasi completamente le bolle.
Il collegamento di connettori alle celle di flusso è spesso la fase limitante nell'uso delle celle di flusso. Descriviamo l'uso di due tipi di connettori: rimovibili noti come press-fit e permanenti (assemblaggi nanoport). I connettori rimovibili sono semplici da aderire a una cella di flusso e diversi tipi di tubi flessibili oltre al PTFE consigliato possono essere testati con questi connettori. Questo è un modo rapido ed economico per testare tubi e connettori senza sacrificare celle di flusso in vetro più costose. Al contrario, i gruppi nanoport sono fissati in modo permanente, resistono a pressioni fino a 1.000 psi, e, nelle nostre mani, il loro uso è limitato a tubi in PEEK di diversi diametri. Questo non è uno svantaggio in quanto viene preferibilmente utilizzato il tubo PEEK. Una singola cella di flusso in vetro con assemblaggi permanenti collegati può essere riutilizzata per più di 1 anno con un uso attento.
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Protocol
1. Allineamento e test della trappola laser con perline di polistirolo
NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 1A,B.
ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve indossare occhiali protettivi appropriati o occhiali di sicurezza laser durante l'allineamento del raggio laser. Poiché il sistema di pinzette ottiche qui descritto utilizza sia raggi HeNe che IR, sono necessari due set separati di vetreria di sicurezza laser.
- Allineamento HeNe Beam
- Posizionare tutti i componenti ottici sulla breadboard. Allineare la breadboard in modo che sia il più vicino possibile a un angolo di 90° rispetto al microscopio.
- Collegare il tubo di accoppiamento contenente l'obiettivo e la lente telan al microscopio (Figura 1A-11,12).
NOTA: la lente telan è un sistema di lenti utilizzato per mettere a fuoco l'immagine sul piano dell'immagine intermedio negli oculari. - Accendere il laser HeNe e aprire l'otturatore (Figura 1A-18). Il fascio deve colpire il filtro (Figura 1A-3) ad un'altezza di 54 mm riflettendo il 50% della luce sullo specchio 5 (Figura 1A-5). Il restante 50% del fascio colpisce lo specchio 4 (Figura 1A-4) alla stessa altezza dello specchio 3.
- Regolare lo specchio 4 (Figura 1A-4) in modo che il raggio colpisca lo specchio 6 (Figura 1A-6) ad un'altezza di 51 mm.
- Regolare lo specchio 6 (Figura 1A-6) in modo che il raggio sia diretto verso lo specchio galvanico inferiore ad un'altezza di 51 mm. La trave che esce dallo specchio galvanico superiore sarà a 57,5 mm.
- Regolare lo specchio 3 (Figura 1A-3) in modo che questo raggio colpisca lo specchio 5 (Figura 1A-5) ad un'altezza di 57,5 mm. Una volta riflesso dallo specchio 5, il raggio dovrebbe colpire lo specchio 9 (Figura 1A-9) alla stessa altezza. Il raggio viene efficacemente ricombinato allo specchio 9, passa attraverso l'obiettivo e il sistema di lenti telan sullo specchio 21 (Figura 1A-21), che lo riflette nell'obiettivo.
- Posizionare un vetrino pulito per microscopio sul palco del microscopio. Accendere la fotocamera e visualizzare i raggi fissi e di scansione singolarmente sullo schermo. A partire dallo specchio 3, poi 5 e 9, infine 21, eseguire piccole regolazioni per posizionare il fascio fisso al centro dello schermo.
- Per garantire che l'angolo del fascio in uscita dallo specchio 21 sia di 90°, modificare l'altezza Z del microscopio e posizionare il raggio ripreso sulle superfici superiore e inferiore del vetrino. Quando sono identici, il raggio è nella posizione corretta, che è perpendicolare al palcoscenico. Otturatore di questo raggio utilizzando l'otturatore 19 (Figura 1A-19).
- A partire dagli specchi 4 e 6, eseguire piccole regolazioni per posizionare il fascio fisso al centro dello schermo. Otturatore questo raggio.
- Allineamento del fascio infrarosso (IR)
ATTENZIONE: Eseguire tutti i passaggi a bassa potenza laser per motivi di sicurezza.- Regolare la piastra d'onda 14 (Figura 1A-14) per regolare il rapporto tra fasci trasmessi e riflessi divisi sul beam splitter 2 (Figura 1A-2). Il beam splitter 2 riflette la componente s del raggio laser e trasmette la componente p.
- Il fascio che passa attraverso 2, colpisce lo specchio 7 (Figura 1A-7), che devia il raggio sullo specchio galvanico inferiore. Dovrebbe seguire il percorso del raggio HeNe sullo specchio 21. Eseguire piccoli movimenti dello specchio 7 per ottenere questo posizionamento.
- Regolare lo specchio 2 in modo che il raggio riflesso dallo specchio 2 colpisca lo specchio 10 (Figura 1A-10) ad un'altezza di 57,5 mm.
- Il raggio viene riflesso dallo specchio 10 sullo specchio 8 (Figura 1A-8) ad un'altezza di 57,5 mm. Il raggio successivo dovrebbe colpire lo specchio 9 alla stessa altezza. In caso contrario, apportare piccole modifiche agli specchi 10 e 8 come richiesto.
- Rimuovere l'obiettivo e posizionare la testa del misuratore di potenza sopra la porta nella torretta dell'obiettivo.
- Utilizzare le piastre 14, 15 e 16 (Figura 1A-14,15,16) per regolare la potenza di ciascun raggio laser in modo che siano uguali come mostrato nella Figura 1C.
- Posizionare l'espansore del fascio 1 (Figura 1A-1). Regolare il raggio laser espanso in modo che sia circolare senza coma o astigmatismo.
- Per testare le trappole ottiche, creare una soluzione di perle di polistirene da 1 μm sospese in acqua. Quindi, posizionare 10 μL di questa soluzione su un vetrino da microscopio, posizionare un coprivetrino sulla parte superiore e sigillare con lo smalto. Posizionare il vetrino sul palco del microscopio e testare le trappole ottiche intrappolando queste perle da 1 μm. Assicurati che le perline siano risucchiate nelle trappole e tenute stabilmente quando il palco viene spostato. L'intrappolamento dovrebbe avvenire in modo altrettanto efficiente da tutti i lati della trappola.
2. Preparazione della camera microfluidica
- Se la cella di flusso è un dispositivo costruito commercialmente in polidimetilsilossano (PDMS) su un vetrino, procedere al passaggio 3. Se si tratta di un dispositivo di vetro con connettori collegati, procedere al passaggio 4.
- Se la cella di flusso non dispone di connettori collegati, incollarli prima ai fori di ingresso sul vetrino del microscopio. Vedere il passaggio 3 per la procedura di collegamento dei connettori.
3. Connessioni delle celle di flusso utilizzando una cella di flusso PDMS
NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 2D.
- Posizionare la cella di flusso su una superficie piana e pulita. Tenere il tubo in PTFE a 3 mm dall'estremità libera con una pinza. Spingere il tubo nella porta preformata (la porta può supportare una pressione di linea di 2 bar).
- Ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti. Collegare le porte di ingresso alla pompa della siringa e l'uscita a un flacone di scarico (Figura 4A,B).
- Riempire ogni siringa di vetro con 1 mL di metanolo spettrofotometrico. Collegare ogni siringa a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 μL di metanolo (Figura 4C, posizione chiusa).
- Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso (Figura 4C, posizione aperta). Pompare 800 μL di metanolo attraverso la cella di flusso ad una portata di 100 μL/h per bagnare le superfici ed eliminare le bolle.
- Il giorno successivo, ripetere questo processo utilizzando 800 μL di acqua ultrapura. La cella di flusso è ora pronta per l'uso.
4. Fissaggio dei connettori dei tubi press-fit
NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 2F.
- Se è necessario utilizzare connettori per tubi pressabili, rimuovere con cautela il nastro adesivo da un lato del connettore e posizionarlo sopra il foro nel vetrino del microscopio. Premere verso il basso per alcuni secondi. Ripetere il processo per i connettori rimanenti.
- Posizionare la cella di flusso su una superficie piana e pulita. Tenere il tubo in PTFE a 3 mm dall'estremità libera con una pinza. Spingere il tubo nel foro preformato nella porta e ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti.
- Collegare i tubi dagli ingressi alle valvole di commutazione. Procedere al passaggio 7.
5. Sequestro delle assemblee permanenti
NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 2A-C.
- Eseguire l'attacco su una superficie piana pulita o su un collettore personalizzato per mantenere la cella di flusso e i connettori in posizione durante l'incollaggio.
- Posizionare la cella di flusso su una superficie piana pulita o nella sezione incassata del collettore (Figura 2B). Posizionare una piccola quantità di colla di vetro sul fondo del gruppo e inserire il sigillo.
- Posizionare il nanoport su uno dei fori di ingresso sul vetrino del microscopio. Spingere delicatamente verso il basso e tenere in posizione senza movimenti laterali. Ripetere il processo per le porte rimanenti.
- Lasciare asciugare o bloccare in posizione nel collettore. Rimuovere delicatamente la cella di flusso dal collettore e assicurarsi che gli assiemi siano ben allineati con le porte di ingresso nella cella di flusso. Procedere al passaggio 7 quando si è pronti.
6. Connessioni e preparazione delle celle di flusso
NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 4A,B.
- Posizionare una cella di flusso sul palco del microscopio. Collegare il tubo utilizzando i connettori a tenuta stagna.
- Riempire ogni siringa di vetro con 1 mL di metanolo spettrofotometrico. Collegare ogni siringa a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 μL di metanolo (Figura 4C, posizione chiusa).
- Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso (Figura 4C, posizione aperta). Pompare 800 μL di metanolo attraverso la cella di flusso ad una portata di 100 μL/h per bagnare le superfici ed eliminare le bolle.
- Il giorno successivo, ripetere questo processo utilizzando 800 μL di acqua ultrapura. La cella di flusso è ora pronta per l'uso.
7. Controllo del flusso del fluido
- Ruotare le valvole di commutazione in posizione chiusa (Figura 4C). Rimuovere le siringhe, eliminare l'acqua residua e riempire le siringhe con soluzioni sperimentali, ad esempio perline di DNA; enzima; e ATP. Riportare le siringhe alla pompa e collegarle alle valvole di commutazione.
- In questa posizione, forzare manualmente gli stantuffi verso il basso di 5-10 μL per rimuovere eventuali bolle. Impostare la posizione della valvola di commutazione su Apri.
- Utilizzare lo schema di portata per ottenere una velocità di flusso del fluido ottimale per l'intrappolamento e la visualizzazione, come descritto nella Tabella 1. Il flusso ottimale del fluido per l'intrappolamento ottico dovrebbe consentire un intrappolamento stabile delle perle e una volta che il DNA è allungato, dovrebbe essere di forma B (~ 3.000 bp / μm).
8. Intrappolamento di perle di polistirolo con singole molecole di DNA attaccate
- Con un ingrandimento di 10x, individuare il confine tra i flussi di fluido vicino ai punti di ingresso del canale. Aggiungi olio all'obiettivo 100x e passa all'ingrandimento più elevato.
- Aprire le persiane per le trappole ottiche (entrambe o una alla volta). I raggi laser focalizzati dovrebbero intrappolare le perline e il DNA dovrebbe allungarsi immediatamente.
- Una volta che un complesso è stato intrappolato, traslare lo stadio perpendicolarmente al flusso (Figura 3A,C, riquadro). Questo sposterà il complesso intrappolato dalla soluzione di perline di DNA, nel flusso 2. Un'ulteriore traduzione sposterà il complesso nello stream 3.
9. Pulizia della cella di flusso
NOTA: eseguire questa operazione ogni giorno.
- Spegnere la pompa al termine dell'esperimento. Ruotare le valvole di commutazione in posizione chiusa (Figura 4C).
- Rimuovere le siringhe e svuotarle. Risciacquare tre volte con acqua distillata filtrata.
- Riempire le siringhe con una soluzione detergente. Posizionare le siringhe nella pompa e collegarle alle valvole di commutazione.
- Spurgo le valvole di commutazione e cambia la posizione per aprire. Pompare 800 μL di soluzione detergente ad una portata di 100 μL/h tipicamente durante la notte.
- Il giorno successivo, chiudere le valvole di commutazione, quindi rimuovere e sciacquare le siringhe con acqua. Risciacquare la cella di flusso e le linee con 4-800 μL di acqua ad una portata di 400-800 μL/h. Se è necessaria una pulizia più faticosa delle celle di flusso, sostituire la soluzione detergente con 6 M guanidium hydrochloride.
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Representative Results
Il test iniziale dell'allineamento e della resistenza della trappola viene eseguito con perle di polistirene non fluorescente da 1 μm. Poiché la maggior parte della ricerca condotta in laboratorio utilizza la fluorescenza, testiamo ulteriormente la resistenza della trappola utilizzando perline di polistirene verde drago da 1 μm (Figura 1D, E). Successivamente il lavoro cambia l'intrappolamento ottico dei complessi DNA-perline in cui il DNA viene colorato con il colorante bi-intercalante YOYO-1 14,29. Quando questi complessi sono intrappolati 10-15 μm sopra la superficie di copertura in una cella a flusso microfluidico, il flusso di fluido oltre il tallone allunga il DNA (Figure 3B,C). È importante misurare la lunghezza del DNA allungato dal fluido per assicurarsi che sia allungato alla sua lunghezza di forma B, che è la lunghezza prevista. Ad esempio, per il DNA lambda dei batteriofagi, l'intera lunghezza è leggermente più lunga di 16 μm, che corrisponde a 48.504 bp14.
Per caratterizzare il flusso del fluido, sono state introdotte sfere fluorescenti nelle celle di flusso con un'altezza di fuoco di 15 μm sopra la superficie del coprislip utilizzando diverse velocità della pompa e in soluzioni di diversa viscosità. Sono stati catturati filmati della posizione delle perline e la posizione delle perline è stata tracciata utilizzando il software di analisi delle immagini. I risultati mostrano che per le sfere di 1 μm di diametro, la velocità lineare può essere tracciata con precisione a una portata della pompa di 100 μL/h in soluzioni di saccarosio comprese tra il 10% e il 50% (Figura 5A). In condizioni simili, la forza sul tallone può essere calcolata e trovata compresa tra 10 e 400 pN, a seconda della portata della pompa e della viscosità della soluzione (Figura 5B). Infine, l'effetto del diametro del tallone compreso tra 120 e 970 nm sulla forza è stato valutato in diverse concentrazioni di saccarosio. I dati rivelano che forze comprese tra 1-27 pN potrebbero essere misurate attaccando perline di diverso diametro a una proteina motoria e chiedendo al motore di tirare quella perlina contro il flusso del fluido (Figura 5C).
Figura 1: Layout ottico e dimostrazione dell'attività di intrappolamento. (A) Schema del layout ottico con il fascio IR in rosso e il fascio HeNe in nero. (B) Fotografia di componenti ottici montati su una breadboard. I numeri dei componenti nei pannelli A e B sono i seguenti: 1), Beam expander; 2), specchio di interferenza (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), specchi di interferenza (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), specchi di interferenza (Rmax = 633 nm); 7), specchio di interferenza (Rmax = 1064 nm; Tmax= 633 nm); 8), specchio di interferenza (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), specchio di interferenza (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), specchio di interferenza (Rmax = 1064 nm); 11), Lente dell'obiettivo, f = 110 nm; 12), lente Telan; 13), specchi galvanici; 14-16), Rotatori (/2); 17), otturatore del canale di scansione IR; 18), otturatore canale visibile; 19), otturatore a canale fisso IR; 20), Beam stop e 21), Specchio di interferenza (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Misurazione della potenza erogata. La potenza erogata dal laser viene misurata prima di installare la testa laser nel layout ottico. Una volta terminato l'allineamento della trappola, la potenza del fascio viene misurata dopo l'obiettivo 100x per ogni trappola. (D) ed (E) Immagini che dimostrano l'intrappolamento ottico stabile di sfere fluorescenti da 1 μm. F, trappola fissa e M, trappola mobile con la trappola mobile in modalità di scansione che si muove attraverso un cerchio piccolo (D) o grande (E) a 30 mHz. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Celle a flusso microfluidico. (A) Assemblaggio di una cella di flusso a tre canali in vetro borosilicato. (B) Un collettore per posizionare stabilmente le celle di flusso durante l'incollaggio del connettore. Superiore, la base del collettore in alluminio con sezione incassata di 1 mm per posizionare lateralmente la cella di flusso. I quattro montanti (uno in ogni angolo) guidano il coperchio del collettore in posizione, mentre i bulloni filettati posizionati più centralmente vengono utilizzati per bloccare il coperchio in posizione. Coperchio inferiore, collettore con fori praticati per abbinare i montanti e i bulloni sulla base del collettore. (1), dadi che si attaccano ai bulloni di base del collettore; (2) Molle posizionate tra i dadi e il coperchio del collettore per fornire una leggera tensione durante il processo di incollaggio. (C) Una visione ravvicinata della convergenza dei canali di ingresso in un flusso di fluido singolo comune in una cella di flusso di vetro con connettori già collegati. Un quarto viene posizionato accanto alla cella di flusso come riferimento. (D) Un'immagine della cella di flusso PDMS. Gli strati PDMS hanno uno spessore di 3 mm. (E) Una cella di flusso di silice fusa con connettori luer. (F) Una cella di flusso in vetro borosilicato con connettori press-fit in posizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Caratteristiche del flusso del fluido attraverso una cella di flusso in vetro. (A) Il flusso del fluido all'interno della cella di flusso è laminare. Lo schema mostra la cella di flusso dall'alto per dimostrare che la diffusione intercanale è la principale fonte di miscelazione tra flussi di fluidi adiacenti. La direzione del flusso è indicata da frecce blu e i singoli flussi sono colorati di bianco, grigio chiaro e bianco. Le regioni di diffusione trasversale in allargamento tra i canali sono indicate in rosso. L'inserto mostra un'immagine a fluorescenza di flussi fluidi adiacenti con ingrandimento 10x con complessi di DNA-sfere marcati con fluorescenza nel flusso inferiore e tampone solo nel flusso superiore. Le macchie bianche nel flusso superiore sono rumore ripreso dalla telecamera CCD. (B) Il profilo di flusso (viola chiaro) nelle celle a flusso laminare è parabolico. La cella di flusso è vista lateralmente e la direzione del flusso è indicata sopra ogni cella. Le velocità del fluido più elevate si verificano nella cella di flusso situata al centro, mentre le velocità del fluido più lente si verificano accanto alle superfici della cella di flusso. Di conseguenza, per un complesso DNA-perline intrappolato otticamente posizionato al centro della cellula di flusso, il flusso del fluido estende la molecola di DNA λ del batteriofago (48.504 bp) a 16 μm (forma B) in modo da poter effettuare una chiara visualizzazione (immagine a sinistra). Al contrario, la stessa molecola posizionata vicino alla superficie della cella di flusso sperimenta basse portate e non può essere allungata. (C) Un singolo complesso di sfere di DNA è posizionato all'interno di una cella di flusso. Possono essere utilizzate diverse celle di flusso di profondità ma, in ogni caso, gli allineamenti del fascio possono essere impostati in modo che l'intrappolamento ottimale avvenga 10-20 μm sopra la superficie di copertura, che elimina gli effetti superficiali e ha un flusso stabile in modo che le molecole di DNA possano essere allungate alla forma B. Come indicato nell'immagine a sinistra in (C), il DNA è allungato per consentire una chiara visualizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Controllo del flusso e della reazione del DNA intrappolato otticamente all'interno di una cella a flusso nella fase del microscopio . (A) Accoppiamento della cella di flusso ad una pompa a siringa. Viene presentata una fotografia di una cella di flusso a tre canali collegata a una pompa a siringa tramite valvole di commutazione a tre vie. La cella di flusso è tenuta in posizione su un palcoscenico motorizzato in un microscopio invertito. La cella di flusso è collegata a una linea di scarico (a sinistra) e alle valvole di commutazione (cerchio ciano tratteggiato) tramite tubo arancione da 500 μm (indicato con nastro verde). Le valvole sono montate stabilmente su un collettore costruito su misura adattato all'apparato della pompa a siringa, che ospita siringhe a tenuta di gas da 1 mL (le frecce gialle delimitano gli stantuffi). Le linee di scarico vengono utilizzate per rimuovere le bolle d'aria che possono essere intrappolate nella valvola di commutazione durante il cambio della siringa. (B) Vista ravvicinata della cella di flusso a tre canali. Per facilitare la visualizzazione dei flussi di fluidi, quelli esterni sono stati colorati con colorante alimentare con il flusso centrale contenente solo acqua. La regione ingrandita indica come un complesso di molecole di perline e DNA intrappolato otticamente viene traslato da un flusso fluido al successivo (freccia blu) traslando lo stadio perpendicolarmente al flusso (freccia nera). (C) Schemi delle valvole di commutazione a tre vie con indicazione delle loro posizioni operative. Le designazioni delle lettere F, S e W corrispondono al fluido di direzione e possono fluire rispettivamente verso la cella di flusso, la siringa e i rifiuti. Una porta viene chiusa in modo permanente come indicato dalla spina nera sulla parte superiore di ogni schema. In posizione aperta o operativa (pannello di sinistra), il flusso del fluido passa direttamente attraverso la valvola di commutazione dalla siringa (S) alla cella di flusso (F). In posizione chiusa (pannello di destra), il quadrante viene ruotato in modo che la cella di flusso sia sigillata dall'ambiente. In questa posizione, il flusso è diretto ai rifiuti e le siringhe possono essere commutate senza introdurre bolle d'aria nella cella di flusso. Poiché le valvole hanno un volume morto di 6 μL, viene sprecata pochissima soluzione durante lo spurgo delle linee prima di tornare alla configurazione Open. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Il movimento del tallone e la forza opposta sono influenzati dal flusso del fluido. (A) La velocità lineare del tallone è influenzata dalla velocità della pompa e dalla concentrazione di saccarosio. (B) La forza opposta su un tallone è influenzata dalla viscosità della soluzione. (C) Il diametro del tallone influenza la forza sulle perle sotto flusso. In tutti gli esperimenti sono state utilizzate perline fluorescenti (verde drago). In (A) e (B) sono state utilizzate perle di diametro di 0,97 μm e in (C) sono state utilizzate perle di diametro diverso. Le soluzioni di saccarosio sono state realizzate in acqua ultrapura, filtrate attraverso filtri da 0,2 μm e l'indice di rifrazione misurato utilizzando un rifrattometro portatile, con viscosità determinata in centipoise utilizzando le tabelle ISCO e infine convertita in unità SI in mPa.s. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Portata (μL/h)b | Tempo per passo (min) | Volume erogato (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 o più | 1 o più |
| un. Si tratta di portate di fluido calcolate dal software della pompa a siringa e sono uniche per ogni diametro della siringa utilizzata. Le portate consentono un rapido riempimento delle linee e della camera di flusso (800 μl/h), seguito da una graduale diminuzione della portata ideale per l'intrappolamento e la visualizzazione | ||
| b. La pompa a siringa può essere controllata dalla tastiera o utilizzando il software fornito dal fornitore. | ||
Tabella 1: Portate del fluido per ridurre al minimo le bolle e ottenere un intrappolamento stabile.
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Discussion
L'assemblaggio accurato del sistema di flusso è fondamentale per il buon esito degli esperimenti 4,6. Uno degli aspetti più impegnativi del protocollo è il fissaggio dei connettori alla superficie del vetro. Per questo, utilizziamo i seguenti due approcci: connettori per tubi press-fit e assemblaggi nanoport. I connettori press-fit aderiscono facilmente al vetro seguiti dalla spinta dei tubi in PTFE nei fori preformati utilizzando una pinza. Quando è richiesto un attacco più stabile, è preferibile l'incollaggio di assemblaggi nanoport. Con un uso e una pulizia accurati, una singola cella di flusso in vetro con assemblaggi permanenti può essere utilizzata per più di 1 anno. Se le celle di flusso devono essere sostituite più frequentemente, le celle a flusso PDMS possono essere utilizzate in quanto sono un'alternativa eccellente ed economica. Possono essere riutilizzati ma il PDMS è suscettibile al gonfiore, che può alterare il comportamento del flusso del fluido nel tempo.
Sia le celle di flusso in vetro che quelle PDMS non sono indistruttibili. In laboratorio, la portata massima utilizzata è di 800 μL/h. Se questo viene superato giornalmente e/o per lunghi periodi di tempo, possono verificarsi deformazioni delle celle di flusso (celle di flusso in vetro) e distorsione del PDMS. Mentre la procedura di bagnatura iniziale con metanolo e acqua richiede tempo, ne vale la pena poiché tutte le bolle vengono eliminate e anche le perdite ai connettori possono essere rilevate. Le celle a flusso qui descritte forniscono flessibilità agli esperimenti in corso. Utilizzando questi approcci di diverse celle di flusso, tubi e attacchi di diversi connettori, le condizioni sperimentali possono essere facilmente adattate e rapidamente ottimizzate per garantire l'ottenimento di dati ottimali. Vengono presentate celle di flusso a canale a forma di Y, ma una vasta gamma di dispositivi microfluidici è disponibile da più aziende sia senza che con connettori collegati. Ciò fornisce allo sperimentatore una flessibilità ancora maggiore nella progettazione sperimentale.
L'uso di valvole di commutazione a quattro vie è un metodo semplice ed efficace che garantisce che una volta assemblato e testato il sistema di flusso, diventi effettivamente un ambiente chiuso, dove la contaminazione è minima e le bolle vengono eliminate. Quest'ultimo è fondamentale in quanto le bolle tendono a comprimere e decomprimere casualmente durante un esperimento e questo perturba il flusso del fluido causando il movimento delle molecole di DNA intrappolate in modi inaspettati e persino la rottura. È necessario prestare molta attenzione per assicurarsi che si impedisca la formazione nel sistema.
Infine, il sistema qui descritto è ottimizzato per la biochimica visiva in cui è possibile eseguire un'attenta analisi del DNA, delle perle attaccate alle proteine o delle proteine marcate con fluorescenza. Sebbene il sistema non sia progettato per eseguire misurazioni della forza con le doppie trappole e l'aggiunta di fotorivelatori a quadrante, le forze possono essere misurate attaccando perline di diverso diametro alle proteine del motore del DNA, ad esempio, e chiedendo al motore di tirare questa perla contro il flusso del fluido. Variando la viscosità della soluzione, il flusso del fluido e il diametro del tallone, è possibile applicare un'ampia gamma di forze opposte per fornire informazioni dettagliate sulla funzione delle proteine motorie (Figura 5). Questo è un modo semplice ed economico per misurare le forze associate alle transazioni biologiche, ma manca della precisione associata ad approcci più sensibili. Quando l'approccio biochimico visivo è combinato con metodi di rilevamento della forza sensibile, è possibile fornire immagini più complete delle reazioni biochimiche.
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Disclosures
L'autore non dichiara conflitti di interesse.
Acknowledgments
La ricerca nel laboratorio Bianco è supportata dalle sovvenzioni NIH GM100156 e GM144414 a P.R.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
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