Summary
ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.
Abstract
ביוכימיה חזותית היא טכניקה רבת עוצמה להתבוננות בתכונות הסטוכסטיות של אנזימים בודדים או קומפלקסים של אנזימים המוסתרים בממוצע המתרחש במחקרים בתפזורת. כדי להשיג הדמיה, פינצטות אופטיות כפולות, שבהן מלכודת אחת קבועה והשנייה ניידת, ממוקדות בערוץ אחד של תא מיקרופלואידי מרובה זרמים הממוקם על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הפינצטה האופטית לוכדת מולקולות בודדות של דנ"א מסומן פלואורסצנטי וזרימת נוזלים דרך החדר ומעבר לחרוזים הלכודים, מותחת את הדנ"א לצורת B (תחת כוח מינימלי, כלומר 0 pN) כאשר חומצת הגרעין נצפית כחוט לבן על רקע שחור. מולקולות דנ"א מועברות מזרם אחד למשנהו, על ידי תרגום השלב הניצב לזרימה כדי לאפשר ייזום תגובות באופן מבוקר. כדי להשיג הצלחה, התקנים microfluidic עם ערוצים ברורים אופטית מחוברים מזרקי זכוכית מוחזקים במקום משאבת מזרק. תוצאות אופטימליות משתמשות במחברים המחוברים באופן קבוע לתא הזרימה, צינורות קשיחים מכנית ועמידים כימית, ואשר מחוברים לשסתומי מיתוג המסלקים בועות האוסרות על זרימה למינרית.
Introduction
היכולת לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ"א ברמת המולקולה הבודדת ובזמן אמת סיפקה תובנה משמעותית לגבי יציבות הגנום 1,2. בנוסף לעבודה עם מולקולות בודדות של דנ"א בזו אחר זו, היכולת להציג עסקאות בין מולקולות בודדות בקרבת מקום מספקת תובנה נוספת 3,4,5. המניפולציה של מולקולות דנ"א נוספות דורשת הן מלכודות אופטיות נוספות והן תאי זרימה מיקרופלואידית איכותיים, רב-ערוציים,6.
קיימות מספר שיטות ליצירת יותר ממלכודת אופטית אחת. אלה כוללים מראות סריקת גלוונומטר, מודולטורים אופטיים אקוסטיים ואופטיקה דיפרקטיבית, המייצרים פינצטה אופטית הולוגרפית 4,7,8,9. לעתים קרובות, מראות סורקות ומודולטורים אופטיים אקוסטיים מייצרים מלכודות המשותפות בזמן. במערך המתואר כאן, הקרן של לייזר Nd:YAG יחיד מפוצלת על קיטוב, ואז מראות סריקת לייזר גלוונומטר שולטות במיקום של מה שמכונה מלכודת ניידת (איור 1)4. כדי להקל על מיקום המראות והמסננים כדי לכוון את קרן הלכידה למפתח הצמצם האחורי של מטרת המיקרוסקופ, נעשה שימוש בלייזר HeNe. זה הופך את היישור הכללי לקל יותר מכיוון שקרן HeNe נראית לעין בלתי, בעוד שקרני אינפרא אדום אינן. קרן HeNe גם בטוחה יותר לעבודה עם הפיכת המיקום של מראות ורכיבים אחרים לפחות מלחיץ. בתחילה, נתיב הקרן עבור לייזר זה נפרד מן הקרן 1064 ננומטר, אבל הוא הציג לתוך אותו נתיב קרן, ולאחר מכן לתוך מטרת המיקרוסקופ. לאחר השגת יישור פיזי, נעשה מיקום קרן 1064 ננומטר על גבי קרן HeNe וזה מתאפשר על ידי שימוש בצופה אינפרא אדום ובכלי הדמיית קרן שונים כדי לדמיין את מיקום הקרן ואיכותה. לאחר מכן, מרחיב הקרן מוצג, וקרן האינפרא אדום המורחבת המתקבלת מיושרת על הפתח האחורי של המטרה. לבסוף, המטרה מוסרת והעוצמה בכל קרן מקוטבת נמדדת ומותאמת באמצעות לוחות גל λ/2 כדי להיות שווים (איור 1C). מדידות הספק נעשות גם לאחר החזרת המטרה ובדרך כלל יש אובדן הספק של 53%. עם זאת, יש מספיק כוח כדי ליצור מלכודות אופטיות קבועות ונעות יציבות במישור המוקד (איור 1D).
כדי לדמות עסקאות דנ"א, תאי זרימה מיקרופלואידיים ממלאים תפקיד מפתח כשהם מאפשרים מדידות מבוקרות ברמת המולקולה הבודדת עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה (איור 2). המונח microfluidic מתייחס ליכולת לתפעל נוזלים בערוץ אחד או יותר עם ממדים הנעים בין 5-500 מיקרומטר10,11. המונח זרם מתייחס לנוזל בפועל בתוך ערוץ והערוץ מתייחס לערוץ הפיזי שבו זרם זורם או זרמים נעים. לתכנון תא זרימה חד-ערוצי יש ערוץ פיזיקלי משותף שבו נצפות תגובות, ובדרך כלל קיים רק זרם נוזל אחד. לפיכך, עיצובים אלה ידועים כתאי זרימה חד-זרמיים. לעומת זאת, תאי זרימה מרובי זרמים מוגדרים כמכשיר מיקרופלואידי שבו שני ערוצי כניסה או יותר מתכנסים לערוץ פיזיקלי יחיד ומשותף (איור 2A). בתוך הערוץ המשותף, הזרמים הזורמים שמקורם בערוצים הבודדים זורמים במקביל זה לזה, ונותרים מופרדים כאשר הערבוב המינימלי ביניהם מתרחש רק כתוצאה מדיפוזיה (איור 2B). ברוב המערכות הניסיוניות, משאבה אחת דוחפת נוזלים לכל ערוץ באותה מהירות. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בהיגוי גבול, שלוש משאבות או יותר, הנשלטות באופן עצמאי, דוחפות נוזלים דרך התעלות. עם זאת, כל משאבה פועלת במהירות שונה אך קצב הזרימה נטו בערוץ המשותף הואקבוע 12. זה מאפשר החלפה מהירה של רכיבי הערוץ הראשי פשוט על ידי שינוי מהירות המשאבה.
בנוסף לזרימה הלמינרית, גורם קריטי נוסף הוא פרופיל המהירות הפרבולית בתוך זרם הנוזל הלמינרי. מהירות הזרימה הגבוהה ביותר מתרחשת באמצע הנחל, והאיטית ביותר מתרחשת ליד המשטחים (איור 2C)13. יש לשקול פרופיל זה כדי למתוח באופן מלא מולקולת דנ"א המחוברת לחרוז המוחזק בזרם לצורך הדמיה מדויקת של דנ"א פלואורסצנטי וניתוחים מדויקים של מולקולה בודדת. כאן, הדנ"א נמתח לצורת B ומוחזק במקומו תחת 0 pN של כוח. כדי להשיג זאת, המיקוד של מיקום ההשמנה האופטית צריך להיות במיקום של 10-20 מיקרומטר ממשטח הכיסוי התחתון (איור 2D). יש להקפיד על כך שמולקולת הדנ"א לא תימתח מעבר לצורת B, שכן הדבר עלול לעכב תגובות אנזימיות. בתנאי חיץ טיפוסיים, 1 מיקרומטר = 3,000 bp של DNA14. יתר על כן, על ידי לכידת 10-20 מיקרומטר מהכיסוי, קומפלקס הדנ"א ממוקם הרחק מפני השטח ובכך ממזער את האינטראקציות על פני השטח.
שיטות רבות שימשו ליצירת ערוצי התקנים מיקרופלואידיים וניתן לעשות זאת במעבדה או לרכוש תאי זרימה ממקורות מסחריים 6,15,16,17. החומרים האופטימליים המשמשים לבניית תאי הזרימה חייבים להיות קשיחים מכנית, שקופים אופטית עם פלואורסצנטיות נמוכה, ואטומים לממיסים אורגניים6. לעתים קרובות, זכוכית צפה בורוסיליקט, או סיליקה מתמזגת משמשים כדי לספק סביבת זרימה יציבה לזמן ממושך המתאימה להשמנה אופטית, הדמיה וזיהוי כוח. חומרים אלה מאפשרים גם שימוש בממיסים לא מימיים (למשל, מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית) כדי לפשט את ההרטבה וההסרה של בועות אוויר, ודנטורנטים (למשל, 6M guanidinium hydrochloride) או דטרגנטים לניקוי תא הזרימה. לבסוף, השיטות המשמשות להחדרת נוזלים לתאי זרימה משתנות ממערכות משאבות ואקום מורכבות למשאבות מזרק יחיד 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. בגישה המתוארת כאן, נעשה שימוש במשאבת מזרק שיכולה להכיל עד 10 מזרקים (איור 3A). הדבר מספק גמישות לשימוש בתאי זרימה חד-ערוציים או בתאי זרימה עם ערוצי כניסה מרובים. כאן נעשה שימוש בתא זרימה בעל שלושה ערוצים, והוא מחובר למזרקים המוחזקים במקומם על משאבת המזרק באמצעות צינורות פולי-אתר-אתר-קטון (PEEK) (איור 3A-C). זרימת הנוזלים נשלטת על-ידי שסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים, ולכן היא משמשת למזעור החדרת בועות לתא הזרימה (איור 3A,D). בנוסף, מזרקי המילטון בעלי דפנות זכוכית נוקשות ובוכנות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן (PTFE), מומלצים מכיוון שהם מספקים תנועת בוכנה חלקה במיוחד החיונית להשגת זרימה חלקה14,27.
במערכת הניסוי המתוארת נעשה שימוש בתאי זרימה עם שניים עד חמישה ערוצי כניסה. מספר ערוצי הכניסה מוכתב על ידי הניסוי שנעשה. לצורך המחקר של RecBCD ו- Hop2-Mnd1, שני ערוצי זרם היומספיקים 14,28. עבור ההליקאז, האנזים נקשר לקצה החופשי של הדנ"א ותורגם לזרם המכיל מגנזיום ו-ATP כדי ליזום טרנסלוקציה ושחרור. עבור Hop2-Mnd1, דנ"א לכוד אופטית תורגם לזרם הנוזלים הסמוך המכיל חלבונים וחיץ ± יוני מתכת דיוולנטיים. השימוש בתאי זרימה תלת-ערוציים מאפשר ללכוד דנ"א בזרם 1, לתרגם את הדנ"א לזרם 2 כדי לאפשר קשירת חלבונים, ולאחר מכן להזרים 3 היכן ש-ATP נמצא, למשל, כדי ליזום תגובות. וריאציה על האמור לעיל היא להשתמש בחלבון מתויג פלואורסצנטי בערוץ 2, מה שגורם לזרם הנוזלים להיות לבן לחלוטין ומונע הדמיה של הדנ"א. כאשר מולקולה זו מתורגמת לזרם 3, גם חלבונים וגם דנ"א נראים כעת כאשר מתחילות תגובות.
השימוש בשסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים לשליטה בזרימת הנוזלים הוא מרכיב קריטי במערכת לסילוק בועות בתאי הזרימה. בועות מזיקות לזרימת נוזלים יציבה כאשר הן מתכווצות ומתרחבות בדרכים בלתי צפויות וכתוצאה מכך שינויים מהירים במהירות הזרימה והכנסת מערבולות. כאשר השסתומים ממוקמים בין מזרקים וצינורות כניסה, נתיב הזרימה מנותק על ידי החלפת מיקום השסתום כאשר מזרקים מוחלפים. כאשר מזרק חדש הוא הניח במקום, הבוכנה יכולה להיות מדוכאת באופן ידני כך >6 μL נפלט (נפח מת של השסתום) וזה מבטל בועות כמעט לחלוטין.
החיבור של מחברים לתאי זרימה הוא לעתים קרובות השלב המגביל את הקצב בשימוש בתאי זרימה. אנו מתארים את השימוש בשני סוגים של מחברים: נשלפים המכונים התאמה לעיתונות וקבועים (מכללי ננו-פורט). המחברים הנשלפים פשוטים להיצמד לתא זרימה וניתן לבדוק סוגים שונים של צינורות גמישים בנוסף ל- PTFE המומלץ עם מחברים אלה. זוהי דרך מהירה וחסכונית לבדוק צינורות ומחברים מבלי להקריב תאי זרימת זכוכית יקרים יותר. לעומת זאת, מכלולי ננו-פורט מחוברים באופן קבוע, עומדים בלחצים של עד 1,000 psi, ובידינו השימוש בהם מוגבל לצינורות PEEK בקטרים שונים. זה לא חיסרון שכן עדיף להשתמש בצינורות PEEK. תא זרימת זכוכית יחיד עם מכלולים קבועים מחוברים ניתן לעשות שימוש חוזר במשך יותר משנה עם שימוש זהיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יישור מלכודת לייזר ובדיקה עם חרוזי פוליסטירן
הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 1A,B.
התראה: על הנסיין להרכיב משקפי מגן מתאימים או משקפי בטיחות לייזר במהלך יישור קרן לייזר. מכיוון שמערכת הפינצטה האופטית המתוארת כאן משתמשת הן באלומות HeNe והן באלומות IR, נדרשים שני סטים נפרדים של כלי זכוכית בטיחותיים ללייזר.
- יישור קרן HeNe
- מקם את כל הרכיבים האופטיים על לוח הלחם. יישרו את לוח הלחם כך שיהיה קרוב ככל האפשר לזווית של 90° ביחס למיקרוסקופ.
- חברו את צינור ההזדווגות המכיל את המטרה ואת עדשת הטלאן למיקרוסקופ (איור 1A-11,12).
הערה: עדשת הטלאן היא מערכת עדשות המשמשת למיקוד התמונה במישור התמונה הבינוני בעיניות. - הפעל את לייזר HeNe ופתח את התריס (איור 1A-18). הקרן צריכה לפגוע במסנן (איור 1A-3) בגובה של 54 מ"מ המשקף 50% מהאור על מראה 5 (איור 1A-5). 50% הנותרים של הקרן פוגעים במראה 4 (איור 1A-4) באותו גובה כמו מראה 3.
- התאימו את המראה 4 (איור 1A-4) כך שהקרן תפגע במראה 6 (איור 1A-6) בגובה של 51 מ"מ.
- כוונן את המראה 6 (איור 1A-6) כך שהקרן תופנה למראה הגלוונית התחתונה בגובה של 51 מ"מ. הקורה היוצאת מהמראה הגלוונית העליונה תהיה בגודל 57.5 מ"מ.
- התאימו את המראה 3 (איור 1A-3) כך שקרן זו תפגע במראה 5 (איור 1A-5) בגובה של 57.5 מ"מ. לאחר שהיא משתקפת ממראה 5, הקרן צריכה להכות במראה 9 (איור 1A-9) באותו גובה. הקרן מתמזגת למעשה במראה 9, עוברת דרך המטרה, ומערכת עדשות טלאן אל מראה 21 (איור 1A-21), אשר משקפת אותה לתוך המטרה.
- הניחו שקופית מיקרוסקופ נקייה על במת המיקרוסקופ. הפעל את המצלמה וצלם את הקורות של הקורות הקבועות והסורקות בנפרד על המסך. החל ממראה 3, לאחר מכן 5 ו -9, ולבסוף 21, בצע התאמות קטנות כדי למקם את הקרן הקבועה במרכז המסך.
- כדי להבטיח שזווית היציאה מקרן 21 תהיה 90°, שנה את גובה Z של המיקרוסקופ ומקם את הקרן המצולמת על המשטחים העליונים והתחתונים של המגלשה. כאשר הם זהים, הקרן נמצאת במיקום הנכון, אשר בניצב לבמה. צמצם קרן זו באמצעות תריס 19 (איור 1A-19).
- החל ממראות 4 ו-6, בצעו התאמות קטנות כדי למקם את הקורה הקבועה במרכז המסך. תריס את הקורה הזו.
- יישור קרן אינפרא אדום (IR)
התראה: בצע את כל השלבים בעוצמת לייזר נמוכה מטעמי בטיחות.- התאם את לוח הגלים 14 (איור 1A-14) כדי להתאים את היחס בין האלומות המועברות והמשתקפות המפוצלות במפצל הקרן 2 (איור 1A-2). מפצל קרן 2 משקף את רכיב ה-s של קרן הלייזר ומעביר את רכיב ה-p.
- הקרן שעוברת דרך 2 פוגעת במראה 7 (איור 1A-7), מה שמסיט את הקרן אל המראה הגלוונית התחתונה. זה צריך ללכת בדרך של קרן HeNe אל מראה 21. בצע תנועות קטנות של מראה 7 כדי להשיג מיקום זה.
- כוונן את מראה 2 כך שהקרן המשתקפת על-ידי מראה 2, תפגע במראה 10 (איור 1A-10) בגובה של 57.5 מ"מ.
- הקרן משתקפת ממראה 10 אל מראה 8 (איור 1A-8) בגובה של 57.5 מ"מ. הקורה הבאה צריכה להכות במראה 9 באותו גובה. אם לא, בצע התאמות קטנות למראות 10 ו- 8 כנדרש.
- הסר את המטרה והנח את ראש מד הכוח מעל היציאה בצריח המטרה.
- השתמשו בלוחות 14, 15 ו-16 (איור 1A-14,15,16) כדי להתאים את העוצמה של כל קרן לייזר כך שתהיה שווה כפי שמוצג באיור 1C.
- שים את מרחיב הקרן 1 (איור 1A-1) במקומו. התאם את קרן הלייזר המורחבת כך שתהיה מעגלית ללא כל תרדמת או אסטיגמציה.
- כדי לבדוק את המלכודות האופטיות, צור פתרון של חרוזי פוליסטירן 1 מיקרומטר התלויים במים. לאחר מכן, הניחו 10 מיקרוליטר של תמיסה זו על שקופית מיקרוסקופ, הניחו כיסוי על גביו ואטמו עם לק. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ ובדוק את המלכודות האופטיות על ידי לכידת חרוזים אלה של 1 מיקרומטר. ודא כי החרוזים נשאבים לתוך המלכודות ומוחזקים ביציבות כאשר הבמה מועברת. ההשמנה צריכה להתרחש ביעילות שווה מכל צידי המלכודת.
2. הכנת תא מיקרופלואידי
- אם תא הזרימה הוא התקן שנבנה באופן מסחרי העשוי מפולידימתילסילוקסן (PDMS) על גבי כיסוי, המשך לשלב 3. אם זהו התקן זכוכית עם מחברים מחוברים, המשך לשלב 4.
- אם לתא הזרימה אין מחברים מחוברים, חברו אותם תחילה לחורי הכניסה בשקופית המיקרוסקופ. עיין בשלב 3 לקבלת השלבים לחיבור מחברים.
3. חיבורי תאי זרימה באמצעות תא זרימה PDMS
הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2D.
- הנח את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי. החזק את צינורות ה- PTFE 3 מ"מ מהקצה החופשי עם מלקחיים. דחפו את הצינורות לתוך היציאה המוכנה מראש (היציאה יכולה לתמוך בלחץ של 2 קווי בר).
- חזור על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות. חברו את יציאות הכניסה למשאבת המזרק ולשקע לבקבוק פסולת (איור 4A,B).
- מלאו כל מזרק זכוכית ב-1 מ"ל של מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית. חבר כל מזרק לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לשקע לפסולת וטהר כל קו עם 50 μL של מתנול (איור 4C, מיקום סגור).
- העבר את מיקום היציאה לתא הזרימה (איור 4C, מיקום פתוח). יש לשאוב 800 μL של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 μL/h כדי להרטיב את המשטחים ולסלק בועות.
- למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 μL של מים אולטרה-טהורים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש.
4. חיבור של מחברי צינורות מתאימים לעיתונות
הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2F.
- אם יש להשתמש במחברי צינורות המתאימים ללחיצה, הסר בזהירות את סרט ההדבקה מצד אחד של המחבר והנח אותו מעל החור בשקופית המיקרוסקופ. לחץ כלפי מטה למשך מספר שניות. חזור על התהליך עבור המחברים הנותרים.
- הנח את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי. החזק את צינורות ה- PTFE 3 מ"מ מהקצה החופשי עם מלקחיים. דחפו את הצינורות לתוך החור המוכן מראש ביציאה וחזרו על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות.
- חברו צינורות מהכניסות לשסתומי המיתוג. המשך לשלב 7.
5. צירוף מכלולים קבועים
הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2A-C.
- בצע את החיבור על משטח נקי ושטוח או על סעפת שנבנתה בהתאמה אישית כדי להחזיק את תא הזרימה והמחברים במקומם בזמן ההדבקה.
- הניחו את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי או בחלק השקוע של הסעפת (איור 2B). מניחים כמות קטנה של דבק זכוכית בתחתית המכלול ומכניסים את האטם.
- מקם את הננו-יציאה מעל אחד מחורי הכניסה בשקופית המיקרוסקופ. יש לדחוף בעדינות כלפי מטה ולהחזיק במקומם ללא תזוזה לרוחב. חזור על התהליך עבור היציאות הנותרות.
- אפשר להתייבש או להדק במקומו בסעפת. הסר בעדינות את תא הזרימה מהסעפת וודא שהמכלולים מתיישרים היטב עם יציאות הכניסה בתא הזרימה. המשך לשלב 7 כשתהיה מוכן.
6. חיבורי תאי זרימה והכנה
הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 4A,B.
- מניחים תא זרימה על במת המיקרוסקופ. חבר את הצינורות באמצעות המחברים ההדוקים לאצבעות.
- מלאו כל מזרק זכוכית ב-1 מ"ל של מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית. חבר כל מזרק לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לשקע לפסולת וטהר כל קו עם 50 μL של מתנול (איור 4C, מיקום סגור).
- העבר את מיקום היציאה לתא הזרימה (איור 4C, מיקום פתוח). יש לשאוב 800 μL של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 μL/h כדי להרטיב את המשטחים ולסלק בועות.
- למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 μL של מים אולטרה-טהורים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש.
7. שליטה על זרימת הנוזלים
- סובבו את שסתומי המיתוג למצב סגור (איור 4C). הסר את המזרקים, להשליך את המים שיורית, ולמלא את המזרקים עם פתרונות ניסיוניים, למשל, חרוזי DNA; אנזים; ו-ATP. החזירו מזרקים למשאבה וחברו אותם לשסתומי המיתוג.
- במצב זה, כפו ידנית את הבוכנות כלפי מטה 5-10 μL כדי להסיר בועות. שנה את מיקום שסתום המיתוג לפתיחה.
- השתמש בסכמת קצב הזרימה כדי להשיג מהירות זרימה זורמת אופטימלית להשמנה ולתצוגה חזותית כמתואר בטבלה 1. זרימת הנוזל האופטימלית להשמנה אופטית אמורה לאפשר לכידה יציבה של חרוזים וברגע שהדנ"א נמתח, הוא צריך להיות בצורת B (~3,000 bp/μm).
8. לכידת חרוזי פוליסטירן עם מולקולות DNA בודדות מחוברות
- בהגדלה של 10x, אתר את הגבול בין זרמי נוזלים קרוב לנקודות הכניסה של הערוץ. הוסיפו שמן ליעד 100x ועברו להגדלה הגבוהה יותר.
- פתח את התריסים להשמנות האופטיות (שתיהן או אחת בכל פעם). קרני הלייזר הממוקדות צריכות ללכוד חרוזים והדנ"א צריך להימתח מיד.
- לאחר לכידת קומפלקס, תרגם את השלב הניצב לזרימה (איור 3A,C, inset). פעולה זו תעביר את הקומפלקס הלכוד מתמיסת חרוזי הדנ"א, לזרם 2. תרגום נוסף יעביר את המתחם לזרם 3.
9. ניקוי תאי זרימה
הערה: יש לבצע זאת מדי יום.
- כבו את המשאבה בסיום הניסוי. סובבו את שסתומי המיתוג למצב סגור (איור 4C).
- מוציאים מזרקים ומרוקנים אותם. יש לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים מסוננים.
- ממלאים את המזרקים בתמיסת ניקוי. מניחים מזרקים במשאבה ומתחברים לשסתומי מיתוג.
- נקה שסתומי מיתוג ושנה את המיקום לפתיחה. יש לשאוב תמיסת ניקוי 800 μL בקצב זרימה של 100 μL/h בדרך כלל במהלך הלילה.
- למחרת, סגור את שסתומי המיתוג, ולאחר מכן להסיר ולשטוף מזרקים עם מים. יש לשטוף את תא הזרימה והקווים עם 4-800 μL של מים בקצב זרימה של 400-800 μL/h. אם נדרש ניקוי מאומץ יותר של תאי זרימה, החלף את תמיסת הניקוי עם 6 M גואנידיום הידרוכלוריד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבדיקה הראשונית של יישור וחוזק המלכודת נעשית עם 1 μm, חרוזי פוליסטירן שאינם פלואורסצנטיים. מאחר שרוב המחקר שנעשה במעבדה משתמש בפלואורסצנציה, אנו בודקים עוד יותר את חוזק המלכודת באמצעות 1 מיקרומטר, חרוזי פוליסטירן ירוק דרקון (איור 1D,E). לאחר מכן העבודה משתנה להשמנה אופטית של קומפלקסים של חרוזי דנ"א שבהם הדנ"א מוכתם בצבע הביס-אינטרקלציה YOYO-1 14,29. כאשר קומפלקסים אלה נלכדים 10-15 מיקרומטר מעל פני השטח של הכיסוי בתא זרימה מיקרופלואידי, זרימת הנוזל על פני החרוז מותחת את הדנ"א (איורים 3B,C). חשוב למדוד את אורך הדנ"א המתוח בנוזל כדי לוודא שהוא נמתח לאורך צורת B שלו, שהוא האורך הצפוי. לדוגמה, עבור דנ"א של בקטריופאג' למבדה, האורך המלא ארוך מעט מ-16 מיקרומטר, המקביל ל-48,504 bp14.
כדי לאפיין את זרימת הנוזלים, חרוזים פלואורסצנטיים הוכנסו לתאי זרימה עם גובה מיקוד של 15 מיקרומטר מעל פני השטח באמצעות מהירויות משאבה שונות ובתמיסות בעלות צמיגות שונה. סרטים של מיקום חרוזים צולמו, ומיקום החרוזים היה במעקב באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. התוצאות מראות כי עבור חרוזים בקוטר 1 מיקרומטר, ניתן לעקוב במדויק אחר מהירות ליניארית בקצב זרימת משאבה של 100 μL/h בתמיסות סוכרוז הנעות בין 10%-50% (איור 5A). בתנאים דומים, ניתן לחשב את הכוח על החרוז ולמצוא שהוא נע בין 10 ל-400 pN, בהתאם לקצב זרימת המשאבה וצמיגות התמיסה (איור 5B). לבסוף, ההשפעה של קוטר חרוז נע בין 120 ל 970 ננומטר על כוח הוערכו בריכוזים שונים של סוכרוז. הנתונים מגלים שניתן למדוד כוחות הנעים בין 1-27 pN על-ידי הצמדת חרוזים בקוטר שונה לחלבון מוטורי ובקשה מהמנוע למשוך את החרוז כנגד זרימת הנוזל (איור 5C).
איור 1: פריסה אופטית והדגמה של פעילות השמנה . (A) סכמת הפריסה האופטית עם קרן IR באדום וקרן HeNe בשחור. (B) תצלום של רכיבים אופטיים המותקנים על לוח לחם. מספרי הרכיבים בלוחות A ו- B הם כדלקמן: 1), מרחיב קרן; 2), מראה הפרעה (Rsמקסימום = 1064 ננומטר; Tpמקסימום = 1064 ננומטר); 3), מראות הפרעה (633 ננומטר; R = 50%; T = 50%); 4-6), מראות הפרעה (Rמקסימום = 633 ננומטר); 7), מראה הפרעה (Rמקסימום = 1064 ננומטר; Tמקסימום= 633 ננומטר); 8), מראה הפרעה (Rsמקסימום = 1064 ננומטר; Tp מקסימום = 1064 ננומטר, Tמקסימום = 633 ננומטר); 9), מראה הפרעה (Rמקסימום = 1064 ננומטר, 633 ננומטר; Tמקסימום = 1064 ננומטר, 633 ננומטר); 10), מראה הפרעה (Rמקסימום = 1064 ננומטר); 11), עדשה אובייקטיבית, f = 110 ננומטר; 12), עדשת טלן; 13), מראות גלווניות; 14-16), רוטטורים (/2); 17), תריס ערוץ סריקת IR; 18), תריס ערוץ גלוי; 19), תריס ערוץ קבוע IR; 20), עצירות קרן ו-21), מראה הפרעה (Rמקסימום = 1064 ננומטר; Tמקסימום = 633 ננומטר). (C) מדידת תפוקת החשמל. תפוקת ההספק מהלייזר נמדדת לפני התקנת ראש הלייזר בפריסה האופטית. לאחר ביצוע יישור ההשמנה, עוצמת הקרן נמדדת לאחר המטרה של פי 100 עבור כל מלכודת. (D) ו-(E) תמונות המדגימות השמנה אופטית יציבה של חרוזי פלואורסצנט של 1 מיקרומטר. F, השמנה קבועה ו-M, השמנה ניידת כאשר המלכודת הניידת במצב סריקה נעה דרך מעגל קטן (D) או גדול (E) במהירות של 30 מגה-הרץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תאי זרימה מיקרופלואידיים. (A) הרכבה של תא זרימה בעל שלושה ערוצים העשוי מזכוכית בורוסיליקט. (B) סעפת למיקום יציב של תאי זרימה במהלך הדבקת המחברים. החלק העליון, הבסיס של סעפת האלומיניום עם קטע שקוע 1 מ"מ כדי למקם לרוחב את תא הזרימה. ארבעת העמודים (אחד בכל פינה) מנחים את מכסה הסעפת למקומו, בעוד שהברגים המוברגים הממוקמים במיקום מרכזי יותר משמשים להידוק המכסה למקומו. תחתון, מכסה סעפת עם חורים קדוחים כדי להתאים את העמודים והברגים על בסיס סעפת. (1), אומים המתחברים לברגי הבסיס המניפולטיביים; (2) קפיצים הממוקמים בין האגוזים למכסה המניפולטיבי כדי לספק מתח קל בתהליך ההדבקה. (C) מבט מקרוב על התכנסות תעלות הכניסה לזרם נוזל יחיד משותף בתא זרימה מזכוכית עם מחברים שכבר מחוברים. רבע ממוקם ליד תא הזרימה כהפניה. (D) תמונה של תא הזרימה PDMS. עובי שכבות PDMS הוא 3 מ"מ. (E) תא זרימה סיליקה מתמזג עם מחברי luer. (F) תא זרימה מזכוכית בורוסיליקט עם מחברים המתאימים ללחיצה במקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מאפייני זרימת נוזלים דרך תא זרימה מזכוכית. (A) זרימת הנוזל בתוך תא הזרימה היא למינרית. הסכימה מראה את תא הזרימה מלמעלה כדי להדגים כי דיפוזיה בין תעלות היא המקור העיקרי לערבוב בין זרמי נוזל סמוכים. כיוון הזרימה מסומן על ידי חצים כחולים והזרמים הבודדים צבועים בלבן, אפור בהיר ולבן. האזורים המתרחבים של דיפוזיה רוחבית בין ערוצים מסומנים באדום. הכניסה מציגה תמונה פלואורסצנטית של זרמי נוזלים סמוכים בהגדלה של פי 10 עם קומפלקסים של חרוזי דנ"א המסומנים בפלואורסצנט בזרם התחתון ומאגר רק בזרם העליון. הכתמים הלבנים בזרם העליון הם רעש נורה ממצלמת CCD. (B) פרופיל הזרימה (סגול בהיר) בתאי זרימה למינרית הוא פרבולי. תא הזרימה מוצג מהצד וכיוון הזרימה מצוין מעל כל תא. מהירויות הנוזל המהירות ביותר מתרחשות בתא הזרימה הממוקם במרכז בעוד שמהירויות הנוזל האיטיות ביותר מתרחשות ליד משטחי תא הזרימה. כתוצאה מכך, עבור קומפלקס דנ"א-חרוזים לכוד אופטית הממוקם במרכז תא הזרימה, זרימת הנוזל מותחת את מולקולת ה-DNA של בקטריופאג' λ (48,504 bp) עד 16 מיקרומטר (צורת B) כך שניתן לבצע הדמיה ברורה (תמונה שמאלית). לעומת זאת, אותה מולקולה הממוקמת בסמוך לפני השטח של תא הזרימה חווה קצבי זרימה נמוכים ולא ניתן למתוח אותה. (C) קומפלקס חרוזי דנ"א יחיד ממוקם בתוך תא זרימה. ניתן להשתמש בתאי זרימת עומק שונים, אך בכל מקרה, ניתן להגדיר את יישור הקרן כך שהשמנה אופטימלית מתרחשת 10-20 מיקרומטר מעל פני השטח, מה שמבטל את השפעות פני השטח ויש לו זרימה יציבה כך שניתן למתוח מולקולות DNA לצורת B. כפי שמצוין בתמונה השמאלית ב-(C), הדנ"א נמתח כדי לאפשר הדמיה ברורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: בקרת זרימה ותגובה של דנ"א כלוא אופטית בתוך תא זרימה בשלב המיקרוסקופ . (A) הזדווגות של תא הזרימה למשאבת מזרק. מוצג תצלום של תא זרימה תלת-ערוצי המחובר למשאבת מזרק באמצעות שסתומי מיתוג תלת-כיווניים. תא הזרימה מוחזק במקומו על במה ממונעת במיקרוסקופ הפוך. תא הזרימה מחובר לקו פסולת (משמאל) ושסתומי מיתוג (עיגול ציאן מקווקו) באמצעות צינורות כתומים, 500 מיקרומטר (מסומנים בסרט ירוק). השסתומים מותקנים ביציבות על סעפת שנבנתה בהתאמה אישית המותאמת למנגנון משאבת המזרק, המכיל מזרקים אטומים לגז של 1 מ"ל (חיצים צהובים תוחמים בוכנות). קווי הפסולת משמשים להסרת בועות אוויר שיכולות להילכד בשסתום המיתוג במהלך החלפת מזרק. (B) תצוגת תקריב של תא הזרימה בעל שלושת הערוצים. כדי להקל על הדמיה של זרמי נוזלים, החיצוניים נצבעו בצבעי מאכל כאשר הזרם המרכזי מכיל מים בלבד. האזור המוגדל מציין כיצד קומפלקס מולקולות חרוז-דנ"א לכודות אופטית מתורגם מזרם נוזל אחד למשנהו (חץ כחול) על ידי תרגום השלב הניצב לזרימה (חץ שחור). (C) סכמות של שסתומי המיתוג התלת-כיווניים המציינים את מיקומם התפעולי. כינויי האותיות F, S ו-W מתאימים לנוזל הכיוון ויכולים לזרום לתא הזרימה, למזרק ולפסולת, בהתאמה. יציאה אחת סגורה לצמיתות כפי שמצוין על-ידי התקע השחור בחלק העליון של כל סכימה. במצב פתוח או תפעולי (פאנל שמאלי), זרימת הנוזל עוברת ישירות דרך שסתום המיתוג מהמזרק (S) לתא הזרימה (F). במצב סגור (לוח ימני), החוגה מסובבת כך שתא הזרימה אטום מהסביבה. במצב זה, הזרימה מופנית לפסולת וניתן להחליף מזרקים מבלי להכניס בועות אוויר לתא הזרימה. מכיוון שלשסתומים יש נפח מת של 6 μL, מעט מאוד תמיסה מבוזבזת בעת ניקוי קווים לפני החזרה לתצורת Open. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תנועת חרוזים וכוח מנוגד מושפעים מזרימת נוזלים. (A) מהירות חרוז ליניארית מושפעת ממהירות המשאבה ומריכוז הסוכרוז. (B) הכוח הנגדי על חרוז מושפע מצמיגות התמיסה. (C) קוטר החרוזים משפיע על כוח החרוזים בזרימה. בכל הניסויים נעשה שימוש בחרוזים פלואורסצנטיים (ירוק הדרקון). ב-(A) וב-(B) נעשה שימוש בחרוזים בקוטר 0.97 מיקרומטר וב-(C) נעשה שימוש בחרוזים בקוטר שונה. תמיסות סוכרוז יוצרו במים אולטרה-טהורים, סוננו דרך מסננים של 0.2 מיקרומטר ומקדם שבירה נמדדו באמצעות מד שבירה ידני, כאשר צמיגותם נקבעה במרבה רגליים באמצעות טבלאות ISCO והומרה לבסוף ליחידות SI ב-mPa.s. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| קצב זרימה (μL/h)b | זמן לכל צעד (מינימום) | נפח מחולק (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 או יותר | 1 או יותר |
| a. אלה הם קצבי זרימת נוזלים המחושבים על ידי תוכנת משאבת המזרק והם ייחודיים לכל קוטר מזרק בשימוש. קצבי הזרימה מאפשרים מילוי מהיר של הקווים ותא הזרימה (800 μl/hr), ולאחר מכן ירידה הדרגתית לקצב הזרימה האידיאלי להשמנה והדמיה | ||
| b. ניתן לשלוט במשאבת המזרק מלוח המקשים או באמצעות תוכנה המסופקת על ידי הספק. | ||
טבלה 1: קצבי זרימת נוזלים כדי למזער בועות ולהשיג השמנה יציבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הרכבה זהירה של מערכת הזרימה היא קריטית לתוצאה המוצלחת של ניסויים 4,6. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הפרוטוקול הוא חיבור המחברים למשטח הזכוכית. לשם כך, אנו משתמשים בשתי הגישות הבאות: מחברי צינורות בהתאמה לעיתונות ומכללי ננו-יציאות. מחברים המתאימים ללחיצה נצמדים בקלות לזכוכית ולאחר מכן דוחפים צינורות PTFE לתוך החורים המוכנים מראש באמצעות מלקחיים. כאשר נדרשת התקשרות יציבה יותר, עדיפה הדבקה של מכלולי ננו-נמל. עם שימוש זהיר וניקוי, תא זרימת זכוכית יחיד עם מכלולים קבועים ניתן להשתמש במשך יותר משנה. אם יש צורך לכבות תאי זרימה בתדירות גבוהה יותר, ניתן להשתמש בתאי זרימה PDMS מכיוון שהם חלופה מצוינת וזולה יותר. ניתן לעשות בהם שימוש חוזר, אך PDMS רגיש לנפיחות, מה שיכול לשנות את התנהגות זרימת הנוזלים לאורך זמן.
גם תאי זרימה מזכוכית וגם מ-PDMS אינם ניתנים להריסה. במעבדה, קצב הזרימה המרבי המשמש הוא 800 μL/h. במקרה של חריגה מכך מדי יום ו/או לפרקי זמן ממושכים, עלולים להתרחש עיוותים של תאי זרימה (תאי זרימת זכוכית) ועיוות של PDMS. בעוד הליך ההרטבה הראשוני עם מתנול ומים לוקח זמן, זה בהחלט שווה את זה כמו כל הבועות מסולקים, וגם דליפות במחברים ניתן לזהות. תאי הזרימה המתוארים כאן מספקים גמישות לניסויים המתבצעים. באמצעות גישות אלה של תאי זרימה שונים, צינורות וחיבור של מחברים שונים, ניתן להתאים בקלות את תנאי הניסוי ולמטב אותם במהירות כדי להבטיח קבלת נתונים אופטימליים. תאי זרימת תעלה בצורת Y מוצגים, אך מגוון גדול של עיצובי התקנים מיקרופלואידיים זמינים מחברות מרובות הן ללא מחברים והן עם מחברים מחוברים. זה מספק לחוקר גמישות רבה עוד יותר בתכנון הניסוי.
השימוש בשסתומי מיתוג לארבעה כיוונים הוא שיטה פשוטה ויעילה המבטיחה כי ברגע שמערכת הזרימה מורכבת ונבדקת, היא הופכת למעשה לסביבה סגורה, שבה הזיהום הוא מינימלי, ובועות מסולקות. זה האחרון הוא קריטי מכיוון שבועיות נוטות להידחס ולשחרר לחץ באופן אקראי במהלך ניסוי וזה מפריע לזרימת הנוזלים וגורם למולקולות דנ"א לכודות לנוע בדרכים בלתי צפויות ואף להישבר. יש לנקוט בזהירות רבה כדי להבטיח שהם מנועים מלהיווצר במערכת.
לבסוף, המערכת המתוארת כאן מותאמת לביוכימיה חזותית שבה ניתן לבצע ניתוח זהיר של דנ"א, חרוזים המחוברים לחלבונים או חלבונים המתויגים על ידי פלואורסצנט. למרות שהמערכת אינה מתוכננת לבצע מדידות כוח עם המלכודות הכפולות ותוספת של פוטודקטורים מרובעים, ניתן למדוד כוחות על ידי הצמדת חרוזים בקוטר שונה לחלבונים מוטוריים של DNA, למשל, ולבקש מהמנוע למשוך את החרוז הזה כנגד זרימת הנוזל. על-ידי שינוי צמיגות התמיסה, זרימת הנוזלים וקוטר החרוזים, ניתן ליישם מגוון גדול של כוחות מנוגדים כדי לספק תובנות מפורטות על תפקוד החלבון המוטורי (איור 5). זוהי דרך פשוטה וזולה למדוד כוחות הקשורים לעסקאות ביולוגיות, אך היא חסרה את הדיוק הקשור לגישות רגישות יותר. כאשר הגישה הביוכימית החזותית משולבת עם שיטות גילוי כוח רגישות, ניתן לספק תמונות מלאות יותר של תגובות ביוכימיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר מצהיר על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחקר במעבדת ביאנקו נתמך על ידי מענקי NIH GM100156 ו- GM144414 ל- P.R.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M.
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
