Summary
미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.
Abstract
시각 생화학은 벌크 단계 연구에서 발생하는 평균화에서 가려진 단일 효소 또는 효소 복합체의 확률적 특성을 관찰하기 위한 강력한 기술입니다. 시각화를 달성하기 위해 하나의 트랩이 고정되고 다른 트랩이 이동되는 이중 광학 핀셋이 도립 형광 현미경 스테이지에 위치한 다중 스트림 미세 유체 챔버의 한 채널에 초점을 맞춥니다. 광학 핀셋은 형광 표지 DNA의 단일 분자를 포획하고 유체가 챔버를 통과하여 갇힌 비드를 지나 DNA를 B-형태(최소 힘, 즉 0pN)로 늘리고 핵산이 검은색 배경에 흰색 끈으로 관찰됩니다. DNA 분자는 제어 된 방식으로 반응을 시작할 수 있도록 흐름에 수직 인 단계를 번역함으로써 한 흐름에서 다음 흐름으로 이동합니다. 성공을 달성하기 위해 광학적으로 투명한 채널이 있는 미세유체 장치는 주사기 펌프에 고정된 유리 주사기에 결합됩니다. 최적의 결과는 플로우 셀에 영구적으로 접착된 커넥터, 기계적으로 단단하고 내화학성이 있는 튜브, 층류를 방해하는 기포를 제거하는 스위칭 밸브에 연결된 튜브를 사용합니다.
Introduction
단일 분자 수준에서 실시간으로 단백질-DNA 상호 작용을 시각화하는 능력은 게놈 안정성에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다1,2. 한 번에 하나씩 단일 분자의 DNA로 작업하는 것 외에도 근처의 개별 분자 간의 거래를 볼 수있는 기능은 추가적인 통찰력을 제공합니다 3,4,5. 추가 DNA 분자를 조작하려면 추가 광학 트랩과 고품질의 다중 채널 미세 유체 유동 세포6가 모두 필요합니다.
둘 이상의 옵티컬 트랩을 생성하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있습니다. 여기에는 검류계 스캐닝 미러, 음향 광학 변조기 및 회절 광학이 포함되며, 이는 홀로그램 광학 핀셋 4,7,8,9를 생성합니다. 종종 스캐닝 미러와 음향 광학 변조기는 시분할하는 트랩을 생성합니다. 여기에 설명된 설정에서 단일 Nd:YAG 레이저의 빔이 편광으로 분할된 다음 검류계 레이저 스캐닝 미러가 모바일 트랩이라고 하는 위치를 제어합니다(그림 1)4. 트래핑 빔을 현미경 대물렌즈의 후면 조리개로 향하게 하는 미러와 필터의 위치를 용이하게 하기 위해 HeNe 레이저가 사용됩니다. 이렇게 하면 HeNe 빔이 육안으로 볼 수 있지만 적외선 빔은 볼 수 없으므로 전체 정렬이 더 쉬워집니다. HeNe 빔은 또한 거울 및 기타 구성 요소의 위치를 덜 스트레스로 만드는 작업에 더 안전합니다. 처음에 이 레이저의 빔 경로는 1064nm 빔과 분리되어 있지만 동일한 빔 경로로 도입된 다음 현미경 대물렌즈로 도입됩니다. 물리적 정렬이 이루어지면 HeNe 빔 위에 1064nm 빔을 배치하고 적외선 뷰어와 다양한 빔 이미징 도구를 사용하여 빔 위치와 품질을 시각화함으로써 용이해집니다. 그런 다음 빔 확장기가 도입되고 그 결과 확장된 적외선 빔이 대물렌즈의 후면 조리개에 정렬됩니다. 마지막으로 대물렌즈를 제거하고 λ/2 파장판을 사용하여 각 편광 빔의 전력을 동일하게 측정 및 조정합니다(그림 1C). 전력 측정은 목표가 반환되면 수행되며 일반적으로 53%의 전력 손실이 발생합니다. 그러나 초점면에 안정적인 고정 및 이동 광학 트랩을 형성하기에 충분한 전력이 있습니다(그림 1D).
DNA 트랜잭션을 이미지화하기 위해 미세유체 유동 세포는 높은 공간 및 시간 분해능으로 단일 분자 수준에서 제어된 측정을 허용하므로 중요한 역할을 합니다(그림 2). 미세유체라는 용어는 5-500 μm10,11 범위의 치수를 갖는 하나 이상의 채널에서 유체를 조작하는 능력을 의미한다. 스트림이라는 용어는 채널 내의 실제 유체를 의미하고 채널은 유체 스트림 또는 스트림이 이동하는 물리적 채널을 나타냅니다. 단일 채널 플로우 셀 설계에는 반응이 관찰되는 일반적인 물리적 채널이 있으며 일반적으로 하나의 유체 스트림만 존재합니다. 따라서 이러한 설계를 단일 스트림 유동 셀이라고 합니다. 대조적으로, 다중 스트림 유동 세포는 2개 이상의 진입 채널이 단일의 공통된 물리적 채널로 수렴하는 미세유체 장치로서 정의된다(도 2A). 공통 채널 내에서 개별 채널에서 시작된 유체 스트림은 서로 평행하게 흐르고 확산으로 인해 발생하는 최소한의 혼합만으로 분리된 상태로 유지됩니다(그림 2B). 대부분의 실험 설정에서 단일 펌프는 동일한 속도로 유체를 각 채널로 밀어 넣습니다. 대조적으로, 경계 조향이 사용되는 경우, 3 개 이상의 독립적으로 제어되는 펌프가 채널을 통해 유체를 밀어냅니다. 그러나 각 펌프는 다른 속도로 작동하지만 공통 채널의 순 유량은 일정합니다12. 이를 통해 펌프 속도를 변경하는 것만으로 메인 채널 구성 요소를 신속하게 교환 할 수 있습니다.
층류 외에도 또 다른 중요한 요소는 층류 유체 흐름 내의 포물선 속도 프로파일입니다. 가장 높은 유속은 하천 중앙에서 발생하고 가장 느린 유속은 표면 옆에서 발생합니다(그림 2C)13. 이 프로파일은 형광 DNA의 정확한 시각화와 정확한 단일 분자 분석을 위해 스트림에 고정된 비드에 부착된 DNA 분자를 완전히 늘리기 위해 고려되어야 합니다. 여기서 DNA는 B형으로 늘어나고 0pN의 힘으로 제자리에 고정됩니다. 이를 위해 광학 트랩 위치의 초점은 하단 커버슬립 표면에서 10-20μm 위치에 있어야 합니다(그림 2D). DNA 분자가 B형 이상으로 늘어나지 않도록 주의해야 효소 반응을 억제할 수 있습니다. 전형적인 완충액 조건 하에서, 1 μm = 3,000 bp의 DNA14. 또한 커버슬립에서 10-20μm 떨어진 곳에 DNA 복합체를 포획하여 표면에서 멀리 위치시켜 표면 상호작용을 최소화합니다.
많은 방법이 미세유체 장치 채널을 생성하기 위해 사용되었으며, 이들은 실험실에서 수행되거나 유동 세포가 상업적 공급원 6,15,16,17로부터 구입할 수 있다. 플로우 셀을 구성하는 데 사용되는 최적의 재료는 기계적으로 단단하고 광학적으로 투명하고 형광이 낮으며 유기 용매에 영향을 받지 않아야 합니다6. 종종 붕규산 플로트 유리 또는 용융 실리카는 광학 트래핑, 시각화 및 힘 감지에 적합한 연장된 시간 동안 안정적인 흐름 환경을 제공하는 데 사용됩니다. 이러한 물질은 또한 표면 습윤 및 기포 제거를 단순화하기 위해 비수성 용매(예: 분광 광도계 등급 메탄올)와 유동 셀을 청소하기 위한 변성제(예: 6M 구아니디늄 염산염) 또는 세제의 사용을 허용합니다. 마지막으로, 유동 셀에 유체를 도입하기 위해 사용되는 방법은 복잡한 진공 펌프 시스템으로부터 단일 주사기 펌프 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27에 이르기까지 다양하다. 여기에 설명된 접근 방식에서는 최대 10개의 주사기를 수용할 수 있는 주사기 펌프가 사용됩니다(그림 3A). 이는 단일 채널 플로우 셀 또는 여러 유입 채널이 있는 플로우 셀을 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다. 여기에서는 3채널 플로우 셀이 사용되며 폴리-에테르-에테르-케톤(PEEK) 튜브를 사용하여 주사기 펌프에 고정된 주사기에 결합됩니다(그림 3A-C). 유체의 흐름은 4방향 전환 밸브에 의해 제어되므로 유동 셀에 기포가 유입되는 것을 최소화하는 역할을 합니다(그림 3A, D). 또한 뻣뻣한 유리 벽과 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 코팅 플런저가 있는 해밀턴 기밀 주사기는 원활한 흐름14,27을 얻는 데 필수적인 매우 부드러운 플런저 동작을 제공하므로 권장됩니다.
설명된 실험 시스템에서, 2 내지 5개의 입구 채널을 갖는 플로우 셀이 사용되었다. 입구 채널의 수는 수행되는 실험에 따라 결정됩니다. RecBCD 및 Hop2-Mnd1의 연구를 위해, 2개의 스트림 채널은충분했다 14,28. 헬리 카제의 경우, 효소는 DNA의 자유 단에 결합되어 마그네슘과 ATP를 함유 한 스트림으로 번역되어 전좌 및 풀림을 시작했습니다. Hop2-Mnd1의 경우, 광학적으로 포획된 DNA를 단백질 및 완충제 ±가 금속 이온을 함유하는 인접한 유체 스트림으로 번역하였다. 3채널 유동 세포를 사용하면 스트림 1에 DNA를 포획하고 DNA를 스트림 2로 번역하여 단백질 결합이 일어나도록 한 다음 ATP가 존재하는 스트림 3으로 이동하여 반응을 시작할 수 있습니다. 위의 변형은 채널 2에서 형광 태그 단백질을 사용하는 것인데, 이는 유체 스트림이 완전히 흰색이되고 DNA의 시각화를 배제합니다. 이 분자가 스트림 3으로 번역되면 반응이 시작될 때 단백질과 DNA가 모두 보입니다.
유체 흐름을 제어하기 위해 4방향 전환 밸브를 사용하는 것은 유동 셀의 기포를 제거하는 시스템의 중요한 구성 요소입니다. 기포는 예측할 수 없는 방식으로 수축 및 팽창하여 유속의 급격한 변화와 난류의 도입을 초래하기 때문에 안정적인 유체 흐름에 해롭습니다. 밸브가 주사기와 입구 튜브 사이에 위치하면 주사기를 교체할 때 밸브 위치를 전환하여 유로를 분리합니다. 새 주사기를 제자리에 놓으면 플런저를 수동으로 눌러 >6μL(밸브의 데드 볼륨)가 배출되어 기포가 거의 완전히 제거됩니다.
플로우 셀에 커넥터를 부착하는 것은 플로우 셀 사용에서 속도를 제한하는 단계인 경우가 많습니다. 우리는 두 가지 유형의 커넥터 사용, 즉 압입으로 알려진 탈착식 및 영구 커넥터 (나노 포트 어셈블리)의 사용을 설명합니다. 탈착식 커넥터는 플로우 셀에 간단하게 부착할 수 있으며 권장 PTFE 외에도 다양한 유형의 유연한 튜브를 이러한 커넥터로 테스트할 수 있습니다. 이는 더 비싼 유리 플로우 셀을 희생하지 않고 튜브와 커넥터를 테스트하는 빠르고 비용 효율적인 방법입니다. 대조적으로, 나노 포트 어셈블리는 영구적으로 부착되고 최대 1,000psi의 압력을 견디며 우리 손에서는 직경이 다른 PEEK 튜브로 사용이 제한됩니다. 이것은 PEEK 튜빙이 바람직하게 사용되기 때문에 단점이 아닙니다. 영구 어셈블리가 부착된 단일 유리 플로우 셀은 신중하게 사용하여 1년 이상 재사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 폴리스티렌 비드를 사용한 레이저 트랩 정렬 및 테스트
참고: 설정에 대해서는 그림 1A,B를 참조하십시오.
주의 : 실험자는 레이저 빔을 정렬하는 동안 적절한 보호 안경이나 레이저 보안경을 착용해야합니다. 본 명세서에 기술된 광학 핀셋 시스템은 HeNe 및 IR 빔을 모두 사용하므로, 두 개의 개별 레이저 안전 글라스웨어 세트가 필요하다.
- HeNe 빔 정렬
- 모든 광학 구성 요소를 브레드 보드에 놓습니다. 브레드 보드를 현미경에 대해 가능한 한 90° 각도에 가깝게 정렬합니다.
- 대물 렌즈와 텔란 렌즈가 포함된 결합 튜브를 현미경에 부착합니다(그림 1A-11,12).
알림: 텔란 렌즈는 접안 렌즈의 중간 이미지 평면에 이미지의 초점을 맞추는 데 사용되는 렌즈 시스템입니다. - HeNe 레이저를 켜고 셔터를 엽니다(그림 1A-18). 빔은 빛의 50%를 미러 5(그림 1A-5)에 반사하는 54mm 높이의 필터(그림 1A-3)에 부딪혀야 합니다. 빔의 나머지 50%는 미러 3과 동일한 높이에서 미러 4(그림 1A-4)를 공격합니다.
- 빔이 4mm 높이에서 미러 1(그림 1A-6)에 닿도록 미러 51(그림 4A-4)을 조정합니다.
- 빔이 6mm 높이의 하부 갈바닉 미러로 향하도록 미러 6(그림 51A-6)을 조정합니다. 상부 갈바닉 미러에서 나오는 빔은 57.5mm입니다.
- 이 빔이 57.5mm 높이에서 미러 5(그림 1A-5)에 닿도록 미러 3(그림 1A-3)을 조정합니다. 미러 5에서 반사되면 빔은 동일한 높이에서 미러 9(그림 1A-9)에 부딪혀야 합니다. 빔은 미러 9에서 효과적으로 재결합되어 대물 렌즈와 텔란 렌즈 시스템을 통과하여 미러 21 (그림 1A-21)로 전달되어 대물 렌즈에 반사됩니다.
- 깨끗한 현미경 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다. 카메라를 켜고 고정 빔과 스캐닝 빔의 빔을 화면에 개별적으로 이미지화합니다. 미러 3부터 시작하여 5와 9, 마지막으로 21로 작은 조정을 수행하여 고정 빔을 화면 중앙에 배치합니다.
- 빔 출구 미러(21)의 각도가 90°가 되도록 하기 위해, 현미경의 Z-높이를 변경하고 이미징된 빔을 슬라이드의 상부 및 하부 표면에 위치시킨다. 동일하면 빔이 스테이지에 수직 인 올바른 위치에 있습니다. 셔터 19를 사용하여 이 빔을 셔터합니다(그림 1A-19).
- 미러 4와 6부터 시작하여 작은 조정을 수행하여 고정 빔을 화면 중앙에 배치합니다. 이 빔을 셔터합니다.
- 적외선(IR) 빔 정렬
주의: 안전상의 이유로 낮은 레이저 출력으로 모든 단계를 수행하십시오.- 웨이브 플레이트(14)(그림 1A-14)를 조정하여 빔 스플리터(2)(그림 1A-2)에서 분할되는 투과 빔과 반사 빔의 비율을 조정합니다. 빔 스플리터(2)는 레이저 빔의 s-성분을 반사하여 p-성분을 전송한다.
- 2를 통과하는 빔은 미러 7 (그림 1A-7)에 부딪혀 빔을 하부 갈바니 미러로 편향시킵니다. 미러(21) 상으로 향하는 HeNe 빔의 경로를 따라가야 한다. 이 포지셔닝을 달성하기 위해 미러 7의 작은 움직임을 수행하십시오.
- 미러 2에 의해 반사되는 빔이 10mm 높이에서 미러 10(그림 57.5A-10)에 닿도록 미러 2를 조정합니다.
- 빔은 미러 10에서 미러 8 (그림 1A-8)로 57.5mm 높이로 반사됩니다. 후속 빔은 동일한 높이에서 미러 9를 쳐야합니다. 그렇지 않은 경우 필요에 따라 미러 10과 8을 약간 조정합니다.
- 대물렌즈를 제거하고 파워 미터의 헤드를 대물 포탑의 포트 위에 놓습니다.
- 플레이트 14, 15 및 16(그림 1A-14,15,16)을 사용하여 그림 1C와 같이 동일하도록 각 레이저 빔의 출력을 조정합니다.
- 빔 익스팬더 1(그림 1A-1)을 제자리에 놓습니다. 확장된 레이저 빔을 혼수상태나 난시 없이 원형으로 조정합니다.
- 광학 트랩을 테스트하려면 물에 현탁 된 1μm 폴리스티렌 비드 용액을 만드십시오. 그런 다음 이 용액 10μL를 현미경 슬라이드에 놓고 그 위에 커버슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 이 1μm 비드를 트래핑하여 광학 트랩을 테스트합니다. 비드가 트랩으로 빨려 들어가고 스테이지가 움직일 때 안정적으로 고정되었는지 확인하십시오. 트랩은 트랩의 모든 측면에서 똑같이 효율적으로 발생해야 합니다.
2. 미세유체 챔버 준비
- 플로우 셀이 커버슬립의 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만든 상업적으로 구성된 장치인 경우 3단계로 진행합니다. 커넥터가 부착된 유리 장치인 경우 4단계로 진행합니다.
- 플로우 셀에 커넥터가 부착되어 있지 않으면 먼저 현미경 슬라이드의 입구 구멍에 연결합니다. 커넥터를 연결하는 단계는 3단계를 참조하십시오.
3. PDMS 플로우 셀을 이용한 플로우 셀 연결
노트: 설정에 대해서는 그림 2D를 참조하십시오.
- 플로우 셀을 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다. 집게로 PTFE 튜브를 자유 끝에서 3mm 잡습니다. 튜브를 미리 형성된 포트에 밀어 넣습니다(포트는 2bar 라인 압력을 지원할 수 있음).
- 나머지 각 포트에 대해 이 절차를 반복합니다. 흡입구 포트를 주사기 펌프에 연결하고 배출구를 폐병에 연결합니다(그림 4A,B).
- 각 유리 주사기에 분광 광도계 등급 메탄올 1mL를 채웁니다. 각 주사기를 스위칭 밸브에 부착합니다. 밸브에 배출구가 폐기물로 향했는지 확인하고 50μL의 메탄올로 각 라인을 퍼지합니다(그림 4C, 닫힘 위치).
- 출구 위치를 플로우 셀로 전환합니다(그림 4C, 개방 위치). 100μL/h의 유속으로 플로우 셀을 통해 800μL의 메탄올을 펌핑하여 표면을 적시고 기포를 제거합니다.
- 다음날 800μL의 초순수를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 이제 플로우 셀을 사용할 준비가 되었습니다.
4. 압입 튜브 커넥터 부착
노트: 설정에 대해서는 그림 2F를 참조하십시오.
- 압입식 튜브 커넥터를 사용하는 경우 커넥터의 한쪽에서 접착 테이프를 조심스럽게 제거하고 현미경 슬라이드의 구멍 위에 놓습니다. 몇 초 동안 아래로 누릅니다. 나머지 커넥터에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 플로우 셀을 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다. 집게로 PTFE 튜브를 자유 끝에서 3mm 잡습니다. 튜브를 포트의 미리 형성된 구멍에 밀어 넣고 나머지 각 포트에 대해 이 절차를 반복합니다.
- 입구에서 스위칭 밸브에 튜브를 부착하십시오. 7단계로 이동합니다.
5. 상설 총회의 부착
노트: 설정에 대해서는 그림 2A-C를 참조하십시오.
- 깨끗하고 평평한 표면 또는 맞춤형 매니폴드에서 부착을 수행하여 접착이 발생하는 동안 플로우 셀과 커넥터를 제자리에 고정합니다.
- 플로우 셀을 깨끗하고 평평한 표면이나 매니폴드의 오목한 부분에 놓습니다(그림 2B). 어셈블리 바닥에 소량의 유리 접착제를 놓고 씰을 삽입하십시오.
- 현미경 슬라이드의 입구 구멍 중 하나 위에 나노 포트를 놓습니다. 측면 움직임 없이 부드럽게 아래로 누르고 제자리에 고정합니다. 나머지 포트에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
- 매니폴드에서 건조하거나 제자리에 고정하십시오. 매니폴드에서 플로우 셀을 조심스럽게 제거하고 어셈블리가 플로우 셀의 입구 포트와 잘 정렬되는지 확인합니다. 준비가 되면 7단계로 진행합니다.
6. 플로우 셀 연결 및 준비
노트: 설정에 대해서는 그림 4A,B를 참조하십시오.
- 현미경 스테이지에 플로우 셀을 놓습니다. 손가락으로 조이는 커넥터를 사용하여 튜브를 부착합니다.
- 각 유리 주사기에 분광 광도계 등급 메탄올 1mL를 채웁니다. 각 주사기를 스위칭 밸브에 부착합니다. 밸브에 배출구가 폐기물로 향했는지 확인하고 50μL의 메탄올로 각 라인을 퍼지합니다(그림 4C, 닫힘 위치).
- 출구 위치를 플로우 셀로 전환합니다(그림 4C, 개방 위치). 100μL/h의 유속으로 플로우 셀을 통해 800μL의 메탄올을 펌핑하여 표면을 적시고 기포를 제거합니다.
- 다음날 800μL의 초순수를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 이제 플로우 셀을 사용할 준비가 되었습니다.
7. 유체 흐름 제어
- 스위칭 밸브를 닫힘 위치로 돌립니다(그림 4C). 주사기를 제거하고, 잔류 물을 버리고, 주사기에 실험 용액, 예를 들어 DNA- 비드를 채우고; 효소; 및 ATP. 주사기를 펌프에 다시 넣고 스위칭 밸브에 연결하십시오.
- 이 위치에서 플런저를 수동으로 5-10 μL 아래로 밀어 거품을 제거합니다. 스위칭 밸브 위치를 열림으로 변경합니다.
- 유량 체계를 사용하여 표 1에 설명된 대로 트래핑 및 시각화에 최적의 유체 유속을 달성합니다. 광학 트래핑을 위한 최적의 유체 흐름은 비드의 안정적인 트래핑을 가능하게 해야 하며 DNA가 늘어나면 B형(~3,000bp/μm)이어야 합니다.
8. 단일 DNA 분자가 부착된 폴리스티렌 비드의 트래핑
- 10x 배율에서 채널 진입점에 가까운 유체 스트림 사이의 경계를 찾습니다. 100x 대물렌즈에 오일을 넣고 더 높은 배율로 전환합니다.
- 옵티컬 트랩의 셔터를 엽니다(둘 다 또는 한 번에 하나씩). 집중된 레이저 빔은 비드를 가두어 DNA가 즉시 뻗어 나가야 합니다.
- 컴플렉스가 갇히면 스테이지를 흐름에 수직으로 변환합니다(그림 3A, C, 삽입). 이렇게 하면 갇힌 복합체가 DNA 비드 용액에서 스트림 2로 이동합니다. 추가 번역은 컴플렉스를 스트림 3으로 이동합니다.
9. 플로우 셀 세척
알림: 이 작업을 매일 수행하십시오.
- 실험이 완료되면 펌프를 끕니다. 스위칭 밸브를 닫힘 위치로 돌립니다(그림 4C).
- 주사기를 제거하고 비우십시오. 여과 된 증류수로 3 번 헹굽니다.
- 주사기에 세척액을 채 웁니다. 주사기를 펌프에 넣고 스위칭 밸브에 연결하십시오.
- 스위칭 밸브를 퍼지하고 위치를 변경하여 엽니다. 일반적으로 밤새 100μL/h의 유속으로 800μL의 세척액을 펌핑합니다.
- 다음날 스위칭 밸브를 닫은 다음 주사기를 제거하고 물로 헹굽니다. 플로우 셀과 라인을 400-800μL/h의 유속으로 4-800μL의 물로 헹굽니다. 플로우 셀을 더 격렬하게 세척해야 하는 경우 세척액을 6M 구아니듐 염산염으로 교체하십시오.
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Representative Results
트랩 정렬 및 강도의 초기 테스트는 1μm의 비형광 폴리스티렌 비드로 수행됩니다. 실험실에서 수행된 대부분의 연구는 형광을 사용하기 때문에 1μm, 드래곤 그린 폴리스티렌 비드(그림 1D, E)를 사용하여 트랩 강도를 추가로 테스트합니다. 그 후 작업은 DNA가 비스-삽입성 염료 YOYO-114,29로 염색되는 DNA-비드 복합체의 광학 트래핑으로 변경됩니다. 이러한 복합체가 미세유체 유동 셀에서 커버슬립 표면 위 10-15μm에 포획되면 비드를 지나는 유체 흐름이 DNA를 뻗어 나옵니다(그림 3B,C). 유체로 늘어난 DNA의 길이를 측정하여 예상 길이인 B형 길이까지 늘어나는지 확인하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 박테리오파지 람다 DNA의 경우, 전장은 16μm보다 약간 길며, 이는 48,504bp14에 해당한다.
유체 흐름을 특성화하기 위해 형광 비드를 커버슬립 표면 위 15μm의 초점 높이로 다양한 펌프 속도와 점도가 다른 용액에 도입했습니다. 비드 위치의 동영상을 캡처하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 비드 위치를 추적했습니다. 결과는 1μm 직경의 비드의 경우 10%-50% 범위의 자당 용액에서 100μL/h의 펌프 유속으로 선속도를 정확하게 추적할 수 있음을 보여줍니다(그림 5A). 유사한 조건에서 비드에 가해지는 힘은 펌프 유량 및 용액 점도에 따라 10 내지 400 pN 범위로 계산될 수 있다(도 5B). 마지막으로, 힘에 대한 120 내지 970 nm 범위의 비드 직경의 효과를 상이한 농도의 슈크로스에서 평가하였다. 데이터에 따르면 직경이 다른 비드를 모터 단백질에 부착하고 모터에 유체 흐름에 대해 비드를 당기도록 요청하여 1-27pN 범위의 힘을 측정할 수 있습니다(그림 5C).
그림 1: 광학 레이아웃 및 트래핑 활동 데모. (A) IR 빔이 빨간색이고 HeNe 빔이 검은색인 광학 레이아웃의 개략도. (B) 브레드 보드에 장착 된 광학 부품의 사진. 패널 A 및 B의 구성 요소 번호는 다음과 같습니다 : 1), 빔 확장기; 2), 간섭 미러 (Rsmax = 1064 nm; Tp최대 = 1064 nm); 3), 간섭 거울 (633 nm; R = 50 %; T = 50 %); 4-6), 간섭 거울 (Rmax = 633 nm); 7), 간섭 미러(Rmax = 1064 nm; 티최대= 633 nm); 8), 간섭 미러 (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), 간섭 미러(Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), 간섭 미러 (Rmax = 1064 nm); 11), 대물 렌즈, f = 110 nm; 12), 텔란 렌즈; 13), 갈바니 거울; 14-16), 회전근(/2); 17), IR 스캐닝 채널 셔터; 18), 가시 채널 셔터; 19), IR 고정 채널 셔터; 20), 빔 정지 및 21), 간섭 미러 (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) 전력 출력 측정. 레이저의 출력은 레이저 헤드를 광학 레이아웃에 설치하기 전에 측정됩니다. 트랩 정렬이 완료되면 각 트랩에 대해 100x 대물렌즈 후에 빔 파워가 측정됩니다. (D) 및 (E) 1μm 형광 비드의 안정적인 광학 트래핑을 보여주는 이미지. F, 고정 트랩 및 M, 스캔 모드의 모바일 트랩이 30mHz에서 작은(D) 또는 큰(E) 원을 통해 이동하는 모바일 트랩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세유체 유동 세포. (A) 붕규산 유리로 만들어진 3채널 플로우 셀의 조립. (B) 커넥터 접합 중에 플로우 셀을 안정적으로 배치하기 위한 매니폴드. 상단에는 유동 셀을 측면으로 위치시키기 위해 1mm 오목한 단면이 있는 알루미늄 매니폴드의 베이스가 있습니다. 4개의 포스트(각 모서리에 하나씩)는 매니폴드의 뚜껑을 제자리로 안내하고 중앙에 배치된 나사산 볼트는 뚜껑을 제자리에 고정하는 데 사용됩니다. 바닥, 매니폴드 베이스의 포스트 및 볼트와 일치하도록 구멍이 뚫린 매니폴드 뚜껑. (1) 매니 폴드베이스 볼트에 부착되는 너트; (2) 접합 과정에서 가벼운 장력을 제공하기 위해 너트와 매니 폴드 뚜껑 사이에 배치되는 스프링. (C) 커넥터가 이미 부착 된 유리 플로우 셀에서 입구 채널이 공통 단일 유체 스트림으로 수렴하는 것을 클로즈업보기. 분기는 참조로 플로우 셀 옆에 배치됩니다. (d) PDMS 플로우셀의 이미지. PDMS 층의 두께는 3mm입니다. (E) 루어 커넥터가 있는 용융 실리카 플로우 셀. (F) 압입 커넥터가 있는 붕규산 유리 플로우 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유리 유동 셀을 통한 유체 유동 특성. (A) 유동 셀 내의 유체 흐름은 층류입니다. 개략도는 채널 간 확산이 인접한 유체 스트림 간의 주요 혼합 소스임을 보여주기 위해 상단에서 플로우 셀을 보여줍니다. 흐름 방향은 파란색 화살표로 표시되며 개별 스트림은 흰색, 밝은 회색 및 흰색으로 표시됩니다. 채널 간 횡 방향 확산의 확대 영역은 빨간색으로 표시됩니다. 삽입물은 10x 배율로 인접한 유체 스트림의 형광 이미지를 보여주며, 하부 스트림에는 형광 표지된 DNA-비드 복합체가 있고 상부 스트림에는 버퍼가 있습니다. 상류의 흰색 반점은 CCD 카메라의 샷 노이즈입니다. (B) 층류 세포의 유동 프로파일 (연한 보라색)은 포물선입니다. 플로우 셀은 측면에서 볼 수 있으며 플로우 방향은 각 셀 위에 표시됩니다. 가장 빠른 유체 속도는 중앙에 위치한 플로우 셀에서 발생하고 가장 느린 유체 속도는 플로우 셀 표면 옆에서 발생합니다. 결과적으로, 유동 세포의 중심에 위치한 광학적으로 포획된 DNA-비드 복합체의 경우, 유체 흐름은 박테리오파지 λ DNA 분자(48,504bp)를 16μm(B형)로 늘려 명확한 시각화를 할 수 있습니다(왼쪽 이미지). 대조적으로, 유동 세포의 표면 근처에 위치한 동일한 분자는 낮은 유속을 경험하고 늘어날 수 없습니다. (C) 단일 DNA 비드 복합체가 유동 세포 내에 위치한다. 다른 깊이의 유동 셀을 사용할 수 있지만, 각각의 경우에 최적의 트래핑이 커버슬립 표면 위 10-20μm에서 발생하도록 빔 정렬을 설정할 수 있으므로 표면 효과를 제거하고 안정적인 흐름을 가지므로 DNA 분자가 B-형태로 늘어날 수 있습니다. (C)의 왼쪽 이미지에 표시된 것처럼 DNA는 선명한 시각화를 위해 늘어납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 현미경 단계에서 유동 세포 내에 광학적으로 포획된 DNA의 흐름 및 반응 제어 . (a) 상기 유동 셀을 시린지 펌프에 결합시키는 단계. 3방향 전환 밸브를 통해 주사기 펌프에 연결된 3채널 플로우 셀의 사진이 제공됩니다. 플로우 셀은 도립 현미경의 전동 스테이지에 고정됩니다. 플로우 셀은 주황색 500μm 튜브(녹색 테이프로 표시)를 통해 폐기물 라인(왼쪽)과 스위칭 밸브(파선 청록색 원)에 연결됩니다. 밸브는 1mL 기밀 주사기(노란색 화살표는 플런저를 구분함)를 수용하는 주사기 펌프 장치에 맞게 조정된 맞춤형 매니폴드에 안정적으로 장착됩니다. 폐기물 라인은 주사기 교체 중에 스위칭 밸브에 갇힐 수있는 기포를 제거하는 데 사용됩니다. (b) 3채널 플로우 셀의 근접도. 유체 흐름의 시각화를 용이하게하기 위해 외부 흐름은 물만 포함하는 중앙 흐름으로 식용 색소로 채색되었습니다. 확대된 영역은 광학적으로 포획된 비드-DNA 분자 복합체가 흐름에 수직인 스테이지를 변환하여(검은색 화살표) 한 유체 스트림에서 다음 유체 스트림으로 변환되는 방법(파란색 화살표)을 나타냅니다. (C) 작동 위치를 나타내는 3 방향 스위칭 밸브의 개략도. 문자 지정 F, S 및 W는 방향 유체에 해당하며 각각 플로우 셀, 주사기 및 폐기물로 흐를 수 있습니다. 하나의 포트는 각 회로도 상단의 검은색 플러그로 표시된 대로 영구적으로 닫힙니다. 개방 또는 작동 위치(왼쪽 패널)에서 유체 흐름은 주사기(S)에서 유동 셀(F)로 전환 밸브를 직접 통과합니다. 닫힘 위치(오른쪽 패널)에서 다이얼이 회전하여 플로우 셀이 환경으로부터 밀봉됩니다. 이 위치에서 흐름은 폐기물로 향하고 흐름 셀에 기포를 도입하지 않고 주사기를 전환 할 수 있습니다. 밸브의 데드 볼륨이 6μL이기 때문에 Open 구성으로 되돌리기 전에 라인을 퍼지할 때 낭비되는 솔루션이 거의 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비드 운동과 반대 힘은 유체 흐름의 영향을 받습니다. (A) 선형 비드 속도는 펌프 속도와 자당 농도의 영향을 받습니다. (B) 비드에 대한 반대 힘은 용액 점도의 영향을 받습니다. (C) 비드 직경은 유동 하에서 비드에 가해지는 힘에 영향을 미칩니다. 모든 실험에서 형광 비드(드래곤 그린)를 사용하였다. (A)와 (B)에서는 직경 0.97μm의 비드를 사용하였고, (C)에서는 직경이 다른 비드를 사용하였다. 자당 용액을 초순수에서 만들고 0.2μm 필터로 여과하고 휴대용 굴절계를 사용하여 굴절률을 측정했으며 ISCO 테이블을 사용하여 센티포이즈에서 점도를 측정하고 최종적으로 mPa.s 단위의 SI 단위로 변환했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유량 (μL / h) b | 스텝당 시간(분) | 분주 용량 (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5개 이상 | 1개 이상 |
| a. 이는 주사기 펌프 소프트웨어로 계산된 유체 유량이며 사용되는 각 주사기 직경에 대해 고유합니다. 유속을 통해 라인과 유량 챔버(800μl/hr)를 빠르게 충진할 수 있으며, 트래핑 및 시각화를 위한 이상적인 유속으로 점진적으로 감소합니다. | ||
| b. 주사기 펌프는 키패드에서 제어하거나 공급업체에서 제공한 소프트웨어를 사용하여 제어할 수 있습니다. | ||
표 1: 기포를 최소화하고 안정적인 트래핑을 달성하기 위한 유체 유속.
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Discussion
흐름 시스템의 신중한 조립은 실험 4,6의 성공적인 결과에 매우 중요합니다. 프로토콜의 가장 어려운 측면 중 하나는 커넥터를 유리 표면에 부착하는 것입니다. 이를 위해 우리는 압입 피팅 튜브 커넥터와 나노 포트 어셈블리의 두 가지 접근 방식을 사용합니다. 압입 커넥터는 유리에 쉽게 부착된 후 집게를 사용하여 PTFE 튜브를 미리 형성된 구멍으로 밀어 넣습니다. 보다 안정한 부착이 필요한 경우, 나노포트 조립체의 접합이 바람직하다. 조심스럽게 사용하고 청소하면 영구 어셈블리가있는 단일 유리 플로우 셀을 1 년 이상 사용할 수 있습니다. 플로우 셀을 더 자주 교체해야 하는 경우 PDMS 플로우 셀을 우수하고 저렴한 대안으로 사용할 수 있습니다. 재사용이 가능하지만 PDMS는 팽창하기 쉽기 때문에 시간이 지남에 따라 유체 흐름 거동이 바뀔 수 있습니다.
유리 및 PDMS 플로우 셀 모두 파괴되지 않습니다. 실험실에서 사용되는 최대 유량은 800μL/h입니다. 이를 매일 및/또는 장기간 초과하면 플로우 셀 뒤틀림(유리 플로우 셀) 및 PDMS의 왜곡이 발생할 수 있습니다. 메탄올과 물을 사용한 초기 습윤 절차는 시간이 걸리지 만 모든 기포가 제거되고 커넥터의 누출도 감지 할 수 있으므로 그만한 가치가 있습니다. 여기에 설명된 플로우 셀은 수행되는 실험에 유연성을 제공합니다. 다양한 플로우 셀, 튜빙 및 다양한 커넥터의 부착에 대한 이러한 접근 방식을 사용하여 실험 조건을 쉽게 조정하고 신속하게 최적화하여 최적의 데이터를 얻을 수 있습니다. Y 자형 채널 플로우 셀이 제시되지만 커넥터가 부착 된 상태에서 여러 회사에서 광범위한 미세 유체 장치 설계를 사용할 수 있습니다. 이를 통해 조사자는 실험 설계에서 훨씬 더 큰 유연성을 얻을 수 있습니다.
4방향 전환 밸브의 사용은 일단 유량 시스템이 조립 및 테스트되면 오염이 최소화되고 기포가 제거되는 폐쇄된 환경이 효과적으로 되도록 하는 간단하고 효과적인 방법입니다. 후자는 기포가 실험 중에 무작위로 압축 및 감압되는 경향이 있고 이로 인해 유체 흐름을 교란시켜 갇힌 DNA 분자가 예기치 않은 방식으로 움직이고 심지어 부서지기 때문에 중요합니다. 시스템에서 형성되지 않도록 세심한주의를 기울여야합니다.
마지막으로, 여기에 설명된 시스템은 DNA, 단백질에 부착된 비드 또는 형광 태그가 부착된 단백질의 신중한 분석을 수행할 수 있는 시각 생화학에 최적화되어 있습니다. 이 시스템은 이중 트랩과 사분면 광 검출기를 추가하여 힘 측정을 수행하도록 설계되지 않았지만, 예를 들어 직경이 다른 비드를 DNA 모터 단백질에 부착하고 모터에이 비드를 유체 흐름에 대해 당기도록 요청하여 힘을 측정 할 수 있습니다. 용액 점도, 유체 흐름 및 비드 직경을 변화시킴으로써 광범위한 반대 힘을 적용하여 운동 단백질 기능에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다(그림 5). 이것은 생물학적 거래와 관련된 힘을 측정하는 간단하고 저렴한 방법이지만 더 민감한 접근 방식과 관련된 정밀도가 부족합니다. 시각적 생화학적 접근 방식을 민감한 힘 감지 방법과 결합하면 생화학 반응에 대한 보다 완전한 그림을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
Bianco 실험실의 연구는 NIH가 PRB에 GM100156 및 GM144414를 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
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