Summary
A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.
Abstract
A bioquímica visual é uma técnica poderosa para observar as propriedades estocásticas de enzimas individuais ou complexos enzimáticos que são obscurecidos na média que ocorre em estudos de fase a granel. Para alcançar a visualização, pinças ópticas duplas, onde uma armadilha é fixada e a outra é móvel, são focadas em um canal de uma câmara microfluídica multifluxo posicionada no estágio de um microscópio de fluorescência invertida. As pinças ópticas aprisionam moléculas únicas de DNA marcado fluorescentemente e fluem através da câmara e passam pelas contas aprisionadas, esticam o DNA para a forma B (sob força mínima, ou seja, 0 pN) com o ácido nucleico sendo observado como uma corda branca contra um fundo preto. As moléculas de DNA são movidas de um fluxo para o outro, traduzindo o estágio perpendicular ao fluxo para permitir o início das reações de maneira controlada. Para alcançar o sucesso, os dispositivos microfluídicos com canais opticamente claros são acoplados a seringas de vidro mantidas no lugar em uma bomba de seringa. Os melhores resultados usam conectores permanentemente ligados à célula de fluxo, tubulação que é mecanicamente rígida e quimicamente resistente, e que é conectada a válvulas de comutação que eliminam bolhas que proíbem o fluxo laminar.
Introduction
A capacidade de visualizar interações proteína-DNA no nível de molécula única e em tempo real forneceu uma visão significativa da estabilidade do genoma 1,2. Além de trabalhar com moléculas individuais de DNA, uma de cada vez, a capacidade de visualizar transações entre moléculas individuais próximas fornece informações adicionais 3,4,5. A manipulação de moléculas adicionais de DNA requer armadilhas ópticas adicionais, bem como células de fluxo microfluídico multicanal de alta qualidade6.
Existem vários métodos disponíveis para gerar mais de um trap óptico. Estes incluem espelhos de varredura de galvanômetros, moduladores ópticos acústicos e óptica difrativa, que geram pinças ópticas holográficas 4,7,8,9. Muitas vezes, espelhos de varredura e moduladores ópticos acústicos produzem armadilhas que compartilham o tempo. Na configuração descrita aqui, o feixe de um único laser Nd:YAG é dividido na polarização e, em seguida, os espelhos de varredura a laser galvanômetro controlam a posição do que é chamado de armadilha móvel (Figura 1)4. Para facilitar o posicionamento de espelhos e filtros para direcionar o feixe de retenção para a abertura traseira da objetiva do microscópio, um laser HeNe é usado. Isso facilita o alinhamento geral, pois o feixe HeNe é visível a olho nu, enquanto os feixes infravermelhos não são. O feixe HeNe também é mais seguro de trabalhar, tornando o posicionamento de espelhos e outros componentes menos estressante. Inicialmente, o caminho do feixe para este laser é separado do feixe de 1064 nm, mas é introduzido no mesmo caminho do feixe e, em seguida, na objetiva do microscópio. Uma vez que o alinhamento físico é alcançado, o posicionamento do feixe de 1064 nm no topo do feixe HeNe é feito e isso é facilitado pelo uso de um visualizador infravermelho e várias ferramentas de imagem do feixe para visualizar a posição e a qualidade do feixe. Em seguida, o expansor de feixe é introduzido e o feixe infravermelho expandido resultante é alinhado na abertura traseira do objetivo. Finalmente, a objetiva é removida e a potência em cada feixe polarizado é medida e ajustada usando placas de onda λ/2 para ser igual (Figura 1C). As medições de energia também são feitas uma vez que o objetivo é retornado e, normalmente, há uma perda de energia de 53%. Há, no entanto, energia suficiente para formar armadilhas ópticas fixas e móveis estáveis no plano focal (Figura 1D).
Para as transações de DNA de imagem, as células de fluxo microfluídico desempenham um papel fundamental, pois permitem medições controladas no nível de molécula única com alta resolução espacial e temporal (Figura 2). O termo microfluídico refere-se à capacidade de manipular fluidos em um ou mais canais com dimensões que variam de 5 a 500 μm10,11. O termo fluxo refere-se ao fluido real dentro de um canal e o canal refere-se ao canal físico no qual um fluxo ou fluxos de fluido se movem. O design de células de fluxo de canal único tem um canal físico comum onde as reações são observadas e normalmente há apenas um fluxo de fluido presente. Assim, esses projetos são conhecidos como células de fluxo único. Em contraste, as células de fluxo multifluxo são definidas como um dispositivo microfluídico no qual dois ou mais canais de entrada convergem em um único canal físico comum (Figura 2A). Dentro do canal comum, os fluxos de fluido que se originam dos canais individuais fluem paralelamente uns aos outros e permanecem separados com apenas uma mistura mínima entre eles ocorrendo devido à difusão (Figura 2B). Na maioria das configurações experimentais, uma única bomba empurra fluidos para cada canal na mesma velocidade. Em contraste, quando a direção de limite é usada, três ou mais bombas controladas independentemente empurram fluidos através dos canais. No entanto, cada bomba opera a uma velocidade diferente, mas a taxa de fluxo líquido no canal comum é constante12. Isso permite a troca rápida de componentes do canal principal simplesmente alterando a velocidade da bomba.
Além do fluxo laminar, outro fator crítico é o perfil de velocidade parabólica dentro do fluxo de fluido laminar. A maior velocidade de escoamento ocorre no meio do fluxo e a mais lenta ocorre junto às superfícies (Figura 2C)13. Este perfil deve ser considerado para esticar completamente uma molécula de DNA que está ligada a uma conta mantida no fluxo para visualização precisa do DNA fluorescente e análises precisas de molécula única. Aqui, o DNA é esticado para a forma B e é mantido no lugar sob 0 pN de força. Para conseguir isso, o foco da posição do purgador óptico deve estar a uma posição de 10-20 μm da superfície inferior da tampa (Figura 2D). Deve-se tomar cuidado para que a molécula de DNA não seja esticada além da forma B, pois isso pode inibir as reações enzimáticas. Sob condições típicas de tampão, 1 μm = 3.000 pb de DNA14. Além disso, ao prender 10-20 μm da lâmina de cobertura, o complexo de DNA é posicionado longe da superfície, minimizando assim as interações superficiais.
Muitos métodos têm sido utilizados para criar canais de dispositivos microfluídicos e estes podem ser feitos em laboratório ou células de fluxo podem ser adquiridas de fontes comerciais 6,15,16,17. Os materiais ideais utilizados para a construção das células de fluxo devem ser mecanicamente rígidos, opticamente transparentes com baixa fluorescência e impermeáveis a solventes orgânicos6. Frequentemente, o vidro float de borossilicato ou a sílica fundida são usados para fornecer um ambiente de fluxo estável por um tempo prolongado que é adequado para aprisionamento óptico, visualização e detecção de força. Esses materiais também permitem o uso de solventes não aquosos (por exemplo, metanol de grau espectrofotométrico) para simplificar a umectação da superfície e a remoção de bolhas de ar e desnaturantes (por exemplo, cloridrato de guanidínio 6M) ou detergentes para limpar a célula de fluxo. Finalmente, os métodos utilizados para introduzir fluidos em células de fluxo variam de sistemas complexos de bomba de vácuo a bombas de seringa única 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Na abordagem descrita aqui, é utilizada uma bomba de seringa que pode acomodar até 10 seringas (Figura 3A). Isso fornece flexibilidade para usar células de fluxo de canal único ou células de fluxo com vários canais de entrada. Aqui, uma célula de fluxo de três canais é usada e é acoplada a seringas mantidas no lugar na bomba da seringa usando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). O fluxo de fluidos é controlado por válvulas de comutação de quatro vias e, assim, servem para minimizar a introdução de bolhas na célula de fluxo (Figura 3A,D). Além disso, seringas à prova de gás Hamilton, que possuem paredes de vidro rígidas e êmbolos revestidos com politetrafluoroetileno (PTFE), são recomendadas, pois proporcionam um movimento de êmbolo excepcionalmente suave, essencial para a obtenção de um fluxo suave14,27.
No sistema experimental descrito, foram utilizadas células de fluxo com dois a cinco canais de entrada. O número de canais de entrada é ditado pelo experimento que está sendo feito. Para o estudo de RecBCD e Hop2-Mnd1, dois canais de fluxo foram suficientes14,28. Para a helicase, a enzima foi ligada à extremidade livre do DNA e traduzida em um fluxo contendo magnésio e ATP para iniciar a translocação e o desenrolar. Para Hop2-Mnd1, o DNA opticamente aprisionado foi traduzido para a corrente fluida adjacente contendo proteínas e tampão ± íons metálicos divalentes. O uso de células de fluxo de três canais permite prender o DNA no fluxo 1, traduzir o DNA no fluxo 2 para permitir que a ligação às proteínas ocorra e, em seguida, transmitir o fluxo 3 onde o ATP está presente, por exemplo, para iniciar reações. Uma variação do acima é usar proteína marcada com fluorescente no canal 2, o que resulta no fluxo de fluido sendo completamente branco e impede a visualização do DNA. Quando esta molécula é traduzida em fluxo 3, tanto as proteínas quanto o DNA são agora visíveis quando as reações são iniciadas.
O uso de válvulas de comutação de quatro vias para controlar o fluxo de fluido é um componente crítico do sistema para eliminar bolhas nas células de fluxo. As bolhas são prejudiciais ao fluxo estável de fluidos à medida que se contraem e se expandem de maneiras imprevisíveis, resultando em mudanças rápidas na velocidade do fluxo e na introdução de turbulência. Quando as válvulas são posicionadas entre as seringas e a tubulação de entrada, o caminho do fluxo é desconectado alternando a posição da válvula quando as seringas são trocadas. Quando a nova seringa é colocada no lugar, o êmbolo pode ser pressionado manualmente para que >6 μL seja ejetado (o volume morto da válvula) e isso elimina as bolhas quase inteiramente.
A fixação de conectores a células de fluxo é frequentemente a etapa de limitação de taxa no uso de células de fluxo. Descrevemos o uso de dois tipos de conectores: removíveis conhecidos como press-fit e permanentes (conjuntos de nanoportas). Os conectores removíveis são simples de aderir a uma célula de fluxo e diferentes tipos de tubos flexíveis, além do PTFE recomendado, podem ser testados com esses conectores. Esta é uma maneira rápida e econômica de testar tubos e conectores sem sacrificar células de fluxo de vidro mais caras. Em contraste, os conjuntos de nanoportas são fixados permanentemente, suportam pressões de até 1.000 psi e, em nossas mãos, seu uso é restrito a tubos PEEK de diferentes diâmetros. Isso não é uma desvantagem, pois a tubulação PEEK é preferencialmente usada. Uma única célula de fluxo de vidro com conjuntos permanentes anexados pode ser reutilizada por mais de 1 ano com uso cuidadoso.
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Protocol
1. Alinhamento e teste da armadilha a laser com esferas de poliestireno
NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 1A,B.
CUIDADO: O experimentalista deve usar óculos de proteção apropriados ou óculos de segurança a laser durante o alinhamento do feixe de laser. Como o sistema de pinça óptica descrito aqui usa feixes HeNe e IR, são necessários dois conjuntos separados de vidro de segurança a laser.
- Alinhamento do feixe HeNe
- Posicione todos os componentes ópticos na breadboard. Alinhe a breadboard para que ela fique o mais próximo possível de um ângulo de 90° em relação ao microscópio.
- Fixar o tubo de acasalamento contendo a objetiva e a lente telan ao microscópio (Figura 1A-11,12).
NOTA: A lente telan é um sistema de lentes que é usado para focar a imagem no plano intermediário da imagem nas oculares. - Ligue o laser HeNe e abra o obturador (Figura 1A-18). O feixe deve atingir o filtro (Figura 1A-3) a uma altura de 54 mm refletindo 50% da luz no espelho 5 (Figura 1A-5). Os 50% restantes do feixe atingem o espelho 4 (Figura 1A-4) na mesma altura do espelho 3.
- Ajuste o espelho 4 (Figura 1A-4) de modo que o feixe atinja o espelho 6 (Figura 1A-6) a uma altura de 51 mm.
- Ajustar o espelho 6 (Figura 1A-6) de modo a que o feixe seja direcionado para o espelho galvânico inferior a uma altura de 51 mm. O feixe que sai do espelho galvânico superior será de 57,5 mm.
- Ajuste o espelho 3 (Figura 1A-3) de modo que este feixe atinja o espelho 5 (Figura 1A-5) a uma altura de 57,5 mm. Uma vez refletido no espelho 5, o feixe deve atingir o espelho 9 (Figura 1A-9) na mesma altura. O feixe é efetivamente recombinado no espelho 9, passa através do objetivo e do sistema de lentes telan para o espelho 21 (Figura 1A-21), que o reflete no objetivo.
- Coloque uma lâmina de microscópio limpa no estágio do microscópio. Ligue a câmera e crie imagens dos feixes fixos e de digitalização individualmente na tela. Começando pelo espelho 3, depois 5 e 9, finalmente 21, realize pequenos ajustes para posicionar o feixe fixo no centro da tela.
- Para garantir que o ângulo do feixe que sai do espelho 21 é de 90°, altere a altura Z do microscópio e posicione o feixe fotografado nas superfícies superior e inferior da lâmina. Quando são idênticos, o feixe está na posição correta, que é perpendicular ao palco. Obture este feixe usando o obturador 19 (Figura 1A-19).
- Começando pelos espelhos 4 e 6, realize pequenos ajustes para posicionar o feixe fixo no centro da tela. Obture este feixe.
- Alinhamento do feixe infravermelho (IR)
CUIDADO: Execute todas as etapas com baixa potência do laser por razões de segurança.- Ajustar a placa de onda 14 (Figura 1A-14) para ajustar a razão entre os feixes transmitidos e refletidos que estão sendo divididos no divisor de feixes 2 (Figura 1A-2). O divisor de feixe 2 reflete o componente s do feixe de laser e transmite o componente p.
- O feixe que passa por 2, atinge o espelho 7 (Figura 1A-7), que desvia o feixe para o espelho galvânico inferior. Deve seguir o caminho do feixe HeNe no espelho 21. Realize pequenos movimentos do espelho 7 para conseguir esse posicionamento.
- Ajuste o espelho 2 de modo que o feixe que é refletido pelo espelho 2 atinja o espelho 10 (Figura 1A-10) a uma altura de 57,5 mm.
- O feixe é refletido do espelho 10 para o espelho 8 (Figura 1A-8) a uma altura de 57,5 mm. O feixe subsequente deve atingir o espelho 9 na mesma altura. Caso contrário, faça pequenos ajustes nos espelhos 10 e 8, conforme necessário.
- Remova a objetiva e coloque a cabeça do medidor de energia sobre a porta na torre objetiva.
- Use as placas 14, 15 e 16 (Figura 1A-14,15,16) para ajustar a potência de cada feixe de laser de modo que eles sejam iguais, como mostrado na Figura 1C.
- Coloque o expansor de feixe 1 (Figura 1A-1) no lugar. Ajuste o feixe de laser expandido para ser circular sem qualquer coma ou astigmatismo.
- Para testar as armadilhas ópticas, faça uma solução de 1 μm de esferas de poliestireno suspensas em água. Em seguida, coloque 10 μL desta solução em uma lâmina de microscópio, coloque uma tampa por cima e sele com esmalte. Coloque a lâmina no estágio do microscópio e teste as armadilhas ópticas prendendo essas contas de 1 μm. Certifique-se de que as contas sejam sugadas para as armadilhas e mantidas de forma estável quando o palco for movido. O aprisionamento deve ocorrer de forma igualmente eficiente de todos os lados da armadilha.
2. Preparação da câmara microfluídica
- Se a célula de fluxo for um dispositivo construído comercialmente feito de polidimetilsiloxano (PDMS) em uma folha de cobertura, prossiga para a etapa 3. Se for um dispositivo de vidro com conectores conectados, prossiga para a etapa 4.
- Se a célula de fluxo não tiver conectores conectados, ligue-os aos orifícios de entrada na lâmina do microscópio primeiro. Consulte a etapa 3 para obter as etapas para conectar conectores.
3. Conexões de célula de fluxo usando uma célula de fluxo PDMS
NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 2D.
- Coloque a célula de fluxo em uma superfície plana limpa. Segure a tubulação de PTFE a 3 mm da extremidade livre com pinças. Empurre a tubulação para a porta pré-formada (a porta pode suportar pressão de linha de 2 bares).
- Repita este procedimento para cada uma das portas restantes. Conecte as portas de entrada à bomba da seringa e a saída a um frasco de resíduos (Figura 4A,B).
- Encha cada seringa de vidro com 1 ml de metanol de grau espectrofotométrico. Ligue cada seringa a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e purge cada linha com 50 μL de metanol (Figura 4C, posição fechada).
- Alterne a posição de saída para a célula de fluxo (Figura 4C, posição aberta). Bombear 800 μL de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 μL / h para molhar as superfícies e eliminar bolhas.
- No dia seguinte, repita este processo usando 800 μL de água ultrapura. A célula de fluxo agora está pronta para uso.
4. Fixação dos conectores de tubulação do press fit
NOTA: Para a instalação, consulte a Figura 2F.
- Se os conectores de tubulação press-fit forem usados, remova cuidadosamente a fita adesiva de um lado do conector e coloque-a sobre o orifício na lâmina do microscópio. Pressione para baixo por alguns segundos. Repita o processo para os conectores restantes.
- Coloque a célula de fluxo em uma superfície plana limpa. Segure a tubulação de PTFE a 3 mm da extremidade livre com pinças. Empurre a tubulação para o orifício pré-formado na porta e repita este procedimento para cada uma das portas restantes.
- Fixe a tubulação das entradas às válvulas de comutação. Prossiga para a etapa 7.
5. Anexação de assembleias permanentes
NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 2A-C.
- Execute a fixação em uma superfície limpa e plana ou em um coletor personalizado para manter a célula de fluxo e os conectores no lugar enquanto a ligação ocorre.
- Colocar a célula de fluxo sobre uma superfície plana limpa ou na secção embutida do colector (figura 2B). Coloque uma pequena quantidade de cola de vidro na parte inferior do conjunto e insira o selo.
- Posicione a nanoporta sobre um dos orifícios de entrada na lâmina do microscópio. Empurre suavemente para baixo e segure no lugar sem movimento lateral. Repita o processo para as portas restantes.
- Deixe secar ou prender no lugar no coletor. Remova cuidadosamente a célula de fluxo do coletor e certifique-se de que os conjuntos se alinhem bem com as portas de entrada na célula de fluxo. Prossiga para a etapa 7 quando estiver pronto.
6. Conexões e preparação da célula de fluxo
NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 4A,B.
- Coloque uma célula de fluxo no estágio do microscópio. Conecte a tubulação usando os conectores à prova dos dedos.
- Encha cada seringa de vidro com 1 ml de metanol de grau espectrofotométrico. Ligue cada seringa a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e purge cada linha com 50 μL de metanol (Figura 4C, posição fechada).
- Alterne a posição de saída para a célula de fluxo (Figura 4C, posição aberta). Bombear 800 μL de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 μL / h para molhar as superfícies e eliminar bolhas.
- No dia seguinte, repita este processo usando 800 μL de água ultrapura. A célula de fluxo agora está pronta para uso.
7. Controle do fluxo de fluidos
- Gire as válvulas de comutação para a posição fechada (Figura 4C). Remova as seringas, descarte a água residual e encha as seringas com soluções experimentais, por exemplo, contas de DNA; enzima; e ATP. Devolva as seringas à bomba e ligue-as às válvulas de comutação.
- Nesta posição, force manualmente os êmbolos para baixo 5-10 μL para remover quaisquer bolhas. Altere a posição da válvula de comutação para Abrir.
- Use o esquema de taxa de fluxo para obter uma velocidade de fluxo de fluido ideal para aprisionamento e visualização, conforme descrito na Tabela 1. O fluxo de fluido ideal para aprisionamento óptico deve permitir o aprisionamento estável de contas e, uma vez que o DNA é esticado, deve ser em forma B (~ 3.000 pb / μm).
8. Aprisionamento de esferas de poliestireno com moléculas de DNA únicas ligadas
- Na ampliação de 10x, localize a borda entre os fluxos de fluido perto dos pontos de entrada do canal. Adicione óleo à objetiva de 100x e mude para a ampliação mais alta.
- Abra as persianas para as armadilhas ópticas (ambas ou uma de cada vez). Os feixes de laser focados devem prender contas e o DNA deve se esticar imediatamente.
- Uma vez que um complexo tenha sido aprisionado, traduza o estágio perpendicular ao fluxo (Figura 3A, C, inserção). Isso moverá o complexo preso da solução de contas de DNA para o fluxo 2. Uma tradução adicional moverá o complexo para o fluxo 3.
9. Limpeza da célula de fluxo
Observação : execute isso diariamente.
- Desligue a bomba quando o experimento estiver concluído. Gire as válvulas de comutação para a posição fechada (Figura 4C).
- Retire as seringas e esvazie-as. Enxaguar três vezes com água destilada filtrada.
- Encha as seringas com solução de limpeza. Coloque as seringas na bomba e ligue às válvulas de comutação.
- Limpe as válvulas de comutação e mude a posição para abrir. Bombear 800 μL de solução de limpeza a uma vazão de 100 μL/h tipicamente durante a noite.
- No dia seguinte, feche as válvulas de comutação e, em seguida, remova e enxágue as seringas com água. Enxaguar a célula de fluxo e as linhas com 4-800 μL de água a uma vazão de 400-800 μL/h. Se for necessária uma limpeza mais extenuante das células de fluxo, substitua a solução de limpeza por cloridrato de guanídio 6 M.
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Representative Results
O teste inicial do alinhamento e resistência do purgador é feito com 1 μm, esferas de poliestireno não fluorescentes. Como a maioria das pesquisas feitas em laboratório usa fluorescência, testamos ainda mais a resistência da armadilha usando 1 μm, esferas de poliestireno verde Dragon (Figura 1D,E). Posteriormente, o trabalho muda para o aprisionamento óptico de complexos DNA-grânulos onde o DNA é corado com o corante bis-intercalante YOYO-114,29. Quando esses complexos são presos 10-15 μm acima da superfície do deslizamento da cobertura em uma célula de fluxo microfluídico, o fluxo de fluido através do grânulo estende o DNA (Figuras 3B,C). É importante medir o comprimento do DNA esticado por fluido para garantir que ele seja esticado até o comprimento da forma B, que é o comprimento esperado. Por exemplo, para o DNA lambda bacteriófago, o comprimento total é ligeiramente maior que 16 μm, o que corresponde a 48.504 pb14.
Para caracterizar o fluxo de fluido, esferas fluorescentes foram introduzidas em células de fluxo com uma altura de foco de 15 μm acima da superfície de deslizamento de cobertura usando diferentes velocidades de bomba e em soluções de viscosidade diferente. Filmes de posição de contas foram capturados, e a posição de contas foi rastreada usando software de análise de imagem. Os resultados mostram que, para grânulos de 1 μm de diâmetro, a velocidade linear pode ser rastreada com precisão a uma taxa de fluxo da bomba de 100 μL/h em soluções de sacarose variando de 10% a 50% (Figura 5A). Em condições semelhantes, a força sobre o talão pode ser calculada e encontrada para variar de 10 a 400 pN, dependendo da taxa de fluxo da bomba e da viscosidade da solução (Figura 5B). Finalmente, o efeito do diâmetro do talão variando de 120 a 970 nm sobre a força foi avaliado em diferentes concentrações de sacarose. Os dados revelam que forças que variam de 1 a 27 pN poderiam ser medidas anexando esferas de diferentes diâmetros a uma proteína motora e pedindo ao motor que puxasse essa conta contra o fluxo de fluido (Figura 5C).
Figura 1: Layout óptico e demonstração da atividade de aprisionamento. (A) Esquema do layout óptico com o feixe IR em vermelho e o feixe HeNe em preto. (B) Fotografia de componentes ópticos montados em uma breadboard. Os números dos componentes nos painéis A e B são os seguintes: 1), expansor de feixe; 2), Espelho de interferência (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), Espelhos de interferência (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), Espelhos de interferência (Rmax = 633 nm); 7), Espelho de interferência (Rmax = 1064 nm; Tmax= 633 nm); 8), Espelho de interferência (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), Espelho de interferência (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), Espelho de interferência (Rmax = 1064 nm); 11), Lente objetiva, f = 110 nm; 12), lente Telan; 13), espelhos galvânicos; 14-16), Rotadores (/2); 17), obturador do canal de digitalização IR; 18), obturador do canal visível; 19), IR obturador de canal fixo; 20), Paradas de feixe e 21), Espelho de interferência (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Medição da potência de saída. A potência de saída do laser é medida antes de instalar a cabeça do laser no layout óptico. Uma vez que o alinhamento do purgador é feito, a potência do feixe é medida após a objetiva de 100x para cada purgador. (D) e (E) Imagens que demonstram o aprisionamento óptico estável de grânulos fluorescentes de 1 μm. F, armadilha fixa e M, armadilha móvel com a armadilha móvel no modo de varredura movendo-se através de um círculo pequeno (D) ou grande (E) a 30 mHz. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Células de fluxo microfluídicas. (A) Montagem de uma célula de fluxo de três canais feita de vidro de borossilicato. (B) Um coletor para posicionar de forma estável as células de fluxo durante a ligação do conector. Acima, a base do coletor de alumínio com uma seção embutida de 1 mm para posicionar lateralmente a célula de fluxo. Os quatro postes (um em cada canto) guiam a tampa do coletor para a posição, enquanto os parafusos rosqueados mais centralmente colocados são usados para prender a tampa no lugar. Parte inferior, tampa do coletor com furos perfurados para combinar com os postes e parafusos na base do coletor. (1), porcas que se fixam aos parafusos de base do colector; (2) molas que são colocadas entre as porcas e a tampa do coletor para fornecer leve tensão durante o processo de colagem. (C) Uma visão de perto da convergência dos canais de entrada em um único fluxo de fluido comum em uma célula de fluxo de vidro com conectores já conectados. Um quarto é colocado ao lado da célula de fluxo como referência. (D) Uma imagem da célula de fluxo PDMS. As camadas PDMS têm 3 mm de espessura. (E) Uma célula de fluxo de sílica fundida com conectores luer. (F) Uma célula de fluxo de vidro de borossilicato com conectores press-fit no lugar. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Características do fluxo de fluido através de uma célula de fluxo de vidro. (A) O fluxo de fluido dentro da célula de fluxo é laminar. O esquema mostra a célula de fluxo do topo para demonstrar que a difusão entre canais é a principal fonte de mistura entre fluxos de fluidos adjacentes. A direção do fluxo é indicada por setas azuis e os fluxos individuais são coloridos de branco, cinza claro e branco. As regiões de alargamento da difusão transversal entre os canais são indicadas em vermelho. A inserção mostra uma imagem de fluorescência de fluxos de fluidos adjacentes com ampliação de 10x com complexos de esferas de DNA marcados com fluorescência no fluxo inferior e tampão apenas no fluxo superior. As manchas brancas no fluxo superior são disparadas a partir do ruído da câmera CCD. (B) O perfil de fluxo (roxo claro) em células de fluxo laminar é parabólico. A célula de fluxo é vista de lado e a direção do fluxo é indicada acima de cada célula. As velocidades mais rápidas do fluido ocorrem na célula de fluxo localizada no centro, enquanto as velocidades mais lentas do fluido ocorrem ao lado das superfícies da célula de fluxo. Consequentemente, para um complexo de contas de DNA opticamente aprisionado posicionado no centro da célula de fluxo, o fluxo de fluido estica a molécula de DNA λ do bacteriófago (48.504 pb) a 16 μm (forma B) para que a visualização clara possa ser feita (imagem à esquerda). Em contraste, a mesma molécula posicionada perto da superfície da célula de fluxo experimenta baixas taxas de fluxo e não pode ser esticada. (C) Um único complexo de contas de DNA é posicionado dentro de uma célula de fluxo. Diferentes células de fluxo de profundidade podem ser usadas, mas, em cada caso, os alinhamentos do feixe podem ser ajustados para que o aprisionamento ideal ocorra 10-20 μm acima da superfície da cobertura, o que elimina os efeitos da superfície e tem fluxo estável para que as moléculas de DNA possam ser esticadas para a forma B. Como indicado na imagem à esquerda em (C), o DNA é esticado para permitir uma visualização clara. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Controle de fluxo e reação de DNA opticamente aprisionado dentro de uma célula de fluxo no estágio de microscópio. (A) Acasalamento da célula de fluxo para uma bomba de seringa. Uma fotografia de uma célula de fluxo de três canais conectada a uma bomba de seringa através de válvulas de comutação de três vias é apresentada. A célula de fluxo é mantida no lugar em um estágio motorizado em um microscópio invertido. A célula de fluxo é conectada a uma linha de resíduos (esquerda) e válvulas de comutação (círculo ciano tracejado) através de tubulação laranja de 500 μm (indicada com fita verde). As válvulas são montadas de forma estável em um coletor personalizado adaptado ao aparelho de bomba de seringa, que abriga seringas estanques de 1 mL (setas amarelas demarcam êmbolos). As linhas de resíduos são usadas para remover bolhas de ar que podem ficar presas na válvula de comutação durante a troca de seringa. (B) Vista em close-up da célula de fluxo de três canais. Para facilitar a visualização de fluxos de fluidos, os externos foram coloridos com corante alimentar com o fluxo central contendo apenas água. A região ampliada indica como um complexo de molécula de DNA de contas opticamente preso é traduzido de um fluxo de fluido para o próximo (seta azul) traduzindo o estágio perpendicular ao fluxo (seta preta). (C) Esquemas das válvulas de comutação de três vias, indicando suas posições operacionais. As designações das letras F, S e W correspondem ao fluido de direção e podem fluir para a célula de fluxo, seringa e resíduos, respectivamente. Uma porta é permanentemente fechada, conforme indicado pelo plugue preto na parte superior de cada esquema. Na posição aberta ou operacional (painel esquerdo), o fluxo de fluido passa diretamente através da válvula de comutação da seringa (S) para a célula de fluxo (F). Na posição Fechada (painel direito), o mostrador é girado para que a célula de fluxo seja selada do ambiente. Nesta posição, o fluxo é direcionado para os resíduos e as seringas podem ser trocadas sem introduzir bolhas de ar na célula de fluxo. Como as válvulas têm um volume morto de 6 μL, muito pouca solução é desperdiçada ao purgar as linhas antes de reverter para a configuração Aberta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O movimento do grânulo e a força oposta são afetados pelo fluxo de fluido. (A) A velocidade linear do grânulo é afetada pela velocidade da bomba e pela concentração de sacarose. (B) A força oposta em um grânulo é afetada pela viscosidade da solução. (C) O diâmetro do grânulo influencia a força sobre os grânulos sob fluxo. Em todos os experimentos, foram utilizadas contas fluorescentes (Dragon green). Em (A) e (B), foram utilizadas contas de 0,97 μm de diâmetro e em (C) foram utilizadas contas de diferentes diâmetros. As soluções de sacarose foram confeccionadas em água ultrapura, filtradas através de filtros de 0,2 μm e índice de refração medido por meio de refratômetro portátil, com viscosidade determinada em centimo utilizando Tabelas ISCO e, finalmente, convertidas em unidades SI em mPa.s. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Caudal (μL/h)b | Tempo por passo (min) | Volume dispensado (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 ou mais | 1 ou mais |
| um. Estas são taxas de fluxo de fluido calculadas pelo software da bomba de seringa e são exclusivas para cada diâmetro de seringa usado. As taxas de fluxo permitem o enchimento rápido das linhas e da câmara de fluxo (800 μl/h), seguido por uma diminuição gradual da taxa de fluxo ideal para aprisionamento e visualização | ||
| b. A bomba da seringa pode ser controlada a partir do teclado ou utilizando software fornecido pelo fornecedor. | ||
Tabela 1: Taxas de fluxo de fluido para minimizar bolhas e obter aprisionamento estável.
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Discussion
A montagem cuidadosa do sistema de fluxo é fundamental para o sucesso dos experimentos 4,6. Um dos aspectos mais desafiadores do protocolo é a fixação de conectores à superfície de vidro. Para isso, usamos as duas abordagens a seguir: conectores de tubulação de ajuste press-fit e conjuntos de nanoportas. Os conectores press-fit aderem facilmente ao vidro, seguidos pelo empurrão da tubulação de PTFE para os orifícios pré-formados usando pinças. Quando uma fixação mais estável é necessária, a ligação de conjuntos de nanoportas é preferida. Com uso cuidadoso e limpeza, uma única célula de fluxo de vidro com conjuntos permanentes pode ser usada por mais de 1 ano. Se as células de fluxo precisarem ser trocadas com mais frequência, as células de fluxo PDMS podem ser usadas, pois são uma alternativa excelente e mais barata. Eles podem ser reutilizados, mas o PDMS é suscetível ao inchaço, o que pode alterar o comportamento do fluxo de fluido ao longo do tempo.
As células de fluxo de vidro e PDMS não são indestrutíveis. No laboratório, a vazão máxima utilizada é de 800 μL/h. Se isso for excedido diariamente e/ou por longos períodos de tempo, pode ocorrer deformação de células de fluxo (células de fluxo de vidro) e distorção do PDMS. Embora o procedimento inicial de umectação com metanol e água leve tempo, vale a pena, pois todas as bolhas são eliminadas e também vazamentos nos conectores podem ser detectados. As células de fluxo descritas aqui fornecem flexibilidade aos experimentos que estão sendo feitos. Usando essas abordagens de diferentes células de fluxo, tubulação e fixação de diferentes conectores, as condições experimentais podem ser prontamente adaptadas e rapidamente otimizadas para garantir que os dados ideais sejam obtidos. As células de fluxo de canal em forma de Y são apresentadas, mas uma grande variedade de projetos de dispositivos microfluídicos está disponível em várias empresas, sem e com conectores conectados. Isso proporciona ao investigador uma flexibilidade ainda maior no desenho experimental.
O uso de válvulas de comutação de quatro vias é um método simples e eficaz que garante que, uma vez que o sistema de fluxo é montado e testado, ele efetivamente se torna um ambiente fechado, onde a contaminação é mínima e as bolhas são eliminadas. Este último é crítico, pois as bolhas tendem a comprimir e descomprimir aleatoriamente durante um experimento e isso perturba o fluxo de fluidos, fazendo com que as moléculas de DNA presas se movam de maneiras inesperadas e até quebrem. Grande cuidado deve ser tomado para garantir que eles sejam impedidos de se formar no sistema.
Finalmente, o sistema descrito aqui é otimizado para bioquímica visual, onde uma análise cuidadosa do DNA, contas ligadas a proteínas ou proteínas marcadas com fluorescência podem ser realizadas. Embora o sistema não seja projetado para fazer medições de força com as armadilhas duplas e a adição de fotodetectores de quadrante, as forças podem ser medidas anexando contas de diâmetro diferente às proteínas motoras do DNA, por exemplo, e pedindo ao motor que puxe esse talão contra o fluxo de fluido. Variando a viscosidade da solução, o fluxo de fluido e o diâmetro do talão, uma grande variedade de forças opostas pode ser aplicada para fornecer informações detalhadas sobre a função da proteína motora (Figura 5). Esta é uma maneira simples e barata de medir forças associadas a transações biológicas, mas não tem a precisão associada a abordagens mais sensíveis. Quando a abordagem bioquímica visual é combinada com métodos de detecção de força sensível, imagens mais completas de reações bioquímicas podem ser fornecidas.
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Disclosures
O autor declara não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
A pesquisa no laboratório Bianco é apoiada pelas bolsas do NIH GM100156 e GM144414 para a RPB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
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