A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.
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Artigo de método
Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única
Neste artigo
Resumo
Resumo
A bioquímica visual é uma técnica poderosa para observar as propriedades estocásticas de enzimas individuais ou complexos enzimáticos que são obscurecidos na média que ocorre em estudos de fase a granel. Para alcançar a visualização, pinças ópticas duplas, onde uma armadilha é fixada e a outra é móvel, são focadas em um canal de uma câmara microfluídica multifluxo posicionada no estágio de um microscópio de fluorescência invertida. As pinças ópticas aprisionam moléculas únicas de DNA marcado fluorescentemente e fluem através da câmara e passam pelas contas aprisionadas, esticam o DNA para a forma B (sob força mínima, ou seja, 0 pN) com o ácido nucleico sendo observado como uma corda branca contra um fundo preto. As moléculas de DNA são movidas de um fluxo para o outro, traduzindo o estágio perpendicular ao fluxo para permitir o início das reações de maneira controlada. Para alcançar o sucesso, os dispositivos microfluídicos com canais opticamente claros são acoplados a seringas de vidro mantidas no lugar em uma bomba de seringa. Os melhores resultados usam conectores permanentemente ligados à célula de fluxo, tubulação que é mecanicamente rígida e quimicamente resistente, e que é conectada a válvulas de comutação que eliminam bolhas que proíbem o fluxo laminar.
Introdução
A capacidade de visualizar interações proteína-DNA no nível de molécula única e em tempo real forneceu uma visão significativa da estabilidade do genoma 1,2. Além de trabalhar com moléculas individuais de DNA, uma de cada vez, a capacidade de visualizar transações entre moléculas individuais próximas fornece informações adicionais 3,4,5. A manipulação de moléculas adicionais de DNA requer armadilhas ópticas adicionais, bem como células de fluxo microfluídico multicanal de alta qualidade6.
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Protocolo
1. Alinhamento e teste da armadilha a laser com esferas de poliestireno
NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 1A,B.
CUIDADO: O experimentalista deve usar óculos de proteção apropriados ou óculos de segurança a laser durante o alinhamento do feixe de laser. Como o sistema de pinça óptica descrito aqui usa feixes HeNe e IR, são necessários dois conjuntos separados de vidro de segurança a laser.
- Alinhamento do feixe HeNe
- Posicione todos os componentes ópticos na breadboard. Alinhe a breadboard para que ela fique o mais próximo po....
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Resultados
O teste inicial do alinhamento e resistência do purgador é feito com 1 μm, esferas de poliestireno não fluorescentes. Como a maioria das pesquisas feitas em laboratório usa fluorescência, testamos ainda mais a resistência da armadilha usando 1 μm, esferas de poliestireno verde Dragon (Figura 1D,E). Posteriormente, o trabalho muda para o aprisionamento óptico de complexos DNA-grânulos onde o DNA é corado com o corante bis-intercalante YOYO-114,29<.......
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Discussão
A montagem cuidadosa do sistema de fluxo é fundamental para o sucesso dos experimentos 4,6. Um dos aspectos mais desafiadores do protocolo é a fixação de conectores à superfície de vidro. Para isso, usamos as duas abordagens a seguir: conectores de tubulação de ajuste press-fit e conjuntos de nanoportas. Os conectores press-fit aderem facilmente ao vidro, seguidos pelo empurrão da tubulação de PTFE para os orifícios pré-formados usando pinças. Quando uma fixação .......
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Divulgações
O autor declara não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
A pesquisa no laboratório Bianco é apoiada pelas bolsas do NIH GM100156 e GM144414 para a RPB.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Leica | 506318 ou 506038 | 100x | ; Apenas imagens e aprisionamento óptico; Objetivas APO planejadas otimizadas para imagens de fluorescência |
| Objetiva 10X | Leica | 506263 | Usado para localizar pontos de feixes de laser durante o alinhamento; para encontrar o foco e a posição X-Y na célula de fluxo |
| Grânulos fluorescentes de 1 mm | Bangs Labs | FSDG004 | Usado para desempenho de torneira, determinação da posição focal |
| Grânulos de poliestireno de 1 mm Bangs | Labs CPO1004 | Usado para avaliação do desempenho da armadilha e ligação a moléculas biotiniladas | |
| Objetiva de 63x | Leica | 506081 | Usado para localizar pontos de feixes de laser durante o alinhamento e para encontrar o foco e a posição X-y na célula de fluxo; pode ser usado para aprisionamento óptico, pois tem um diâmetro de abertura traseira idêntico ao 100X; lente de imersão em óleo |
| Laser de alinhamento | Lumentum | 1100 series | Laser HeNe de 10mW que é visível a olho nu que é usado para posicionar a óptica |
| Câmera de alinhamento de feixe | Amscope | MU303 | Uma câmera simples, barata e controlada por software para imagens da posição do feixe |
| Controle de câmera e software de captura de imagem | Hamamatsu | HCImage | Coordena as atividades do Lambda DG4 com a câmera para facilitar a troca rápida de comprimento de onda |
| Câmera; Flash Orca 4 | Câmera CCD Hamamatsu | c13440-20cu | para imagens de experimentos de molécula única |
| Montagem em C para a câmera de alinhamento de feixe | Soluções de imagem pontual | DE50CMT | Fornece posicionamento ideal da câmera para imagens de feixes de laser durante o alinhamento |
| Montagem em C para a câmera | Orca Flash 4Possui um anel de retenção para manter um filtro de bloqueio de IR no lugar. Isso elimina o feixe de infravermelho refletido das armadilhas ópticas e facilita a imagem mais clara de objetos presos. | ||
| Cubo de filtro de fluorescência Cy5 | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Usado em conjunto com Lambda DG4 para imagem apenas Cy5 |
| Fitc-Txred cubo de filtro de fluorescência | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Usado em conjunto com Lambda DG4 para imagem de tubulação FITC e TXRed |
| Fluidics | Grace Bio | 46004 | Tubulação de PTFE como alternativa ao PEEK; funciona bem em algumas células de fluxo. Pode ser usado com células de fluxo PDMS ou células de fluxo de vidro quando os conectores de tubulação Grace Bio fit são usados |
| Cubo de filtro de fluorescência GFP | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Usado em conjunto com Lambda DG4 para criar imagens apenas GFP |
| Células de fluxo de vidro | Translume | Custom | Canais de fluxo claros para imagens (Fig. 2E) |
| Cola de vidro | Loctite | 233841 | seguras e fáceis Conjuntos de nanoportas a células de fluxo de vidro |
| Células de fluxo sanduíche de vidro/PDMS | Serviços de precisão CIDRA Design | personalizado | Células de fluxo construídas de acordo com suas especificações; os canais de imagem são claros (Fig. 2C) |
| Hamilton Solução de limpeza | Hamilton | 18311 | Solução de limpeza suave, mas eficiente para células de fluxo de vidro; não borbulha quando usada com cuidado |
| Sistema de iluminação | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Descontinuado, então recomendo Lambda 721 |
| Sistema de iluminação | Sutter Instrument Lamda | DG4 | Descontinuado, então recomendo Lambda 721 |
| Software de análise de imagem | Cibernética de mídia | Image Pro Premiere | Análise de imagens e rastreamento de molécula única Software de análise de |
| imagem | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Análise de imagens e rastreamento de molécula única |
| Imagem cartão de exibição | Melles Griot | 06 DLA 001 | Produto alternativo da Thorlabs: VRC5 |
| Óleo de imersão | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F livre de fluorescência |
| Ferramentas de alinhamento de feixe de laser | Thor labs | FMP05/M; DGO5-1500-H1; BHM1 | Usado para garantir que as vigas estejam na horizontal e na altura correta |
| Visualizador de feixe | de laser Canadian Photonics labs | IR 3150 | Usado para visualizar pontos de feixe IR em espelhos e alvos |
| Medidor de potência do laser | Thor labs | Medição da saída do laser, bem como da força da armadilha Óculos de | |
| segurança a laser (HeNe) | Thor labs | LG7 ou 8 | Blocos >3 OD unidades de luz de comprimentos de onda >600 nm Óculos de |
| segurança a laser (IR) | Thor labs | LG11 | Blocos >7 unidades OD de luz de comprimentos de onda ³ 1000 nm |
| Mcherry cubo de filtro de fluorescência | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Usado em conjunto com Lambda DG4 para imagem apenas mcherry |
| Microscópio | Leica | DMIRE2 | DIC porta removida para acomodar Espelho de aprisionamento/alinhamento dicróico |
| Software de controle de microscópio | UCSF/shareware | uManager | Controla o microscópio, permite o alinhamento focal das objetivas, bem como o controle de estágio |
| Conjunto de nanoportas | IDEX | N333 | Conectores que são ligados a células de fluxo |
| Suporte de mesa óptica | Thor Labs | PA52502 | Suporte de mesa de isolamento ativo |
| Óptica e lentes | Solar TII | Vários | Espelhos de interferência, telescópios e lentes projetados sob medida para o sistema |
| Células de fluxo PDMS | ufluidix | Células de fluxo personalizadas construídas de acordo com suas especificações; os canais de imagem são claros (Figs. 2B e D) | |
| Tubulação PEEK | IDEX | 1532 | Fornece excelente conexão com células de fluxo e válvulas de comutação Cubo |
| de filtro de fluorescência Pinkel | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Usado em conjunto com o Lambda DG4 para obter imagens de vários fluoróforos rapidamente |
| Conectores de tubulação de encaixe por pressão | GraceBio | 46003 | Conector de silicone transparente com adesivo que se liga bem ao vidro |
| Espelhos de varredura | GSI Lumonics | VM500 | Usado para fornecer controle da segunda armadilha óptica. O GSI Lumonics não existe mais. Espelhos semelhantes podem ser adquiridos na Cambridge |
| Scientific Stage | Micrômetro de estágio Leica | ||
| Microscopia Eletrônica Sciences | 68042-08 | Fornece régua na tela para posicionamento do feixe e calibração do sistema | |
| Válvulas de comutação | IDEX | V-101T | Controle a direção do fluxo de fluido e elimine a introdução de bolhas nas células de fluxo |
| Seringa e coletor de válvula | Bomba | construída sob medida | |
| Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controla o fluxo de fluido através de células de fluxo | |
| Software de bomba de seringa | Harvard Apparatus | 70-6000 | O controle de fluxo fornece controle contínuo e programável do fluxo de fluido |
| Seringas | Hamilton | 81320 | À prova de gás, PTFE Luer Lock, barris de vidro com Êmbolos revestidos de teflon |
| Tampo de mesa | Tampo de | T36H | Tampo óptico ou placa de ensaio |
| Laser de armadilha | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd: Laser YAG; 1064 nm; Laser de 5W |
Referências
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise ....
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Reimpressões e permissões
