यहां हम एसडी चूहों से बीएमएम के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसे माध्यमिक पालन विधि कहा जाता है।
अस्थि खनिज घनत्व में कमी के साथ, हड्डियों में फ्रैक्चर होने की अधिक संभावना होती है, इस प्रकार रोगी के जीवन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया जाता है। हड्डियों की वृद्धि और विकास मुख्य रूप से ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट द्वारा विनियमित होते हैं। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि ओस्टियोक्लास्ट अस्थि मज्जा मोनोसाइट-मैक्रोफेज कोशिकाओं (बीएमएम) से प्राप्त होते हैं। बीएमएम और अन्य हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल अस्थि मज्जा गुहा में स्थित हैं। इसलिए, अलग-अलग और विषम सेल आबादी से एकल स्थिर बीएमएम को अलग करना एक बड़ी चुनौती है। यहां हम एसडी चूहों से बीएमएम के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसे माध्यमिक पालन विधि कहा जाता है। प्राथमिक संस्कृति में 24-48 घंटे के लिए सुसंस्कृत अनुयायी कोशिकाओं को एकत्र किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि लगभग 37.94% कोशिकाएं सीडी 11 बी / सी + (मोनोसाइट-मैक्रोफेज सतह एंटीजन) थीं। टार्ट्रेट प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (टीआरएपी) धुंधला और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि बीएमएम इन विट्रो में ओस्टियोक्लास्ट में अंतर कर सकते हैं। उपरोक्त निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि माध्यमिक पालन कोशिकाओं को ओस्टियोक्लास्ट भेदभाव अनुसंधान के लिए एक उपयुक्त सेलुलर मॉडल के रूप में माना जा सकता है।
यह बताया गया है कि अस्थि मज्जा में मौजूद मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश कोशिकाएं रक्त मोनोसाइट्स और ऊतक मैक्रोफेज 1,2 में अंतर कर सकती हैं। उपरोक्त कोशिकाएं, जो हड्डी के विकास और विकास को संतुलित करने के लिए ओस्टियोक्लास्ट में अंतर कर सकती हैं, आमतौर पर विवो 3,4 में ओस्टियोक्लास्ट को प्रेरित करने के लिए सेल मॉडल के रूप में उपयोग की जाती हैं। अस्थि मज्जा एक विशेष ऊतक है जिसमें कई अलग-अलग प्रकार की कोशिकाएं होती हैं, जिनमें केवल अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं, अस्थि मज्जा मोनोसाइट-मैक्रोफेज कोशिकाएं (बीएमएम), हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल नहीं हैं। वास्तव में, पिछले कई अध्ययनों ने सुझाव दिया कि लंबी हड्डी के अस्थि मज्जा गुहा से बाहर निकलने वाली अनुयायी कोशिकाएं ओस्टियोब्लास्ट, ओस्टियोक्लास्ट, चोंड्रोसाइट्स या एडिपोसाइट्स 5,6,7,8 में अंतर कर सकती हैं। यद्यपि, विभिन्न सजातीय सेल आबादी का उत्पादन करने के लिए विभिन्न अलगाव और संस्कृति विधियों का उपयोग किया गया है, फिर भी विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों से बीएमएम को अलग करने और संवर्धन करने में बड़ी चुनौतियां हैं।
अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर मैक्रोफेज (बीएमएससी) निकालने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश विधियां जटिल 9,10,11 हैं। उदाहरण के लिए, घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए एक विशेष किट की आवश्यकता होती है और ऑपरेशन समय लेने वाला और बोझिल होता है। यह विधि उच्च मात्रा वाले रक्त के नमूनों से बीएमएम के अलगाव के लिए उपयुक्त है, लेकिन अस्थि मज्जा के नमूनों 9,12,13 से नहीं। इसके अलावा, कोलेजनेज पाचन का उपयोग करके ऊतक के नमूने निकालना एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है; अस्थि मज्जा नमूने14,15 से बीएमएम के अलगाव के लिए इस विधि की सिफारिश नहीं की जाती है। इसके अलावा, हालांकि प्रवाह पृथक्करण के परिणामस्वरूप अत्यधिक शुद्ध मोनोसाइट / मैक्रोफेज आबादी हो सकती है, इसके लिए बहुत बड़े नमूना आकार और उच्च उपकरण और उपकरण आवश्यकताओं10,16 की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोबीड संवर्धन विधि बेहद महंगी है और एक सामान्य प्रयोगशाला17 में संभव नहीं है।
इसलिए, वर्तमान अध्ययन में अस्थि मज्जा से मोनोन्यूक्लियर मैक्रोफेज के अलगाव के लिए एक सुविधाजनक, तेज़ और सस्ती विधि प्रस्तावित की गई थी। विभिन्न समय बिंदुओं के लिए पालन की जाने वाली अस्थि मज्जा कोशिकाओं का उपयोग माध्यमिक पालन विधि का उपयोग करके बीएमएम को अलग करने के लिए किया गया था। उपरोक्त विधि के साथ निकाले गए बीएमएम इन विट्रो में ओस्टियोक्लास्ट के गठन को प्रेरित कर सकते हैं, इस प्रकार इन विट्रो में ऑस्टियोपोरोसिस के भविष्य के अध्ययन के लिए एक सरल और सुविधाजनक सेल मॉडल प्रदान करते हैं।
ओस्टियोक्लास्ट हड्डी रोगों की घटना और विकास में शामिल सबसे महत्वपूर्ण सेल प्रकारों में से एक है, साथ ही हड्डी रोग अनुसंधान की प्राथमिक वस्तुओं में से एकहै 20. मैक्रोफेज ऑस्टियोक्लास्ट में अंत?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान सं। एलवाई 19 एच 060001) और झेजियांग पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (संख्या 2022 जेडबी 0 9 3)।
35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Cell culture dish | corning | 430167 | |
Cell culture flask | corning | 430168 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
PBS | Biosharp | BL302A | |
RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |