Summary
在这里，我们提出了一种从SD大鼠中分离BMM的方案，称为二次依从性方法。
Abstract
随着骨矿物质密度的降低，骨骼更容易骨折，从而对患者的生活质量产生负面影响。骨骼的生长发育主要由成骨细胞和破骨细胞调节。人们普遍认为破骨细胞来源于骨髓单核细胞-巨噬细胞（BMM）。BMM和其他造血干细胞位于骨髓腔内。因此，从不同和异质细胞群中分离单个稳定的BMM是一个巨大的挑战。在这里，我们提出了一种从SD大鼠中分离BMM的方案，称为二次依从性方法。收集在原代培养物中培养24-48小时的贴壁细胞。流式细胞术分析显示，约37.94%的细胞为CD11b/c+（单核细胞-巨噬细胞表面抗原）。酒石酸盐耐酸磷酸酶（TRAP）染色和蛋白质印迹分析表明，BBM 可以在体外分化为破骨细胞。上述结果表明，二级依从性细胞可被视为破骨细胞分化研究的合适细胞模型。
Introduction
据报道，存在于骨髓中的单核细胞-巨噬细胞系细胞可以分化成血液中的单核细胞和组织巨噬细胞1，2。上述细胞，其可分化成破骨细胞以平衡骨骼生长和发育，通常用作细胞模型以诱导体内破骨细胞3，4。骨髓是一种含有几种不同类型细胞的特殊组织，其包括但不限于骨髓间充质干细胞、骨髓单核巨噬细胞（BMM）、造血干细胞、内皮细胞和免疫细胞。事实上，之前的几项研究表明，从长骨的骨髓腔中冲出的贴壁细胞可以分化成成成骨细胞，破骨细胞，软骨细胞或脂肪细胞5，6，7，8。虽然已经使用了不同的分离和培养方法来产生不同的均质细胞群，但在从各种不同的细胞类型中分离和培养BMM仍然存在很大的挑战。
已经开发了几种方法来提取骨髓单核巨噬细胞（BMSC）。然而，这些方法中的大多数都是复杂的9，10，11。例如，密度梯度离心需要专门的试剂盒，操作既耗时又繁琐。该方法适用于从高容量血液样本中分离出BMM，但不适用于从骨髓样本9，12，13中分离。此外，使用胶原酶消化提取组织样品是一个复杂且耗时的过程;该方法不推荐用于从骨髓样本14，15中分离BMM。此外，尽管流动分离可以导致高度纯化的单核细胞/巨噬细胞群，但它需要非常大的样品量和高仪器设备要求10，16。此外，微珠富集法极其昂贵，并且在一般实验室17中是不可行的。
因此，在目前的研究中，提出了一种方便，快速，廉价的方法，用于从骨髓中分离单核巨噬细胞。使用不同时间点粘附的骨髓细胞通过二次粘附方法分离BMM。上述方法提取的BMM可以在 体外诱导破骨细胞的形成，从而为今后的 体外骨质疏松症研究提供简单方便的细胞模型。
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Protocol
本研究的所有实验均按照浙江医科大学实验动物研究中心的动物实验指南（批准号：IACUC-20181029-11）进行。
1. 细胞提取
- 将Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠，1-10天大，雄性或雌性）放入装有CO2 的安乐死笼中，以30%-70%的容器体积/分钟的平衡率。大鼠失去意识后（20-60分钟），通过宫颈脱位对大鼠实施安乐死，以确保无痛死亡。
- 将大鼠浸泡在75%的酒精中10分钟进行消毒。
- 用剪刀和镊子小心地去除大鼠的所有四肢，用移液管用PBS吸出并冲洗粘附在四肢上的血液。
- 将5 mL青霉素/链霉素溶液加入500 mL DMEM中，搅拌均匀。取50 mL无菌离心管，加入5 mL FBS和45 mL DMEM培养基，充分混合，得到含有1%青霉素/链霉素溶液的10%FBS DMEM。将2mL上述培养基加入5mL管中。
- 将肢体骨转移到5 mL管中。使用剪刀将管中的肢体骨切成小块（1-3mm），混合匀浆以将骨髓细胞重新悬浮到培养基中。静置5分钟，直到组织碎片沉降到管的底部。
- 将10mL的10%FBS DMEM加入100mm培养皿中，然后将上清液转移到培养皿中。吸出上清液时，避免将组织碎片转移到培养皿中。
- 在37°C和5%CO2 下孵育约24小时。在此孵育时间之后，大多数间充质干细胞将粘附在培养皿壁上并缓慢生长，而大多数BMM仍将悬浮在培养基中。
- 将100mm培养皿中的细胞悬浮液转移到新的25 cm2 烧瓶中，并继续在37°C和5%CO2 下培养细胞24小时。小心地取出旧培养基，并在BMM粘附在烧瓶壁上后更换为新鲜培养基。
- 当烧瓶中的细胞达到80%-90%汇合度时进行亚培养。
注意：所有细胞在37°C和5%CO2下培养。在培养过程中，细胞形态逐渐统一。细胞很大，形状不规则，径向生长并以圆盘的形式附着在烧瓶上，在那里可以观察到多个细胞核。
2. 细胞的流式细胞癌染色
- 胰蛋白酶在37°C下使用1-2mL商用胰蛋白酶和5%CO2 消化5分钟，并计数二级贴壁细胞以确保最终细胞计数为100，000 /样品（用Neubauer血细胞计数器计数细胞）。
- 将细胞分成三组（500μLPBS含有100，000个细胞）：（1）含有未染色细胞的空白对照组;（2）同种型对照组;（3）实验组（CD11b/c染色）。
- 在冰上孵育一抗（空白对照组无抗体;同种型对照组抗CD11同种型对照，0.6μL抗体/样品，1μg/样品;实验组抗CD11b / c，1μL抗体/样品，1μg/样品）在冰上孵育30分钟。
- 以300-350× g 离心5分钟，弃去上清液，并用500μLPBS重悬细胞。重复上述步骤一次，以确保未结合的一抗被冲走。
- 将相应的二抗（空白对照组无抗体;同种型对照组和实验组的山羊抗兔IgG，0.25μL抗体/样品，1：2，000）在黑暗中的冰上孵育30分钟。
- 以300-350× g 离心5分钟，弃去上清液，并用500μLPBS重悬细胞。重复上述步骤一次，以确保未结合的第二抗体被冲走。
- 通过流式细胞术检测CD11b / c阳性细胞（10，000个细胞/样品），并通过软件（例如，FlowJo 7.5）分析数据。
注意：为了获得CD11b / c +细胞的最终百分比，使用以下公式：实验组中CD11b / c +细胞的百分比 - 同种型对照组中CD11 +细胞的百分比。
3. 赖特-吉姆萨染色
- 将已传代三次的贴壁次级细胞接种到35mm2 细胞攀爬片（1×106 个细胞/孔）上，并在37°C和5%CO2 下培养24小时。
- 丢弃培养基，用PBS洗涤三次。
- 将Wright-Giemsa染料溶液（0.5 mL-0.8 mL）加入细胞攀爬片中1分钟。
- 用棉签将染料与蒸馏水（0.5 mL-0.8 mL）混合，静置10分钟。
- 用蒸馏水洗涤染料溶液，然后干燥1-3分钟。在显微镜下观察。
4. 陷阱染色
- 将已传代三次的贴壁次级细胞接种到35mm2 细胞攀爬片（1×106 个细胞/孔）上，并在37°C和5%CO2 下培养24小时。
- 用 10% FBS DMEM 或破骨细胞诱导培养基替换旧培养基，并补充 50 ng/mL 核因子 κB 配体 （RANKL） 受体激活剂和 30 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF），并在 37 °C 和 5% CO2 下再培养 7 天。
- 根据制造商的方案用TRAP染色试剂盒染色细胞，并在显微镜下观察。
注意：TRAP阳性细胞被定义为破骨细胞，在光学显微镜下是紫色的。使用ImageJ软件测量TRAP阳性细胞的数量。
5. 免疫印迹
- 将已传代三次的贴壁次级细胞接种在35mm2 细胞攀爬片（1×106 个细胞/孔）上，并培养24小时。
- 用新鲜的10%FBS DMEM或破骨诱导培养基（50ng / mL的RANKL和30 ng / mL的M-CSF）替换旧培养基，并在37°C和5%CO2下再培养7天。
- 用RIPA缓冲液提取总细胞蛋白，由10%SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜18，19。
- 用5%脱脂粉（25毫升）封闭2小时，洗涤三次，每次10分钟，用TBS-吐温20（TBST）洗涤。
- 在4°C下孵育一抗过夜（抗β肌动蛋白，抗TRAP和抗组织蛋白酶K;所有一抗均以1：1，000稀释，10mL稀释抗体/条带），并用TBST洗涤三次。
- 将二抗（山羊抗兔IgG，1：2，000稀释，10mL稀释抗体/条带）在室温下孵育2小时，并用TBST洗涤三次。使用显影溶液可视化蛋白质条带。
注意：上述蛋白质的表达水平被归一化为β肌动蛋白。
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Representative Results
次级贴壁细胞群稳定且均匀。随着细胞的连续增殖，大多数细胞变得更大，形状不规则并生长成径向贴壁盘（图2C，D）。流式细胞术显示，表达CD11b / c（单核巨噬细胞谱系细胞表面的分子标记物）的细胞百分比约为37.94%（图2A，B）。为了进一步验证CD11b / c阳性细胞是单核细胞 - 巨噬细胞谱系细胞，在用RANKL和M-CSF处理细胞后诱导次级贴壁细胞分化为破骨细胞。TRAP染色结果显示，与对照组相比，RANKL和M-CSF诱导的细胞内紫红色颗粒数量显著增加（图2E，F）。此外，破骨细胞特异性蛋白TRAP和组织蛋白酶K的表达水平显着增加（图2G，H）。
图 1：二级贴壁细胞提取方法的流程图。请点击此处查看此图的大图。
图2：（A-B）经过三代次级贴壁细胞的稳定培养，通过流式细胞术检测CD11b / c阳性细胞。（C-D）显示了三代后继发性贴壁细胞的形态（C表示白光，D表示Wright-Giemsa染色）。（E-F）TRAP染色用于检测RANKL和M-CSF对破骨细胞形成的影响（E用于控制;F 代表 RANKL 和 M-CSF）。（G-H）用RANKL和M-CSF处理细胞7 d，通过蛋白质印迹分析测定TRAP和组织蛋白酶K的表达水平。数据表示为三个独立实验的平均±SD。P <对照组为 0.001。TRAP，酒石酸盐抗酸磷酸酶;RANKL，核因子-κB配体的受体激活剂;M-CSF，巨噬细胞集落刺激因子。请点击此处查看此图的大图。
表1：提取巨噬细胞的方法 请点击这里下载此表。
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Discussion
破骨细胞是参与骨病发生和发展的最重要细胞类型之一，也是骨病研究的主要对象之一20.单核细胞/巨噬细胞可分化为破骨细胞。由于单核巨噬细胞（RAW264.7细胞）购买成本太高，并且在培养过程中容易被激活，因此很难使用该细胞系进行 体外 分化实验。虽然已经开发了几种从骨髓中提取单核细胞/巨噬细胞的方法，包括密度梯度离心，胶原酶消化，微球富集和流式细胞术（表1），但这些方法非常耗时，同时需要高样品量和昂贵的设备。因此，目前的研究旨在提出一种简单快速的方法从骨髓样本中提取单核细胞/巨噬细胞。
骨髓中有许多细胞群，包括BMSC，内皮细胞和免疫细胞以及BMM。众所周知，骨髓细胞可以分化成成成骨细胞，而这一过程将影响BMM分化成破骨细胞21。均匀稳定的BMM是 体外诱导破骨细胞分化的重要因素，因此在分离和提取BMM时考虑这些限制因素尤为重要。同时，BMM分化成破骨细胞的能力在连续传代过程中也会减弱。因此，从骨髓中分离出BMM并成功诱导它们进入破骨细胞是具有挑战性的。
我们发现骨髓中贴壁细胞的依从时间存在差异。更具体地说，BMSCs在培养0-24 h期间基本上粘附在培养皿壁上，而BMMs在培养皿壁24 h后开始粘附在培养皿壁上。基于上述发现，选择二次依从性方法分离BMMs，选择乳吸SD大鼠（年龄，1~10 d龄）提取BMMs，因为年轻大鼠的BMMs表现出更强的分化能力。收集SD大鼠骨髓细胞，培养24 h后，转移细胞悬浮液，再培养24 h。收集的次级贴壁细胞含有大量的BMM。培养后，次级贴壁细胞逐渐纯化并变得稳定和均匀。流式细胞术结果表明，CD11b/c阳性细胞的百分比达到约37.94%。此外，TRAP染色和蛋白质印迹分析表明，提取的BMM可以分化为破骨细胞。这一发现与先前的一项研究一致，该研究还表明，通过二级依从性方法提取的BMM可以成功分化为破骨细胞22。
二级粘附方法可用于简单快速地从骨髓中提取单核巨噬细胞，而无需高科技实验室设备。同时，该方法适用于从小骨髓样品中分离细胞，从而克服了以前通常用于提取单核巨噬细胞的方法中观察到的繁琐且耗时的困难。总体而言，通过二次粘附法提取的BMM 可以在体外成功分化为破骨细胞，从而为破骨细胞的 体外 研究提供稳定的细胞模型。
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Disclosures
作者声明，他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项工作得到了浙江省自然科学基金的支持（赠款编号：LY19H060001）和浙江省中医药科技计划项目（编号：2022ZB093）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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