Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolering av BMMer fra SD-rotter, kalt sekundær tilslutningsmetode.
Abstract
Med en reduksjon av benmineraltetthet er bein mer sannsynlig å sprekke, og påvirker dermed pasientens livskvalitet negativt. Veksten og utviklingen av bein er hovedsakelig regulert av osteoblaster og osteoklaster. Det har blitt allment akseptert at osteoklaster er avledet fra benmarg monocytt-makrofagceller (BMMer). BMMer og andre hematopoietiske stamceller ligger i benmargshulen. Derfor er det en stor utfordring å isolere enkeltstabile BMMer fra forskjellige og heterogene cellepopulasjoner. Her presenterer vi en protokoll for isolering av BMMer fra SD-rotter, kalt sekundær tilslutningsmetode. Tilhengere celler dyrket i 24-48 timer i primærkulturen ble samlet inn. Strømningscytometrisk analyse viste at omtrent 37,94% av cellene var CD11b/c+ (monocytt-makrofag overflateantigen). Tartratresistent syrefosfatase (TRAP) farging og vestlig blot analyse viste at BMMer kunne skille seg ut i osteoklaster in vitro. Ovennevnte funn antydet at sekundære tilslutningsceller kunne betraktes som en egnet cellulær modell for osteoklastdifferensieringsforskning.
Introduction
Det har blitt rapportert at monocytt-makrofag avledningsceller som finnes i benmargen kan skille seg ut i blodmonocytter og vevsmakrofager 1,2. Ovennevnte celler, som kan skille seg ut i osteoklaster for å balansere beinvekst og utvikling, brukes ofte som en cellemodell for å indusere osteoklaster i vivo 3,4. Benmarg er et spesielt vev som inneholder flere forskjellige typer celler, som inkluderer, men ikke bare er begrenset til benmarg mesenchymale stamceller, benmarg monocytt-makrofagceller (BMMs), hematopoietiske stamceller, endotelceller og immunceller. Faktisk antydet flere tidligere studier at tilhengerceller rushed ut av benmargshulen i det lange beinet kunne skille seg ut i osteoblaster, osteoklaster, kondrocytter eller adipocytter 5,6,7,8. Selv om ulike isolasjons- og kulturmetoder har blitt brukt til å produsere forskjellige homogene cellepopulasjoner, er det fortsatt store utfordringer med å isolere og dyrke BMMer fra en rekke forskjellige celletyper.
Flere metoder er utviklet for å trekke ut benmarg mononukleære makrofager (BMSCer). Imidlertid er flertallet av disse metodene komplekse 9,10,11. For eksempel krever tetthet gradient sentrifugering et spesialisert sett, og operasjonen er tidkrevende og tungvint. Denne metoden er egnet for isolering av BMMer fra blodprøver med høyt volum, men ikke fra benmargsprøver 9,12,13. I tillegg er utvinning av vevsprøver ved hjelp av kollagenal fordøyelse en kompleks og tidkrevende prosedyre; Denne metoden anbefales ikke for isolering av BMMer fra benmargsprøver14,15. I tillegg, selv om strømningsseparasjon kan resultere i svært rensede monocytt/makrofagpopulasjoner, krever det svært store utvalgsstørrelser og høye instrument- og utstyrskrav10,16. I tillegg er mikrobeadberikelsesmetoden ekstremt dyr og er ikke mulig i et generelt laboratorium17.
Derfor ble det i den nåværende studien foreslått en praktisk, rask og billig metode for isolering av mononukleære makrofager fra benmargen. Benmargceller som fulgte for forskjellige tidspunkter, ble brukt til å isolere BMMer ved hjelp av en sekundær tilslutningsmetode. BMMs ekstrahert med ovennevnte metode kan indusere dannelsen av osteoklaster in vitro, og dermed gi en enkel og praktisk cellemodell for fremtidig studie av osteoporose in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter i denne studien ble utført i samsvar med retningslinjene for dyreforsøk fra Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center (Godkjenning nr. IACUC-20181029-11).
1. Celleutvinning
- Sett Sprague-Dawley rotter (SD rotter, 1-10 dager gammel, mann eller kvinne) i eutanasi bur fylt med CO2 med en balansert hastighet på 30%-70% containervolum / minutt. Etter at rottene mister bevisstheten (20-60 min), euthanize rotten ved cervical dislokasjon for å sikre en smertefri død.
- Senk rottene i 75% alkohol i 10 min for desinfeksjon.
- Fjern forsiktig alle lemmer av rotten med saks og tang, aspirer med PBS ved hjelp av en pipette og skyll blodet som holder seg til lemmer.
- Tilsett 5 ml penicillin/streptomycinoppløsning i 500 ml DMEM og bland godt. Ta et 50 ml sterilt sentrifugerør, tilsett 5 ml FBS og 45 ml DMEM medium, og bland grundig for å oppnå en 10% FBS DMEM som inneholder 1% penicillin/streptomycinoppløsning. Tilsett 2 ml av det ovennevnte kulturmediet i et 5 ml rør.
- Overfør lembenene inn i 5 ml-røret. Bruk saks til å kutte lembenene i røret i små biter (1-3 mm) og bland homogenatet for å suspendere benmargscellene i kulturmediet. Stå i 5 min til vevsfragmentene slo seg ned til bunnen av røret.
- Tilsett 10 ml 10% FBS DMEM i en 100 mm kulturrett, og overfør deretter supernatanten til kulturretten. Når du aspirerer supernatanten, unngå å overføre vevsrester til kulturretten.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i ca. 24 timer. Etter denne inkubasjonstiden vil flertallet av mesenchymale stamceller holde seg til kulturrettveggen og vokse sakte, mens de fleste BMMer fortsatt vil bli suspendert i kulturmediet.
- Overfør cellefjæringen i 100 mm kulturfatet til en ny 25 cm2 kolbe og fortsett å dyrke cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i ytterligere 24 timer. Fjern det gamle mediet forsiktig og erstatt det med friskt medium etter at BMMs har festet seg til kolbeveggen.
- Underkultur da cellene i kolben nådde 80% -90% samløp.
MERK: Alle cellene ble dyrket ved 37 °C og 5 % CO2. Under kulturen ble cellemorfologien gradvis forenet. Cellene var store, uregelmessig formet, radialt voksende og festet til kolben i en form for plate, hvor flere kjerner kunne observeres.
2. FACS farging av cellen
- Trypsin fordøye ved hjelp av 1-2 ml kommersiell trypsin ved 37 °C og 5 % CO2 i 5 min og telle sekundære tilhengerceller for å sikre et endelig celleantall på 100 000/prøve (telle celler med Neubauer hemocytometer).
- Del cellene i tre grupper (500 μL PBS inneholder 100 000 celler): (1) den tomme kontrollgruppen som inneholder celler som ikke er i bruk. (2) isotype kontrollgruppen; og (3) den eksperimentelle gruppen (CD11b/c farging).
- Inkuber primære antistoffer (ingen antistoff for blank kontrollgruppe; anti-CD11 isotypekontroll for isotypekontrollgruppen, 0,6 μL antistoff/prøve, 1 μg/prøve; anti-CD11b/c for den eksperimentelle gruppen, 1 μL antistoff/prøve, 1 μg/prøve) på is i 30 minutter.
- Sentrifuger ved 300-350 x g i 5 minutter, kast supernatanten og resuspend cellene med 500 μL PBS. Gjenta prosedyren ovenfor én gang for å sikre at de ubundne primærantistoffene vaskes bort.
- Inkuber det tilsvarende sekundære antistoffet (ikke noe antistoff for blank kontrollgruppen; geit anti-kanin IgG for isotypekontrollen og de eksperimentelle gruppene, 0,25 μL antistoff / prøve, 1:2,000) på is i mørket i 30 minutter.
- Sentrifuger ved 300-350 x g i 5 minutter, kast supernatanten og resuspend cellene med 500 μL PBS. Gjenta prosedyren ovenfor én gang for å sikre at de ubundne andre antistoffene vaskes bort.
- Oppdag de positive CD11b/c-cellene ved flowcytometri (10 000 celler/prøve) og analyser dataene etter programvare (f.eks.
MERK: For å oppnå den endelige prosentandelen av CD11b/c+-celler ble følgende formel brukt: Prosentandel av CD11b / c + celler i den eksperimentelle gruppen - prosentandelen av CD11 + celler i isotypekontrollgruppen.
3. Wright-Giemsa farging
- Frø de tilhengerne sekundærceller som har blitt sendt tre ganger på 35 mm2 celle klatring ark (1 × 106 celler / brønn) og kultur ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Kast kulturmediet og vask tre ganger med PBS.
- Tilsett Wright-Giemsa fargestoffløsning (0,5 ml-0,8 ml) i celleklatringsarket i 1 min.
- Bland fargestoffet med destillert vann (0,5 ml-0,8 ml) med en bomullspinne, og stå i 10 min.
- Vask fargestoffoppløsningen med destillert vann, og tørk deretter i 1-3 min. Vær oppmerksom under et mikroskop.
4. TRAP flekker
- Frø de tilhengerne sekundærceller som har blitt sendt tre ganger på 35 mm2 celle klatring ark (1 × 106 celler / brønn) og kultur ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Bytt ut det gamle mediet med 10 % FBS DMEM- eller osteoklastinduksjonsmedium supplert med 50 ng/ml reseptoraktivator av kjernefysisk faktor-κB-ligand (RANKL) og 30 ng/ml makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), og kultur ved 37 °C og 5 % CO2 i ytterligere 7 dager.
- Flekk cellene med TRAP-fargesettet i henhold til produsentens protokoll og observer under et mikroskop.
MERK: TRAP-positive celler ble definert som osteoklaster, som var lilla under et lysmikroskop. Antall TRAP-positive celler ble målt ved hjelp av ImageJ-programvare.
5. Vestlig blott
- Frø de tilhengerne sekundærcellene som har blitt passert tre ganger på 35 mm2 celleklatringsark (1 × 106 celler / brønn) og kultur i 24 timer.
- Bytt ut det gamle mediet med friskt 10 % FBS DMEM- eller osteoklastinduksjonsmedium (50 ng/ml RANKL og 30 ng/ml M-CSF) og kultur i ytterligere 7 dager ved 37 °C og 5 % CO2.
- Trekk ut totale cellulære proteiner med RIPA-buffer, separer med 10% SDS-PAGE, og overfør til polyvinyllidfluoridmembraner18,19.
- Blokker med 5% skimmilk pulver (25 ml) i 2 timer og vask tre ganger, i 10 min hver gang, med TBS-Tween 20 (TBST).
- Inkuber primære antistoffer ved 4 °C over natten (anti-β-aktin, anti-TRAP og antikatepsin K; alle primære antistoffer ble fortynnet 1:1000, 10 ml fortynnet antistoff/bånd), og vask tre ganger med TBST.
- Inkuber det sekundære antistoffet (geit anti-kanin IgG, 1:2,000 fortynning, 10 ml fortynnet antistoff / bånd) ved romtemperatur i 2 timer, og vask tre ganger med TBST. Visualiser proteinbåndene ved hjelp av en utviklende løsning.
MERK: Uttrykksnivåene til de ovennevnte proteinene ble normalisert til β-aktin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den sekundære tilhengercellepopulasjonen var stabil og ensartet. Med den kontinuerlige celleproliferasjonen ble de fleste cellene større, med uregelmessig form og vokste til en radial tilhengerdisk (figur 2C, D). Flowcytometri viste at prosentandelen celler som uttrykte CD11b/c, en molekylær markør på overflaten av monocytt-makrofagsavstamningsceller, var ca. 37,94 % (figur 2A, B). For ytterligere å verifisere at CD11b/c positive celler var monocytt-makrofag avledningsceller, ble differensiering av sekundære tilfølgende celler i osteoklaster indusert etter cellebehandling med RANKL og M-CSF. TRAP-fargeresultatene viste at sammenlignet med kontrollgruppen ble antallet intracellulære lilla-røde granulater betydelig økt i celler indusert med RANKL og M-CSF (figur 2E, F). Videre ble uttrykksnivåene til osteoklastspesifikke proteiner TRAP og cathepsin K betydelig økt (figur 2G,H).
Figur 1: Flytskjema over den sekundære metoden for uttrekking av tilhengere.
Figur 2: (A-B) Etter tre generasjoner stabil kultur av sekundære adherentceller ble CD11b/c positive celler påvist ved strømningscytometri. (CD) Morfologien til sekundære adherentceller etter tre generasjoner er vist (C for hvitt lys, D for Wright-Giemsa farging). (E-F) TRAP farging ble brukt til å oppdage effekten av RANKL og M-CSF på osteoklastdannelse (E for kontroll; F for RANKL og M-CSF). (G-H) Cellene ble behandlet med RANKL og M-CSF i 7 dager, og uttrykksnivåene trap og cathepsin K ble bestemt av vestlig blotanalyse. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. P < 0,001 vs. kontrollgruppen. TRAP, tartratresistent syrefosfatase; RANKL, reseptoraktivator av kjernefysisk faktor-κB ligand; M-CSF, makrofagkolonistimulerende faktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Metode for å trekke ut makrofager Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoklaster er en av de viktigste celletypene som er involvert i forekomst og utvikling av beinsykdommer, samt en av de primære gjenstandene for beinsykdomsforskning20. Monocytt/makrofager kan skille seg ut i osteoklaster. Siden mononukleære makrofager (RAW264.7-celler) er for dyre å kjøpe og lett aktiveres under kultur, er det vanskelig å utføre in vitro differensieringsforsøk ved hjelp av denne cellelinjen. Selv om det er utviklet flere metoder for å trekke ut monocytter/makrofager fra benmarg, inkludert tetthetsgraderingssentrifugering, kollagenasefordøyelse, mikrosfæreberikelse og strømningscytometri (tabell 1), er disse metodene tidkrevende, mens de krever høye prøvevolumer og kostbart utstyr. Derfor hadde den nåværende studien som mål å foreslå en enkel og rask metode for å trekke ut monocytec / makrofager fra benmargsprøver.
Det er mange cellepopulasjoner i benmarg, inkludert BMSCer, endotelceller og immunceller i tillegg til BMMer. Som vi alle vet at BMSCer kan skille seg ut i osteoblaster, og denne prosessen vil påvirke differensiering av BMMer i osteoklaster21. Ensartede og stabile BMMer er viktige faktorer for å indusere osteoklastdifferensiering in vitro, så det er spesielt viktig å vurdere disse begrensende faktorene når du isolerer og trekker ut BMMer. Samtidig vil BMMs evne til å skille seg ut i osteoklaster også svekkes under den kontinuerlige passasjen. Derfor er det utfordrende å isolere BMMer fra benmarg og lykkes med å indusere dem til osteoklaster.
Vi fant at det er forskjeller i tilslutningstiden til tilhengerceller i benmargen. Mer spesifikt festet BMSCer seg i utgangspunktet til kulturrettveggen under 0-24 timers kultur, mens BMMs begynner å holde seg til kulturrettveggen etter 24 timer. Basert på ovennevnte funn ble den sekundære tilslutningsmetoden valgt for å isolere BMMs. Suckling SD rotter (alder, 1-10 dager gammel) ble valgt for å trekke ut BMMer, siden BMMs av unge rotter har en sterkere differensieringsevne. Benmargscellene til SD-rotter ble samlet inn, og etter dyrking i 24 timer ble cellefjæringen overført og dyrket i ytterligere 24 timer. De innsamlede sekundære tilhengercellene inneholdt et stort antall BMMer. Etter kultur ble de sekundære tilhengercellene gradvis renset og ble stabile og ensartede. Strømningscytometriresultatene viste at prosentandelen av CD11b/c positive celler nådde ca. 37,94 %. Videre viste TRAP-farging og vestlig blotanalyse at de ekstraherte BMM-ene kunne skille seg ut i osteoklaster. Dette funnet var i samsvar med en tidligere studie som også antyder at BMMer ekstrahert ved sekundær tilslutningsmetoden kunne differensieres til osteoklaster22.
Den sekundære tilslutningsmetoden kan brukes til å enkelt og raskt trekke ut mononukleære makrofager fra benmargen, uten å kreve høyteknologisk laboratorieutstyr. Samtidig er denne metoden egnet for å isolere celler fra en liten benmargsprøve, og dermed overvinne de tungvinte og tidkrevende vanskelighetene som ble observert i de tidligere metodene som vanligvis brukes til å trekke ut mononukleære makrofager. Totalt sett kan BMMer som ekstraheres ved den sekundære tilslutningsmetoden, differensieres til osteoklaster in vitro, og dermed gi en stabil cellemodell for in vitro-studiet av osteoklaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (tilskuddsnr. LY19H060001) og Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr. 2022ZB093).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Ono, T., Nakashima, T.
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al.
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
