Här presenterar vi ett protokoll för isolering av BMM från SD-råttor, kallad sekundär vidhäftningsmetod.
Med en minskning av benmineraltätheten är ben mer benägna att spricka, vilket påverkar patientens livskvalitet negativt. Tillväxten och utvecklingen av ben regleras huvudsakligen av osteoblaster och osteoklaster. Det har varit allmänt accepterat att osteoklaster härrör från benmärgsmonocyt-makrofagceller (BMM). BMM och andra hematopoetiska stamceller finns i benmärgshålan. Därför är det en enorm utmaning att isolera enstaka stabila BMM från olika och heterogena cellpopulationer. Här presenterar vi ett protokoll för isolering av BMM från SD-råttor, kallad sekundär vidhäftningsmetod. Vidhäftande celler odlade i 24-48 h i primärkulturen samlades in. Flödescytometrisk analys visade att cirka 37,94% av cellerna var CD11b / c + (monocyt-makrofagytantigen). Tartratresistent syrafosfatas (TRAP) färgning och western blot analys visade att BMM kunde differentiera till osteoklaster in vitro. Ovanstående resultat föreslog att de sekundära följsamhetscellerna kunde betraktas som en lämplig cellulär modell för osteoklastdifferentieringsforskning.
Det har rapporterats att monocyt-makrofag-härstamningsceller som finns i benmärgen kan differentiera till blodmonocyter och vävnadsmakrofager 1,2. Ovanstående celler, som kan differentieras till osteoklaster för att balansera bentillväxt och utveckling, används ofta som en cellmodell för att inducera osteoklaster in vivo 3,4. Benmärg är en speciell vävnad som innehåller flera olika typer av celler, som inkluderar men inte bara är begränsade till benmärgsmesenkymala stamceller, benmärgsmonocyt-makrofagceller (BMM), hematopoetiska stamceller, endotelceller och immunceller. Faktum är att flera tidigare studier föreslog att vidhäftande celler som rusade ut ur benmärgshålan i det långa benet kunde differentieras till osteoblaster, osteoklaster, kondrocyter eller adipocyter 5,6,7,8. Även om olika isolerings- och odlingsmetoder har använts för att producera olika homogena cellpopulationer, finns det fortfarande stora utmaningar med att isolera och odla BMM från en mängd olika celltyper.
Flera metoder har utvecklats för att extrahera benmärgsmononukleära makrofager (BMSC). Majoriteten av dessa metoder är dock komplexa 9,10,11. Till exempel kräver densitetsgradientcentrifugering ett specialiserat kit och operationen är tidskrävande och besvärlig. Denna metod är lämplig för isolering av BMM från blodprover med hög volym, men inte från benmärgsprover 9,12,13. Dessutom är extraktion av vävnadsprover med användning av kollagenasuppslutning ett komplext och tidskrävande förfarande; Denna metod rekommenderas inte för isolering av BMM från benmärgsprover14,15. Dessutom, även om flödesseparation kan resultera i högrenade monocyt- / makrofagpopulationer, kräver det mycket stora provstorlekar och höga instrument- och utrustningskrav10,16. Dessutom är mikroberikningsmetoden extremt dyr och är inte genomförbar i ett allmänt laboratorium17.
Därför föreslogs i den aktuella studien en bekväm, snabb och billig metod för isolering av mononukleära makrofager från benmärgen. Benmärgsceller vidhäftade under olika tidpunkter användes för att isolera BMM med hjälp av en sekundär vidhäftningsmetod. BMM extraherade med ovanstående metod kan inducera bildandet av osteoklaster in vitro, vilket ger en enkel och bekväm cellmodell för framtida studier av osteoporos in vitro.
Osteoklaster är en av de viktigaste celltyperna som är involverade i förekomst och utveckling av bensjukdomar, liksom ett av de primära föremålen för bensjukdomsforskning20. Monocyt/makrofager kan differentieras till osteoklaster. Eftersom mononukleära makrofager (RAW264.7-celler) är för dyra att köpa och lätt aktiveras under odling är det svårt att utföra in vitro-differentieringsexperiment med denna cellinje. Även om flera metoder har utvecklats för att extrahera monocy…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (bidrag nr. LY19H060001) och Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr 2022ZB093).
35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Cell culture dish | corning | 430167 | |
Cell culture flask | corning | 430168 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
PBS | Biosharp | BL302A | |
RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |