Summary
El presente protocolo describe métodos para la expresión transgénica en corazones de rata y ratón mediante inyección intramiocárdica directa del virus bajo guía ecocardiográfica. Los métodos para la evaluación de la susceptibilidad de los corazones a las arritmias ventriculares mediante la estimulación eléctrica programada de corazones aislados, perfundidos con Langendorff, también se explican aquí.
Abstract
La enfermedad cardíaca es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Debido a la facilidad de manejo y abundancia de cepas transgénicas, los roedores se han convertido en modelos esenciales para la investigación cardiovascular. Sin embargo, las arritmias cardíacas letales espontáneas que a menudo causan mortalidad en pacientes con enfermedades cardíacas son raras en modelos roedores de enfermedad cardíaca. Esto se debe principalmente a las diferencias de especies en las propiedades eléctricas cardíacas entre humanos y roedores y plantea un desafío para el estudio de las arritmias cardíacas utilizando roedores. Este protocolo describe un enfoque para permitir la expresión transgénica eficiente en miocardio ventricular de ratón y rata utilizando inyecciones intramusculares guiadas por ecocardiografía de virus recombinantes (adenovirus y virus adenoasociados). Este trabajo también describe un método para permitir una evaluación confiable de la susceptibilidad cardíaca a las arritmias utilizando corazones aislados de ratón y rata perfundidos por Langendorff con estimulaciones eléctricas adrenérgicas y programadas. Estas técnicas son críticas para estudiar los trastornos del ritmo cardíaco asociados con la remodelación cardíaca adversa después de lesiones, como el infarto de miocardio.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo, cobrando la vida de 18 millones de personas solo en 20171. Los roedores, especialmente ratones y ratas, se han convertido en el modelo más utilizado en la investigación cardiovascular debido a la facilidad de manejo y la disponibilidad de varias líneas de sobreexpresión o knockout transgénicas. Los modelos de roedores han sido fundamentales para comprender los mecanismos de la enfermedad y para identificar posibles nuevas dianas terapéuticas en el infarto de miocardio2, la hipertensión3, la insuficiencia cardíaca4 y la aterosclerosis5. Sin embargo, el uso de roedores en estudios de arritmias cardíacas está limitado por su pequeño tamaño cardíaco y frecuencia cardíaca más rápida en comparación con los modelos humanos o animales grandes. Por lo tanto, las arritmias letales espontáneas en ratones o ratas después del infarto de miocardio son raras2. Los investigadores se ven obligados a centrarse en cambios secundarios indirectos que podrían reflejar un sustrato pro-arrítmico, como la fibrosis o la expresión génica, sin mostrar cambios significativos en la carga de arritmias o tendencias pro-arrítmicas. Para superar esta limitación, en el presente protocolo se describe un método que permite una evaluación fiable de la susceptibilidad de los corazones de ratón y rata a las taquiarritmias ventriculares después de la modificación genética 6,7 o del infarto de miocardio 2. Este método combina la estimulación del receptor adrenérgico con la estimulación eléctrica programada para inducir taquiarritmias ventriculares en corazones aislados de8 ratones y ratas perfundidos por Langendorff.
Los enfoques estándar para la transferencia de genes virales en el tejido miocárdico de roedores a menudo implican la exposición del corazón por toracotomía 9,10,11, que es un procedimiento invasivo y se asocia con retraso en la recuperación de los animales después del procedimiento. Este artículo describe un método de inyección intramiocárdica directa de virus bajo guía de imágenes de ultrasonido para la sobreexpresión de transgenes. Este procedimiento menos invasivo permite una recuperación más rápida del animal después de la inyección viral y menos lesiones tisulares, en comparación con la toracotomía, reduce el dolor postoperatorio y la inflamación en el animal y, por lo tanto, permite una mejor evaluación de los efectos de los genes transgénicos en la función cardíaca.
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Protocol
Todos los métodos y procedimientos descritos fueron aprobados por la junta de revisión ética de investigación animal de la Universidad de Ottawa y el comité de revisión de bioseguridad del Instituto del Corazón de la Universidad de Ottawa. Los protocolos de seguridad desarrollados incluyen que todos los procedimientos relacionados con adenovirus recombinante o virus adenoasociado (AAV) se realizaron en un gabinete de bioseguridad de nivel II. Todos los elementos en contacto con el virus fueron completamente descontaminados después del experimento. Para el presente estudio se utilizaron ratones Ctnnb1 flox/flox y αMHC-MerCreMer (8-12 semanas de edad, de ambos sexos) y ratas Sprague-Dawley (200-250 g, macho). Los animales fueron obtenidos de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). Todos los procedimientos relacionados con los animales fueron realizados por personal que ha sido capacitado y aprobado por los comités reguladores institucionales. Se utilizó equipo de protección personal adecuado durante todos los procedimientos.
1. Expresión transgénica viral en tejidos ventriculares de roedores
NOTA: Almacene el adenovirus recombinante o AAV que expresa el gen diana y el virus de control correspondiente, como Ad-GFP (título de 1 x 1010 PFU/ml) o AAV9-GFP (título de 1 x 1013 GC/ml) (ver Tabla de materiales), en un congelador de -80 °C.
- El día de la inyección del virus, descongele el virus en hielo. Aspirar el virus que expresa el gen diana y el virus control en dos jeringas separadas (volumen = 50 μL) con 30 G 1/2 agujas y mantener en hielo hasta su uso.
NOTA: Cualquier burbuja en la jeringa y la aguja debe retirarse cuidadosamente. - Administrar buprenorfina a ratas o ratones (0,05 mg/kg para ratas, 0,1 mg/kg para ratones, subcutáneos), 1 h más tarde inducir la anestesia con isoflurano al 3%, y mantener el isoflurano al 2% (en oxígeno al 100% a un caudal de 0,5-1,0 L/min) para el procedimiento posterior.
- Pellizque suavemente el cuerpo del animal (por ejemplo, la cola) con un par de fórceps, y si el animal no responde al pellizco con ningún movimiento corporal, se confirma la anestesia adecuada.
- Mantenga la temperatura corporal a 37 °C utilizando una almohadilla térmica eléctrica. Afeite el cabello en la región del pecho con un cortapelos.
NOTA: Se debe tener cuidado al usar una almohadilla térmica eléctrica debido a la posible distribución desigual del calor. - Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar el secado de la córnea.
- Mantenga al animal en posición supina y use un sistema de imágenes preclínicas (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes por ultrasonido del corazón del animal en la orientación del eje corto.
NOTA: Los siguientes pasos se realizan en un gabinete de bioseguridad de nivel II que proporciona un ambiente estéril. Se emplean procedimientos de seguridad estándar, incluidos aquellos con manejo seguro de la aguja. - Esterilice la región inferior izquierda del pecho del animal con rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina y alcohol tres veces en un movimiento circular.
- Bajo la guía de imágenes por ultrasonido, inserte la aguja de 30 G 1/2 de la jeringa que contiene el virus tal como se preparó en el paso 1.1. en el pecho del animal a través del lado inferior izquierdo del pecho del cuerpo.
- Acerque la punta de la aguja a la pared libre frontal del ventrículo izquierdo e inyecte lentamente 10-15 μL del virus. Verifique la inyección exitosa en imágenes de ultrasonido por el brillo mejorado cerca de la punta de la aguja.
NOTA: La cantidad de virus inyectado en cada sitio no es más de 15 μL para prevenir el daño físico a los tejidos del miocardio. - Extraiga la aguja del corazón e insértela en otras regiones del ventrículo izquierdo para una segunda y tercera inyección de la misma cantidad de virus.
NOTA: El número total de sitios de inyección está determinado por el diseño experimental. Si se requiere expresión transgénica focal, solo se necesita una inyección; Si se requiere una expresión transgénica más difusa, generalmente se necesitan múltiples sitios de inyección (de tres a cinco). - Después de completar las inyecciones, devuelva al animal a su jaula.
- Vigile cuidadosamente al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y devuélvalo a su habitación de alojamiento.
- Administrar buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, dos veces al día para ratones, 0,05 mg/kg, dos veces al día para ratas, subcutánea) al animal durante los 2 días siguientes. Devuelva a los animales al vivero y monitoree diariamente cualquier signo inusual de dolor o angustia, y si los encuentra, trate a los animales según los protocolos del comité institucional de cuidado animal.
2. Evaluación de la susceptibilidad a la arritmia cardíaca
NOTA: A los 4-6 días después de la inyección de adenovirus y 1-2 semanas después de la inyección de AAV, evalúe la susceptibilidad de los corazones de los animales a las arritmias cardíacas siguiendo los pasos 2.1.-2.2.
- Realizar la perfusión de Langendorff del corazón de rata o ratón.
- Preparar la solución de Tyrode añadiendo lo siguiente a 1 L de agua: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); y glucosa, 1,8 g (10 mM). Ajuste el pH a 7.40 con NaOH (ver Tabla de materiales).
- Filtrar la solución con un filtro de 0,2 μm y burbujear con 100%O2 continuamente durante los pasos 2.1.6.-2.2.8.
- Administrar heparina a la rata o ratón (500 U/kg, inyección intraperitoneal) y 10 min después anestesiar al animal con isoflurano al 3%. Asegurar una anestesia adecuada con un suave pellizco en el cuerpo.
- Use un bisturí para hacer una incisión vertical de 1-1.5 cm en la línea clavicular media para una toracotomía izquierda y exponga el corazón.
- Recoger el corazón cortando con un par de tijeras a nivel del arco aórtico e inmediatamente poner el corazón en una solución Tyrode helada.
NOTA: Se tiene precaución de no dañar el corazón durante la recolección del corazón. - Canular la aorta del corazón con una aguja roma (18 G para ratas; 23 G para ratones) conectada a un sistema de perfusión de Langendorff modificado (ver Tabla de materiales) en el modo de caudal constante. Ajuste el caudal para mantener la presión de perfusión en 70-80 mmHg.
NOTA: Cualquier burbuja en la aguja de perfusión debe eliminarse antes de la canulación aórtica. El uso de un microscopio de disección facilita la canulación . - Colocar el corazón canulado en un plato de plástico de 9,10 cm recubierto de elastómero de silicona con el ventrículo izquierdo hacia arriba y perfundir el corazón 9,12 con solución Tyrode de burbujas de O2 a 37 °C.
- Verifique la canulación aórtica correcta al comienzo de la perfusión observando el lavado de sangre del corazón durante los primeros dos o tres latidos del corazón y el cambio del color del corazón de rojo a pálido.
- Coloque los electrodos de un sistema de ECG de un animal pequeño (consulte la Tabla de materiales) alrededor del corazón insertándolos en el recubrimiento de elastómero de silicona en el plato (Figura 1). Registre ECG utilizando un software compatible.
- Realizar estimulación de receptores adrenérgicos y estimulación eléctrica programada para inducir taquiarritmias ventriculares.
- Después de una canulación aórtica exitosa, continúe perfundiendo el corazón con la solución de Tyrode durante 20 minutos para estabilizar la preparación del corazón.
- Añadir 1 μM de isoproterenol (ver Tabla de materiales) a la solución de Tyrode utilizada para la perfusión cardíaca en los pasos 2.2.3.-2.2.8.
- Después de 10 minutos de perfusión de isoproterenol, estimule el corazón en el ápice con dos electrodos de platino conectados a un estimulador eléctrico (consulte la Tabla de materiales).
- Comience con el procedimiento de estimulación (Figura 2), que incluye 10 estímulos consecutivos (intervalos S1, 5 V, 100 ms) que son seguidos por un estímulo adicional (S2) con un intervalo inicial de 80 ms. Reducir repetidamente el intervalo S2 en 2 ms cada vez hasta que el latido del corazón ya no pueda ser capturado (es decir, alcanzar el período refractario efectivo del corazón, ERP)13.
- Monitorizar cualquier taquiarritmia ventricular inducida (incluyendo taquicardia ventricular y fibrilación) mediante ECG.
- Si el procedimiento anterior no induce arritmias, agregue otro estímulo adicional (S3) después de S2 con los mismos intervalos inicial (80 ms) y decremento (en 2 ms) hasta que se alcance el ERP.
- Si las taquiarritmias ventriculares aún no son inducidas, agregue un estímulo adicional más (S4) después de S3 con los mismos intervalos iniciales y decrecientes hasta que se alcance el ERP.
- Si las taquiarritmias ventriculares aún no se inducen (como se espera en los corazones sanos de control), detenga el protocolo de estimulación eléctrica y considere que el corazón no es inducible.
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Representative Results
Cuando se perfunde siguiendo el protocolo descrito aquí (Figura 1), un corazón aislado de rata o ratón late rítmica y establemente durante al menos 4 h. Si el diseño experimental requiere un período más largo de perfusión cardíaca, es útil agregar albúmina a la solución de perfusión para reducir la aparición de edema miocárdico después de la perfusión prolongada14. La inclusión de isoproterenol en la solución de perfusión imita la activación del sistema nervioso simpático que ocurre en muchas afecciones arritmogénicas como el infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca. Durante la estimulación eléctrica programada, la estimulación exitosa del corazón se verifica mediante (1) la captura 1: 1 del latido del corazón durante los estímulos consecutivos S1 y (2) el complejo QRS prolongado (o más amplio) durante la estimulación S1 (Figura 3 y Figura 4). Esto último se debe a que el corazón está siendo acelerado en el ápice y la conducción más lenta de la activación en los tejidos ventriculares aumenta la duración del complejo QRS.
Como se demuestra en los datos publicados2,7 (Figura 3 y Figura 4), estas estimulaciones adrenérgicas y eléctricas combinadas no indujeron taquiarritmias ventriculares (definidas como al menos tres complejos ventriculares prematuros consecutivos, PVC) en corazones de ratones sanos (corazones de tipo salvaje operados de forma simulada en la Figura 3) o en corazones de rata control (corazones de rata inyectados con Ad-GFP de control en la Figura 4 ). Por el contrario, el mismo protocolo indujo taquiarritmias ventriculares en el 77% de los corazones de ratones de tipo salvaje después del infarto de miocardio (Figura 3B) y en tres de cada cuatro corazones de rata después de la inyección intramiocárdica de Ad-Wnt3a (Figura 4). Esto demuestra la alta fidelidad de este enfoque inductor de arritmias ventriculares.
La expresión exitosa del transgén intramiocárdico después de la inyección del virus se puede verificar mediante niveles de ARNm y proteínas regulados al alza del transgén en los tejidos del miocardio identificados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real, Western blot o inmunohistoquímica. Si el virus expresa un gen reportero fluorescente, como GFP, la transducción viral exitosa también se puede verificar en cardiomiocitos aislados, vivos y únicos por su expresión de GFP9.
Figura 1: Perfusión de Langendorff de un corazón de rata aislado. El corazón se recoge del animal, y la aorta se canula con una aguja roma de 18 G. La aguja está conectada a una jeringa de 10 ml llena con una solución Tyrode a 37 °C a una presión de 70-80 mmHg. El corazón se coloca en un plato de plástico de 10 cm recubierto de elastómero de silicona con el ventrículo izquierdo hacia arriba. Los electrodos (colores rojo, verde y negro) de un sistema de ECG de un animal pequeño se colocan alrededor del corazón insertándolos en el recubrimiento de elastómero de silicona en el plato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estimulaciones adrenérgicas y eléctricas del corazón perfundido por Langendorff. (A) El corazón de rata o ratón se perfunde en un sistema Langendorff como se muestra en la Figura 1, y se agrega isoproterenol 1 μM a la solución de Tyrode perfundidora para estimular los receptores adrenérgicos β1 del corazón. El corazón es estimulado en el ápice por dos electrodos de platino conectados a un estimulador. (B) Representación de la estimulación eléctrica programada. Para obtener más información, consulte el paso 2.2. La figura se modifica con permiso de Wang et al.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Taquiarritmias ventriculares inducidas en corazones de ratón después de un infarto de miocardio. (A) ECG representativo ex vivo (derivación II) que muestra taquicardia ventricular inducida por estimulación eléctrica programada (PES) (TV, definida como tres o más complejos ventriculares prematuros consecutivos, PVC) en un corazón de ratón de tipo salvaje (WT) (a las 8 semanas después del infarto de miocardio, IM) cuando se estimula con un estímulo adicional (S2) pero solo un PVC único en un corazón específico β-catenina knockout (KO) corazón de ratón (a las 8 semanas después del IM) cuando se estimula con tres estímulos adicionales (S4). Se incluyó isoproterenol (1 μM) en la solución de Tyrode perfundente durante la estimulación de PES. Los ratones knockout de β-catenina (Ctnnb1) específicos para el corazón se generaron mediante ratones cruzados Ctnnb1 flox / flox (con exones de 2 a 6 floxed) con ratones αMHC-MerCreMer. A la edad de 8-12 semanas, Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− ratones (KO) y compañero de camada Ctnnb1 flox/flox; Los ratones αMHC-MerCreMer−/− (utilizados como ratones de tipo salvaje de control) recibieron inyecciones subcutáneas diarias de tamoxifeno (20 mg/kg/día) durante 5 días consecutivos antes de ser asignados al grupo de IM o simulado. (B) Resumen de PVC y VT inducidos por PSE en corazones WT y KO a 1 semana u 8 semanas después del IM. Se asignó una puntuación de arritmia a cada corazón de acuerdo con los criterios de la tabla de la izquierda. A las 8 semanas después del IM, la TV fue inducida con éxito en el 77% de los corazones WT, pero solo en el 18% de los corazones KO. Los datos fueron analizados por ANOVA bidireccional y una comparación post-hoc de Bonferroni. Las barras de error indican error estándar (SE). La figura se reproduce con permiso de Wang et al.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Taquiarritmias ventriculares inducidas en corazones de rata después de la inyección intramiocárdica de un virus que expresa Wnt3a. (A) Arritmias ventriculares inducidas por PES en corazones de ratas (200-250 g, macho, Sprague-Dawley) en el día 4-6 después de la inyección intramiocárdica de un adenovirus que expresa Wnt3a (Ad-Wnt3a, abajo) pero no en corazones inyectados con adenovirus de control que expresa GFP (Ad-GFP, arriba). Los corazones fueron aislados y perfundidos en un sistema Langendorff. Se incluyó isoproterenol (1 μM) en la solución de Tyrode perfundente durante la estimulación de PES. Ex vivo El ECG se registró continuamente durante la estimulación de PES. Tenga en cuenta que se utilizaron 11 estímulos S1 consecutivos (color azul) en este experimento. (B) Resumen de los estudios en el Panel (A): La taquicardia ventricular (TV) fue inducida por PES en tres de cada cuatro corazones con inyección de Ad-Wnt3a, pero en ninguno de los cuatro corazones con Ad-GFP de control. La figura se reproduce con permiso de Lu et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varios pasos son críticos para el éxito de la preparación cardíaca aislada perfundida por Langendorff. En primer lugar, es importante evitar cualquier daño al corazón durante la recolección del corazón (por ejemplo, debido a apretar o cortar accidentalmente con las tijeras). En segundo lugar, es fundamental poner el corazón recogido en una solución fría de Tyrode lo antes posible, ya que esto detendrá los latidos del corazón y reducirá el consumo de oxígeno del corazón. En tercer lugar, la inserción de la aguja en la aorta no debe ser demasiado profunda; idealmente, la punta de la aguja está cerca del nivel de la válvula aórtica para que el corazón esté bien perfundido a través de las arterias coronarias. Por último, las burbujas en la aguja de perfusión deben eliminarse antes de la canulación aórtica; generalmente es útil encender la bomba durante unos segundos justo antes de la canulación para eliminar la burbuja en la punta de la aguja.
La preparación para el corazón perfundido de Langendorff tiene varias ventajas sobre los estudios in vivo en animales. En primer lugar, es posible controlar con precisión la concentración y la duración de los fármacos aplicados al corazón (por ejemplo, isoproterenol, como se utiliza en este estudio). En segundo lugar, permite un fácil acceso a las diferentes regiones del corazón para la estimulación (por ejemplo, estimulación eléctrica en el ápice en este manuscrito) o registro de señales fisiológicas (por ejemplo, mapeo óptico de los tejidos ventriculares después de cargar con un tinte sensible al Ca2+ o sensible al voltaje, que no se describe aquí). Además, la función cardíaca, como la contractilidad ventricular, se puede medir fácilmente insertando un balón en el ventrículo izquierdo y conectando el balón a un transductor de presión8. En tercer lugar, las propiedades intrínsecas del corazón, como la frecuencia cardíaca y la contractilidad ventricular, pueden investigarse sin los factores de complicación en los estudios in vivo, como el sistema nervioso autónomo y las hormonas circulantes. Sin embargo, la limitación del corazón perfundido por Langendorff es que carece de la diafonía entre diferentes órganos o tejidos in vivo15,16,17 a través de factores circulantes o del sistema nervioso autónomo, que pueden ser actores críticos en algunos estudios.
El registro de ECG ex vivo del corazón perfundido por Langendorff, como se describe aquí y en las publicaciones anteriores 2,6,7,9, tiene la ventaja del registro sin contacto y no plantea ninguna alteración de la función del corazón en comparación con otros enfoques como el mapeo óptico, que requiere la carga de Ca2+ -colorantes sensibles o sensibles al voltaje y el uso de un desacoplador de excitación-contracción para reducir el movimiento mecánico del corazón (como la blebbistatina)12,18. Sin embargo, el mapeo óptico tiene la ventaja de proporcionar información más detallada sobre las actividades eléctricas del corazón, como el origen de los latidos del corazón, el patrón de activación miocárdica y la velocidad de conducción miocárdica.
El método de inyección intramiocárdica directa de un virus, como se describe aquí, también se puede utilizar para la entrega de otros materiales terapéuticos 19,20,21,22,23,24, tales como biomateriales, exones, ARNm modificado y cardiomiocitos derivados de células madre. La inyección intramiocárdica guiada por imágenes por ultrasonido tiene varias ventajas sobre el enfoque tradicional de inyección basada en toracotomía. En primer lugar, es menos invasivo y permite una recuperación más rápida de los animales después del procedimiento de inyección. Esto reduce los efectos asociados al procedimiento en los animales (por ejemplo, los causados por el dolor postoperatorio y la inflamación del tejido torácico cuando se utiliza una toracotomía invasiva). En segundo lugar, las imágenes de ultrasonido verifican la inyección exitosa del virus en el corazón, lo que aumenta la consistencia y la reproducibilidad de los resultados. Sin embargo, la limitación del enfoque de inyección de virus guiada por ultrasonido es que las ubicaciones de los sitios de inyección del virus no se pueden controlar con tanta precisión como en el enfoque basado en toracotomía, que permite la localización visual de las diferentes regiones del corazón.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las Subvenciones para Proyectos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (PJT-148918 y PJT-180533, a WL), el Premio al Investigador de Carrera Temprana del CIHR (AR8-162705, a WL), la Beca McDonald de la Fundación del Corazón y el Accidente Cerebrovascular de Canadá (HSFC) y el Premio al Nuevo Investigador (S-17-LI-0866, a WL), Becas Estudiantiles (a JW y YX) y una Beca Postdoctoral (a AL) de los Fondos de Dotación Cardíaca de la Universidad de Ottawa en el Instituto del Corazón. Los autores agradecen al Sr. Richard Seymour por su apoyo técnico. La figura 2 se creó con Biorender.com con licencias aprobadas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
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