げっ歯類の心臓におけるウイルス導入遺伝子発現と心不整脈リスクの評価
Summary
本プロトコルは、心エコー検査ガイダンスの下でのウイルスの直接心筋内注射によるラットおよびマウス心臓における導入遺伝子発現の方法を記載する。孤立したランゲンドルフ灌流心臓のプログラムされた電気刺激による心室性不整脈に対する心臓の感受性の評価方法もここで説明されています。
Abstract
心臓病は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因です。取り扱いが容易でトランスジェニック株が豊富であるため、げっ歯類は心血管研究に不可欠なモデルになっています。しかし、心臓病患者の死亡を引き起こすことが多い自然発生的な致死性心不整脈は、心臓病のげっ歯類モデルではまれです。これは主に、ヒトとげっ歯類の心臓の電気的特性の種の違いによるものであり、げっ歯類を用いた心不整脈の研究に課題をもたらします。このプロトコルは、組換えウイルス(アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)の心エコー検査ガイド下筋肉内注射を使用して、マウスおよびラットの心室心筋における効率的な導入遺伝子発現を可能にするアプローチについて説明しています。この研究では、アドレナリン作動性とプログラムされた電気刺激の両方を備えた単離されたランゲンドルフ灌流マウスおよびラット心臓を使用して、不整脈に対する心臓感受性の信頼性の高い評価を可能にする方法についても概説しています。これらの技術は、心筋梗塞などの損傷後の有害な心臓リモデリングに関連する心臓リズム障害を研究するために重要です。
Introduction
心血管疾患は世界の主要な死因であり、2017年だけで1,800万人の命を奪っています1。げっ歯類、特にマウスおよびラットは、取り扱いが容易であり、様々なトランスジェニック過剰発現またはノックアウトラインが利用可能であるため、心血管研究において最も一般的に使用されるモデルとなっている。げっ歯類モデルは、疾患メカニズムを理解し、心筋梗塞2、高血圧3、心不全4、およびアテローム性動脈硬化症5の潜在的な新しい治療標的を特定するための基礎となっています。しかしながら、心不整脈の研究におけるげっ歯類の使用は、ヒトまたは大型動物モデルと比較して、心臓のサイズが小さく、心拍数が速いために制限されている。したがって、心筋梗塞後のマウスまたはラットにおける自然発生的致死性不整脈はまれです2。研究者は、不整脈負荷または不整脈促進傾向に意味のある変化を示すことなく、線維症や遺伝子発現などの不整脈支持の基質を反映する可能性のある間接的な二次的変化に焦点を当てることを余儀なくされています。この制限を克服するために、遺伝子改変6、7 または心筋梗塞2 後の心室頻脈性不整脈に対するマウスおよびラット心臓の感受性の信頼できる評価を可能にする方法が、本プロトコルに記載されている。この方法は、アドレナリン受容体刺激とプログラムされた電気刺激を組み合わせて、孤立したランゲンドルフ灌流8 匹のマウスとラットの心臓に心室頻脈性不整脈を誘発します。
げっ歯類の心筋組織におけるウイルス遺伝子導入のための標準的なアプローチは、しばしば開胸術9,10,11による心臓の曝露を含み、これは侵襲的処置であり、処置後の動物の回復の遅延と関連している。この記事では、導入遺伝子の過剰発現に対する超音波画像ガイダンスの下でウイルスを直接心筋内注射する方法について説明します。この侵襲性の低い手順は、開胸術と比較して、ウイルス注射後の動物の回復を早め、組織損傷を減らし、動物の術後の痛みや炎症を軽減し、したがって、トランスジェニック遺伝子の影響をより適切に評価することができます心機能。
Protocol
Representative Results
Discussion
ランゲンドルフ灌流された単離心臓製剤の成功には、いくつかのステップが重要です。まず、心臓採取中の心臓への損傷を避けることが重要です(たとえば、誤って絞ったり、はさみで切ったりすることによる)。第二に、これは心拍を停止し、心臓の酸素消費量を減らすため、収集した心臓をできるだけ早く冷たいタイロード溶液に入れることが重要です。第三に、大動脈への針の挿入は深?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ衛生研究所(CIHR)プロジェクト助成金(PJT-148918およびPJT-180533、WL)、CIHR早期キャリア研究者賞(AR8-162705、WL)、カナダ心臓脳卒中財団(HSFC)マクドナルド奨学金および新研究者賞(S-17-LI-0866、WL)、学生奨学金(JWおよびYXへ)、およびオタワ大学心臓基金からのポスドクフェローシップ(ALへ)心臓研究所。著者は、リチャード・シーモア氏の技術サポートに感謝します。 図 2 は、承認されたライセンスを持つ Biorender.com で作成されました。
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
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