Summary
O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.
Abstract
A doença cardíaca é a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Devido à facilidade de manuseio e abundância de cepas transgênicas, os roedores tornaram-se modelos essenciais para a pesquisa cardiovascular. No entanto, arritmias cardíacas letais espontâneas que muitas vezes causam mortalidade em pacientes com doença cardíaca são raras em modelos de roedores de doença cardíaca. Isto é principalmente devido às diferenças de espécies nas propriedades elétricas cardíacas entre humanos e roedores e representa um desafio para o estudo de arritmias cardíacas usando roedores. Este protocolo descreve uma abordagem para permitir a expressão transgênica eficiente no miocárdio ventricular de camundongos e ratos usando injeções intramusculares guiadas por ecocardiografia de vírus recombinante (adenovírus e vírus adenoassociado). Este trabalho também descreve um método para permitir uma avaliação confiável da suscetibilidade cardíaca a arritmias usando corações isolados de camundongos e ratos perfundidos por Langendorff com estímulos elétricos adrenérgicos e programados. Essas técnicas são fundamentais para o estudo de distúrbios do ritmo cardíaco associados ao remodelamento cardíaco adverso após lesões, como o infarto do miocárdio.
Introduction
A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo, ceifando a vida de 18 milhões de pessoas apenas em 20171. Roedores, especialmente camundongos e ratos, tornaram-se o modelo mais comumente usado em pesquisas cardiovasculares devido à facilidade de manuseio e à disponibilidade de várias linhas de superexpressão ou knockout transgênicas. Modelos de roedores têm sido fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença e para a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos no infarto do miocárdio2, hipertensãoarterial 3, insuficiência cardíaca4 e aterosclerose5. No entanto, o uso de roedores em estudos de arritmias cardíacas é limitado pelo seu pequeno tamanho cardíaco e frequência cardíaca mais rápida em comparação com modelos humanos ou animais de grande porte. Portanto, arritmias letais espontâneas em camundongos ou ratos após infarto do miocárdio são raras2. Os pesquisadores são forçados a se concentrar em alterações secundárias indiretas que possam refletir um substrato pró-arrítmico, como fibrose ou expressão gênica, sem mostrar mudanças significativas na carga de arritmia ou tendências pró-arrítmicas. Para superar essa limitação, um método que permite uma avaliação confiável da suscetibilidade de corações de camundongos e ratos a taquiarritmias ventriculares após modificação genética 6,7 ou infarto do miocárdio2 é descrito no presente protocolo. Este método combina a estimulação do receptor adrenérgico com a estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares em8 corações isolados, perfundidos por Langendorff e camundongos.
As abordagens padrão para a transferência de genes virais no tecido miocárdico de roedores geralmente envolvem a exposição do coração por toracotomia 9,10,11, que é um procedimento invasivo e está associado ao atraso na recuperação dos animais após o procedimento. Este artigo descreve um método de injeção intramiocárdica direta de vírus sob orientação por ultrassonografia para a superexpressão de transgenes. Este procedimento menos invasivo permite uma recuperação animal mais rápida após a injeção viral e menos lesão tecidual, em comparação com a toracotomia, reduz a dor pós-operatória e a inflamação no animal e, assim, permite uma melhor avaliação dos efeitos dos genes transgênicos na função cardíaca.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os métodos e procedimentos descritos foram aprovados pelo conselho de revisão ética de pesquisa animal da Universidade de Ottawa e pelo comitê de revisão de biossegurança do Instituto do Coração da Universidade de Ottawa. Os protocolos de segurança desenvolvidos incluem que todos os procedimentos que lidam com adenovírus recombinante ou vírus adenoassociado (AAV) foram realizados em um gabinete de biossegurança de nível II. Todos os itens em contato com o vírus foram completamente descontaminados após o experimento. Para o presente estudo, foram utilizados camundongos Ctnnb1 flox/flox e αMHC-MerCreMer (8-12 semanas de idade, de ambos os sexos) e ratos Sprague-Dawley (200-250g, macho). Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados por pessoal treinado e aprovado por comités institucionais de regulamentação. Foram utilizados equipamentos de proteção individual adequados durante todos os procedimentos.
1. Expressão transgênica viral em tecidos ventriculares de roedores
NOTA: Armazenar adenovírus recombinante ou AAV que expresse o gene alvo e o vírus de controle correspondente, como Ad-GFP (título de 1 x 10 10 PFU/mL) ou AAV9-GFP (título de 1 x 1013 GC/mL) (ver Tabela de Materiais), em um freezer de -80 °C.
- No dia da injeção do vírus, descongele o vírus no gelo. Aspirar o vírus que expressa o gene alvo e o vírus de controlo em duas seringas separadas (volume = 50 μL) com 30 G 1/2 agulhas e manter no gelo até à sua utilização.
NOTA: Quaisquer bolhas na seringa e na agulha devem ser cuidadosamente removidas. - Administrar buprenorfina a ratos ou camundongos (0,05 mg/kg para ratos, 0,1 mg/kg para camundongos subcutâneos), 1 h depois induzir anestesia com isoflurano a 3% e manter o isoflurano a 2% (em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5-1,0 L/min) para o procedimento subsequente.
- Aperte suavemente o corpo do animal (por exemplo, a cauda) com um par de pinças e, se o animal não responder ao beliscão com nenhum movimento do corpo, a anestesia adequada é confirmada.
- Mantenha a temperatura corporal a 37 °C usando uma almofada de aquecimento elétrica. Raspe o cabelo na região do peito usando um cortador de cabelo.
NOTA: Deve-se ter cuidado ao usar uma almofada de aquecimento elétrico devido à potencial distribuição de calor desigual. - Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
- Mantenha o animal em decúbito dorsal e utilize um sistema de imagiologia pré-clínica (ver Tabela de Materiais) para a realização de imagens de ecografia do coração do animal na orientação de eixo curto.
NOTA: As etapas a seguir são executadas em um gabinete de biossegurança de nível II que fornece um ambiente estéril. Procedimentos de segurança padrão, incluindo aqueles com manuseio seguro de agulhas, são empregados. - Esterilizar a região inferior esquerda do tórax do animal com rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool três vezes em um movimento circular.
- Sob orientação de imagem de ultrassom, insira a agulha 30 G 1/2 da seringa que contém o vírus, conforme preparado na etapa 1.1. no peito do animal através do lado inferior esquerdo do peito do corpo.
- Aproxime-se da ponta da agulha na parede livre frontal do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10-15 μL do vírus. Verifique se a injeção bem-sucedida em imagens de ultrassom pelo brilho aprimorado perto da ponta da agulha.
NOTA: A quantidade de vírus injetada em cada local não é superior a 15 μL para evitar danos físicos aos tecidos miocárdicos. - Retire a agulha do coração e insira-a em outras regiões do ventrículo esquerdo para uma segunda e terceira injeção da mesma quantidade de vírus.
NOTA: O número total de locais de injeção é determinado pelo desenho experimental. Se for necessária expressão transgênica focal, apenas uma injeção é necessária; se for necessária uma expressão transgénica mais difusiva, são geralmente necessários múltiplos locais de injeção (três a cinco). - Após a conclusão das injeções, devolva o animal à sua gaiola.
- Monitore cuidadosamente o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e devolvê-lo à sua sala de alojamento.
- Administrar buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, duas vezes por dia para ratinhos, 0,05 mg/kg, duas vezes por dia para ratos, subcutâneo) ao animal durante os 2 dias seguintes. Devolva os animais ao biotério e monitore diariamente quaisquer sinais incomuns de dor ou angústia e, se encontrados, trate os animais de acordo com os protocolos do comitê institucional de cuidados com os animais.
2. Avaliação da suscetibilidade à arritmia cardíaca
NOTA: Em 4-6 dias após a injeção de adenovírus e 1-2 semanas após a injeção de AAV, avalie a suscetibilidade dos corações dos animais a arritmias cardíacas seguindo os passos 2.1.-2.2.
- Realizar perfusão Langendorff do coração de rato ou rato.
- Preparar a solução de Tyrode adicionando o seguinte a 1 L de água: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); e glicose, 1,8 g (10 mM). Ajuste o pH para 7,40 com NaOH (ver Tabela de Materiais).
- Filtrar a solução com um filtro de 0,2 μm e borbulhar com 100% de O 2 continuamente durante os passos 2.1.6.-2.2.8 .
- Administrar heparina no rato ou rato (500 U/kg, injeção intraperitoneal) e 10 minutos depois anestesiar o animal com isoflurano a 3%. Garanta a anestesia adequada com uma pitada suave no corpo.
- Use um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1-1,5 cm na linha clavicular média para uma toracotomia esquerda e expor o coração.
- Colete o coração cortando com uma tesoura no nível do arco aórtico e coloque imediatamente o coração em solução gelada de Tyrode.
NOTA: Recomenda-se cautela para não danificar o coração durante a coleta do coração. - Canular a aorta do coração com uma agulha contundente (18 G para ratos; 23 G para camundongos) conectada a um sistema de perfusão Langendorff modificado (ver Tabela de Materiais) no modo de fluxo constante. Ajuste a taxa de fluxo para manter a pressão de perfusão em 70-80 mmHg.
NOTA: Quaisquer bolhas na agulha de perfusão devem ser removidas antes da canulação aórtica. O uso de um microscópio de dissecação facilita a canulação. - Colocar o coração canulado num prato de plástico de 9,10 cm revestido de elastómero de silicone com o ventrículo esquerdo virado para cima e perfundir o coração 9,12 com uma solução de Tyrode de 2 bolhas A 37 °C.
- Verifique a canulação aórtica correta no início da perfusão, observando a lavagem do sangue do coração durante os primeiros dois a três batimentos cardíacos e a mudança da cor do coração de vermelho para pálido.
- Coloque os eletrodos de um sistema de ECG de animais de pequeno porte (ver Tabela de Materiais) ao redor do coração, inserindo-os no revestimento de elastômero de silicone no prato (Figura 1). Grave o ECG usando software compatível.
- Realizar estimulação do receptor adrenérgico e estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares.
- Após a canulação aórtica bem-sucedida, continue a perfundir o coração com solução de Tyrode por 20 minutos para estabilizar a preparação do coração.
- Adicionar 1 μM de isoproterenol (ver Tabela de Materiais) à solução de Tyrode utilizada para perfusão cardíaca nos passos 2.2.3.-2.2.8.
- Após 10 min de perfusão de isoproterenol, estimular o coração no ápice com dois eletrodos de platina conectados a um estimulador elétrico (ver Tabela de Materiais).
- Comece com o procedimento de estimulação (Figura 2), que inclui 10 estímulos consecutivos (intervalos S1, 5 V, 100 ms) que são seguidos por um estímulo extra (S2) com intervalo inicial de 80 ms. Reduza repetidamente o intervalo S2 em 2 ms de cada vez até que o batimento cardíaco não possa mais ser capturado (ou seja, atingindo o período refratário efetivo do coração, ERP)13.
- Monitore quaisquer taquiarritmias ventriculares induzidas (incluindo taquicardia ventricular e fibrilação) por ECG.
- Se nenhuma arritmia for induzida pelo procedimento acima, adicione outro estímulo extra (S3) após S2 com os mesmos intervalos iniciais (80 ms) e decréscimo (por 2 ms) até que o ERP seja atingido.
- Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas, adicione mais um estímulo extra (S4) após S3 com os mesmos intervalos inicial e de decréscimo até que o ERP seja atingido.
- Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas (como esperado no controle de corações saudáveis), interrompa o protocolo de estimulação elétrica e considere o coração não induzível.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quando perfundido seguindo o protocolo descrito aqui (Figura 1), um coração isolado de rato ou rato bate rítmica e de forma estável por pelo menos 4 h. Se o delineamento experimental requer um período mais longo de perfusão cardíaca, é útil adicionar albumina à solução de perfusão para reduzir a ocorrência de edema miocárdico após perfusão de longa duração14. A inclusão de isoproterenol na solução de perfusão imita a ativação do sistema nervoso simpático que ocorre em muitas condições arritmogênicas, como infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca. Durante a estimulação elétrica programada, o sucesso da estimulação cardíaca é verificado por (1) a captura 1:1 dos batimentos cardíacos durante os estímulos S1 consecutivos e (2) o complexo QRS prolongado (ou mais amplo) durante a estimulação S1 (Figura 3 e Figura 4). Este último ocorre porque o coração está sendo estimulado no ápice e a condução mais lenta da ativação nos tecidos ventriculares aumenta a duração do complexo QRS.
Conforme demonstrado nos dados publicados2,7 (Figura 3 e Figura 4), essas estimulações adrenérgicas e elétricas combinadas não induziram taquiarritmias ventriculares (definidas como pelo menos três complexos ventriculares prematuros consecutivos, PVCs) em corações saudáveis de camundongos (corações selvagens simulados operados na Figura 3) ou em corações de ratos controle (corações de ratos injetados com Ad-GFP de controle na Figura 4 ). Por outro lado, o mesmo protocolo induziu taquiarritmias ventriculares em 77% dos corações de camundongos do tipo selvagem após infarto do miocárdio (Figura 3B) e em três dos quatro corações de ratos após injeção intramiocárdica de Ad-Wnt3a (Figura 4). Isso demonstra a alta fidelidade dessa abordagem indutora de arritmia ventricular.
A expressão transgênica intramiocárdica bem-sucedida após a injeção do vírus pode ser verificada por mRNA regulado para cima e níveis de proteína do transgene nos tecidos miocárdicos identificados por RT-PCR quantitativo em tempo real, western blot ou imuno-histoquímica. Se o vírus expressar um gene repórter fluorescente, como a GFP, a transdução viral bem-sucedida também pode ser verificada em cardiomiócitos isolados, vivos e únicos por sua expressão de GFP9.
Figura 1: Perfusão de Langendorff de um coração de rato isolado. O coração é coletado do animal e a aorta é canulada com uma agulha contundente de 18 G. A agulha é ligada a uma seringa de 10 ml preenchida com solução de Tyrode a 37 °C a uma pressão de 70-80 mmHg. O coração é colocado em um prato de plástico de 10 cm revestido de elastômero de silicone com o ventrículo esquerdo voltado para cima. Eletrodos (cores vermelha, verde e preta) de um sistema de ECG de animais pequenos são colocados ao redor do coração, inserindo-os no revestimento de elastômero de silicone no prato. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estímulos adrenérgicos e elétricos do coração perfundido de Langendorff. (A) O coração de rato ou rato é perfundido em um sistema de Langendorff, como mostrado na Figura 1, e 1 μM de isoproterenol é adicionado à solução de Tyrode perfusora para estimular os receptores β1 adrenérgicos do coração. O coração é então estimulado no ápice por dois eletrodos de platina conectados a um estimulador. (B) Representação da estimulação elétrica programada. Para obter detalhes, consulte a etapa 2.2. A figura é modificada com permissão de Wang et al.2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Taquiarritmias ventriculares induzidas em corações de camundongos após infarto do miocárdio. (A) ECG ex vivo representativo (Chumbo II) mostrando taquicardia ventricular induzida por estimulação elétrica programada (PSE) (TV, definida como três ou mais complexos ventriculares prematuros consecutivos, PVCs) em um coração de camundongo do tipo selvagem (WT) (às 8 semanas após o infarto do miocárdio, IM) quando estimulado com um estímulo extra (S2), mas apenas um único PVC em um coração de camundongo específico do coração (WT) β-knockout de catenina (KO) coração de rato (8 semanas após o IM) quando estimulado com três estímulos extras (S4). O isoproterenol (1 μM) foi incluído na solução de Tyrode perfusão durante a estimulação do PES. Camundongos knockout β-catenina (Ctnnb1) específicos para cardíacos foram gerados pelo cruzamento de camundongos Ctnnb1 flox/flox (com éxons 2 a 6 floxed) com camundongos αMHC-MerCreMer. Com a idade de 8-12 semanas, Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− camundongos (KO) e Ctnnb1 flox/flox; camundongos αMHC-MerCreMer−/− (usados como camundongos de controle do tipo selvagem) receberam injeções subcutâneas diárias de tamoxifeno (20 mg/kg/dia) por 5 dias consecutivos antes de serem designados para o grupo IAM ou simulado. (B) Resumo de PVCs e VTs induzidos por PSA em corações WT e KO em 1 semana ou 8 semanas após o IM. Um escore de arritmia foi atribuído a cada coração de acordo com os critérios da tabela esquerda. Às 8 semanas após o IAM, a TV foi induzida com sucesso em 77% dos corações WT, mas apenas em 18% dos corações KO. Os dados foram analisados por ANOVA two-way e comparação post-hoc de Bonferroni. As barras de erro indicam o erro padrão (SE). A figura é reproduzida com permissão de Wang et al.2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Taquiarritmias ventriculares induzidas em corações de ratos após injeção intramiocárdica de um vírus expressando Wnt3a. (A) Arritmias ventriculares induzidas por PSE em corações de ratos (200-250 g, macho, Sprague-Dawley) no dia 4-6 após injeção intramiocárdica de um adenovírus expressando Wnt3a (Ad-Wnt3a, inferior), mas não em corações injetados com adenovírus controle expressando GFP (Ad-GFP, topo). Os corações foram isolados e perfundidos em um sistema de Langendorff. O isoproterenol (1 μM) foi incluído na solução de Tyrode perfusão durante a estimulação do PES. Ex vivo O ECG foi registrado continuamente durante a estimulação do PES. Note-se que 11 estímulos S1 consecutivos (cor azul) foram utilizados neste experimento. (B) Resumo dos estudos no Painel (A): A taquicardia ventricular (TV) foi induzida por PES em três dos quatro corações com injeção de Ad-Wnt3a, mas em nenhum dos quatro corações com Ad-GFP de controle. A figura é reproduzida com permissão de Lu et al.7. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Várias etapas são críticas para o sucesso da preparação cardíaca isolada e perfundida por Langendorff. Em primeiro lugar, é importante evitar qualquer dano ao coração durante a coleta do coração (por exemplo, devido a espremer ou cortar acidentalmente com a tesoura). Em segundo lugar, é fundamental colocar o coração coletado em solução de Tyrode frio o mais rápido possível, porque isso interromperá os batimentos cardíacos e reduzirá o consumo de oxigênio do coração. Em terceiro lugar, a inserção da agulha na aorta não deve ser muito profunda – idealmente, a ponta da agulha está perto do nível da válvula aórtica para que o coração seja bem perfundido através das artérias coronárias. Por fim, as bolhas na agulha de perfusão precisam ser removidas antes da canulação da aorta – geralmente é útil ligar a bomba por alguns segundos antes da canulação para remover a bolha na ponta da agulha.
A preparação do coração perfundido por Langendorff tem várias vantagens sobre os estudos in vivo em animais. Em primeiro lugar, é possível controlar com precisão a concentração e a duração dos medicamentos aplicados no coração (por exemplo, isoproterenol, como usado neste estudo). Em segundo lugar, permite fácil acesso às diferentes regiões do coração para estimulação (por exemplo, estimulação elétrica no ápice deste manuscrito) ou registro fisiológico de sinais (por exemplo, mapeamento óptico dos tecidos ventriculares após a carga com um corante sensível ao Ca2+ ou sensível à voltagem, que não é descrito aqui). Além disso, a função cardíaca, como a contratilidade ventricular, pode ser prontamente medida pela inserção de um balão no ventrículo esquerdo e conectando-o a um transdutor de pressão8. Em terceiro lugar, as propriedades intrínsecas do coração, como frequência cardíaca e contratilidade ventricular, podem ser investigadas sem os fatores complicadores em estudos in vivo, como o sistema nervoso autônomo e os hormônios circulantes. No entanto, a limitação do coração perfundido por Langendorff é que ele não possui a conversa cruzada entre diferentes órgãos ou tecidos in vivo15,16,17 por meio de fatores circulantes ou do sistema nervoso autônomo, que podem ser atores críticos em alguns estudos.
O registro eletrocardiográfico ex vivo do coração perfundido de Langendorff, conforme descrito aqui e nas publicações anteriores 2,6,7,9, tem a vantagem do registro sem contato e não representa nenhum distúrbio para a função do coração em comparação com outras abordagens, como o mapeamento óptico, que requer a carga de Ca2+ -corantes sensíveis ou sensíveis à voltagem e o uso de um desacoplador de excitação-contração para reduzir o movimento cardíaco mecânico (como a blebistatina)12,18. No entanto, o mapeamento óptico tem a vantagem de fornecer informações mais detalhadas sobre as atividades elétricas do coração, como a origem dos batimentos cardíacos, o padrão de ativação miocárdica e a velocidade de condução miocárdica.
O método de injeção intramiocárdica direta de um vírus, como descrito aqui, também pode ser utilizado para a entrega de outros materiais terapêuticos 19,20,21,22,23,24, como biomateriais, éxons, mRNA modificado e cardiomiócitos derivados de células-tronco. A injeção intramiocárdica guiada por ultrassonografia tem várias vantagens em relação à abordagem tradicional de injeção baseada em toracotomia. Em primeiro lugar, é menos invasivo e permite uma recuperação mais rápida dos animais após o procedimento de injeção. Isso reduz os efeitos associados ao procedimento nos animais (por exemplo, aqueles causados por dor pós-operatória e inflamação do tecido torácico quando uma toracotomia invasiva é usada). Em segundo lugar, a ultrassonografia verifica a injeção bem-sucedida do vírus no coração, o que aumenta a consistência e a reprodutibilidade dos resultados. No entanto, a limitação da abordagem de injeção de vírus guiada por ultrassom é que os locais dos locais de injeção do vírus não podem ser controlados com a mesma precisão que na abordagem baseada em toracotomia, que permite a localização visual das diferentes regiões cardíacas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Subsídios de Projeto do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (PJT-148918 e PJT-180533, para WL), o CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, para WL), a Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) McDonald Scholarship and New Investigator Award (S-17-LI-0866, para WL), Student Scholarships (para JW e YX) e uma bolsa de pós-doutorado (para AL) da University of Ottawa Cardiac Endowment Funds no Heart Institute. Os autores agradecem ao Sr. Richard Seymour por seu apoio técnico. A Figura 2 foi criada com Biorender.com com licenças aprovadas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
