التعبير الجيني المحورة الفيروسية في قلوب القوارض وتقييم مخاطر عدم انتظام ضربات القلب
Summary
يصف هذا البروتوكول طرق التعبير الجيني المحوري في قلوب الفئران والفئران عن طريق الحقن المباشر للفيروس داخل عضلة القلب تحت توجيه تخطيط صدى القلب. يتم شرح طرق تقييم قابلية القلوب لعدم انتظام ضربات القلب البطيني عن طريق التحفيز الكهربائي المبرمج للقلوب المعزولة التي تحتوي على لانجيندورف هنا.
Abstract
أمراض القلب هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. نظرا لسهولة التعامل مع السلالات المعدلة وراثيا ووفرة ، أصبحت القوارض نماذج أساسية لأبحاث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن عدم انتظام ضربات القلب المميت العفوي الذي غالبا ما يسبب الوفيات في مرضى القلب نادر الحدوث في نماذج القوارض لأمراض القلب. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الاختلافات بين الأنواع في الخصائص الكهربائية للقلب بين الإنسان والقوارض ويشكل تحديا لدراسة عدم انتظام ضربات القلب باستخدام القوارض. يصف هذا البروتوكول نهجا لتمكين التعبير الجيني المحوري الفعال في عضلة القلب البطينية للفئران والفئران باستخدام الحقن العضلي الموجه بتخطيط صدى القلب للفيروس المؤتلف (الفيروس الغدي والفيروس المرتبط بالغدة). يحدد هذا العمل أيضا طريقة لتمكين التقييم الموثوق به لقابلية القلب لعدم انتظام ضربات القلب باستخدام قلوب الفئران والفئران المعزولة والمنقوصة من Langendorff مع كل من المحفزات الكهربائية الأدرينالية والمبرمجة. هذه التقنيات ضرورية لدراسة اضطرابات ضربات القلب المرتبطة بإعادة تشكيل القلب السلبية بعد الإصابات ، مثل احتشاء عضلة القلب.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم ، حيث أودت بحياة 18 مليون شخص في عام 2017 وحده1. أصبحت القوارض ، وخاصة الفئران والجرذان ، النموذج الأكثر استخداما في أبحاث القلب والأوعية الدموية بسبب سهولة التعامل وتوافر مختلف الإفراط في التعبير المعدل وراثيا أو خطوط خروج المغلوب. كانت نماذج القوارض أساسية لفهم آليات المرض وتحديد الأهداف العلاجية الجديدة المحتملة في احتشاء عضلة القلب2 وارتفاع ضغط الدم3 وفشل القلب4 وتصلب الشرايين5. ومع ذلك ، فإن استخدام القوارض في دراسات عدم انتظام ضربات القلب محدود بسبب حجم القلب الصغير ومعدل ضربات القلب الأسرع مقارنة بالنماذج البشرية أو الحيوانية الكبيرة. لذلك ، فإن عدم انتظام ضربات القلب المميت العفوي في الفئران أو الجرذان بعد احتشاء عضلة القلب نادرالحدوث 2. يضطر الباحثون إلى التركيز على التغييرات الثانوية غير المباشرة التي قد تعكس ركيزة مؤيدة لاضطراب النظم ، مثل التليف أو التعبير الجيني ، دون إظهار تغييرات ذات مغزى في عبء عدم انتظام ضربات القلب أو الميول المؤيدة لاضطراب نظم القلب. للتغلب على هذا القيد ، يتم وصف طريقة تسمح بإجراء تقييم موثوق لقابلية قلوب الفئران والفئران لعدم انتظام ضربات القلب البطيني بعد التعديل الوراثي 6,7 أو احتشاء عضلة القلب2 في البروتوكول الحالي. تجمع هذه الطريقة بين تحفيز المستقبلات الأدرينالية والتحفيز الكهربائي المبرمج للحث على عدم انتظام ضربات القلب البطيني في8 قلوب فأر وفئران معزولة و Langendorff.
غالبا ما تتضمن الأساليب القياسية لنقل الجينات الفيروسية في أنسجة عضلة القلب القوارض تعرض القلب عن طريق بضع الصدر9،10،11 ، وهو إجراء جراحي ويرتبط بتأخر تعافي الحيوانات بعد العملية. توضح هذه المقالة طريقة الحقن المباشر داخل عضلة القلب للفيروس تحت إرشادات التصوير بالموجات فوق الصوتية للإفراط في التعبير عن جينات التحوير. يسمح هذا الإجراء الأقل توغلا بتعافي الحيوانات بشكل أسرع بعد الحقن الفيروسي وتقليل إصابة الأنسجة ، مقارنة ببضع الصدر ، ويقلل من الألم والالتهاب بعد الجراحة في الحيوان ، وبالتالي يسمح بتقييم أفضل لآثار الجينات المعدلة وراثيا على وظائف القلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدة خطوات حاسمة لنجاح إعداد القلب المعزول الذي يعمل بنظام Langendorff. أولا ، من المهم تجنب أي ضرر للقلب أثناء جمع القلب (على سبيل المثال ، بسبب الضغط العرضي أو القطع بالمقص). ثانيا ، من الأهمية بمكان وضع القلب الذي تم جمعه في محلول Tyrode البارد في أسرع وقت ممكن لأن هذا سيوقف ضربات القلب ويقلل م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل منح مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-148918 و PJT-180533 ، إلى WL) ، وجائزة الباحث الوظيفي المبكر CIHR (AR8-162705 ، إلى WL) ، ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية الكندية (HSFC) منحة ماكدونالد وجائزة الباحث الجديد (S-17-LI-0866 ، إلى WL) ، ومنح الطلاب (إلى JW و YX) ، وزمالة ما بعد الدكتوراه (إلى AL) من صناديق وقف القلب بجامعة أوتاوا في معهد القلب. ويشكر المؤلفون السيد ريتشارد سيمور على دعمه التقني. تم إنشاء الشكل 2 مع Biorender.com مع التراخيص المعتمدة.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
