Summary
يصف هذا البروتوكول طرق التعبير الجيني المحوري في قلوب الفئران والفئران عن طريق الحقن المباشر للفيروس داخل عضلة القلب تحت توجيه تخطيط صدى القلب. يتم شرح طرق تقييم قابلية القلوب لعدم انتظام ضربات القلب البطيني عن طريق التحفيز الكهربائي المبرمج للقلوب المعزولة التي تحتوي على لانجيندورف هنا.
Abstract
أمراض القلب هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. نظرا لسهولة التعامل مع السلالات المعدلة وراثيا ووفرة ، أصبحت القوارض نماذج أساسية لأبحاث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن عدم انتظام ضربات القلب المميت العفوي الذي غالبا ما يسبب الوفيات في مرضى القلب نادر الحدوث في نماذج القوارض لأمراض القلب. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الاختلافات بين الأنواع في الخصائص الكهربائية للقلب بين الإنسان والقوارض ويشكل تحديا لدراسة عدم انتظام ضربات القلب باستخدام القوارض. يصف هذا البروتوكول نهجا لتمكين التعبير الجيني المحوري الفعال في عضلة القلب البطينية للفئران والفئران باستخدام الحقن العضلي الموجه بتخطيط صدى القلب للفيروس المؤتلف (الفيروس الغدي والفيروس المرتبط بالغدة). يحدد هذا العمل أيضا طريقة لتمكين التقييم الموثوق به لقابلية القلب لعدم انتظام ضربات القلب باستخدام قلوب الفئران والفئران المعزولة والمنقوصة من Langendorff مع كل من المحفزات الكهربائية الأدرينالية والمبرمجة. هذه التقنيات ضرورية لدراسة اضطرابات ضربات القلب المرتبطة بإعادة تشكيل القلب السلبية بعد الإصابات ، مثل احتشاء عضلة القلب.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم ، حيث أودت بحياة 18 مليون شخص في عام 2017 وحده1. أصبحت القوارض ، وخاصة الفئران والجرذان ، النموذج الأكثر استخداما في أبحاث القلب والأوعية الدموية بسبب سهولة التعامل وتوافر مختلف الإفراط في التعبير المعدل وراثيا أو خطوط خروج المغلوب. كانت نماذج القوارض أساسية لفهم آليات المرض وتحديد الأهداف العلاجية الجديدة المحتملة في احتشاء عضلة القلب2 وارتفاع ضغط الدم3 وفشل القلب4 وتصلب الشرايين5. ومع ذلك ، فإن استخدام القوارض في دراسات عدم انتظام ضربات القلب محدود بسبب حجم القلب الصغير ومعدل ضربات القلب الأسرع مقارنة بالنماذج البشرية أو الحيوانية الكبيرة. لذلك ، فإن عدم انتظام ضربات القلب المميت العفوي في الفئران أو الجرذان بعد احتشاء عضلة القلب نادرالحدوث 2. يضطر الباحثون إلى التركيز على التغييرات الثانوية غير المباشرة التي قد تعكس ركيزة مؤيدة لاضطراب النظم ، مثل التليف أو التعبير الجيني ، دون إظهار تغييرات ذات مغزى في عبء عدم انتظام ضربات القلب أو الميول المؤيدة لاضطراب نظم القلب. للتغلب على هذا القيد ، يتم وصف طريقة تسمح بإجراء تقييم موثوق لقابلية قلوب الفئران والفئران لعدم انتظام ضربات القلب البطيني بعد التعديل الوراثي 6,7 أو احتشاء عضلة القلب2 في البروتوكول الحالي. تجمع هذه الطريقة بين تحفيز المستقبلات الأدرينالية والتحفيز الكهربائي المبرمج للحث على عدم انتظام ضربات القلب البطيني في8 قلوب فأر وفئران معزولة و Langendorff.
غالبا ما تتضمن الأساليب القياسية لنقل الجينات الفيروسية في أنسجة عضلة القلب القوارض تعرض القلب عن طريق بضع الصدر9،10،11 ، وهو إجراء جراحي ويرتبط بتأخر تعافي الحيوانات بعد العملية. توضح هذه المقالة طريقة الحقن المباشر داخل عضلة القلب للفيروس تحت إرشادات التصوير بالموجات فوق الصوتية للإفراط في التعبير عن جينات التحوير. يسمح هذا الإجراء الأقل توغلا بتعافي الحيوانات بشكل أسرع بعد الحقن الفيروسي وتقليل إصابة الأنسجة ، مقارنة ببضع الصدر ، ويقلل من الألم والالتهاب بعد الجراحة في الحيوان ، وبالتالي يسمح بتقييم أفضل لآثار الجينات المعدلة وراثيا على وظائف القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب والإجراءات الموصوفة من قبل مجلس المراجعة الأخلاقية للبحوث الحيوانية في جامعة أوتاوا ولجنة مراجعة السلامة البيولوجية في معهد القلب بجامعة أوتاوا. تتضمن بروتوكولات السلامة المطورة أن جميع الإجراءات التي تتعامل مع الفيروس الغدي المؤتلف أو الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) قد تم تنفيذها في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى الثاني. تم تطهير جميع العناصر الملامسة للفيروس تماما بعد التجربة. تم استخدام فئران Ctnnb1 flox / flox و αMHC-MerCreMer (8-12 أسبوعا ، من كلا الجنسين) وفئران Sprague-Dawley (200-250 جم ، ذكر) في الدراسة الحالية. تم الحصول على الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد). تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل موظفين تم تدريبهم واعتمادهم من قبل اللجان التنظيمية المؤسسية. تم استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة خلال جميع الإجراءات.
1. التعبير الجيني المحورة الفيروسية في أنسجة البطين القوارض
ملاحظة: قم بتخزين الفيروس الغدي المؤتلف أو AAV الذي يعبر عن الجين المستهدف وفيروس التحكم المقابل ، مثل Ad-GFP (عيار 1 × 10 10 PFU / مل) أو AAV9-GFP (عيار 1 × 1013 GC / mL) (انظر جدول المواد) ، في مجمد −80 درجة مئوية.
- في يوم حقن الفيروس ، قم بإذابة الفيروس على الجليد. قم بشفط الفيروس الذي يعبر عن الجين المستهدف والفيروس الضابط في حقنتين منفصلتين (الحجم = 50 ميكرولتر) مع 30 جم 1/2 إبرة واحتفظ بها على الثلج حتى الاستخدام.
ملاحظة: يجب إزالة أي فقاعات في المحقنة والإبرة بعناية. - تطبيق البوبرينورفين للجرذان أو الفئران (0.05 ملغ/كغ للفئران، 0.1 ملغ/كغ للفئران، تحت الجلد)، بعد ساعة واحدة للتخدير باستخدام إيزوفلوران 3٪، والحفاظ على إيزوفلوران عند 2٪ (في 100٪ أكسجين بمعدل تدفق 0.5-1.0 لتر/دقيقة) للإجراء التالي.
- قرصة جسم الحيوان برفق (على سبيل المثال ، الذيل) مع زوج من الملقط ، وإذا لم يستجب الحيوان للقرص مع أي حركات الجسم ، يتم تأكيد التخدير المناسب.
- حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة الكهربائية. حلق الشعر في منطقة الصدر باستخدام ماكينة قص الشعر.
ملاحظة: يجب توخي الحذر أثناء استخدام وسادة التدفئة الكهربائية بسبب التوزيع غير المتكافئ المحتمل للحرارة. - ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
- حافظ على الحيوان في وضع ضعيف واستخدم نظام التصوير قبل السريري (انظر جدول المواد) للتصوير بالموجات فوق الصوتية لقلب الحيوان في اتجاه المحور القصير.
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في خزانة السلامة الأحيائية من المستوى الثاني التي توفر بيئة معقمة. يتم استخدام إجراءات السلامة القياسية ، بما في ذلك تلك التي تتعامل مع الإبر بشكل آمن. - تعقيم منطقة الصدر السفلي الأيسر للحيوان مع جولات متناوبة من فرك قائم على اليود أو الكلورهيكسيدين والكحول ثلاث مرات في حركة دائرية.
- تحت توجيه التصوير بالموجات فوق الصوتية ، أدخل إبرة 30 G 1/2 من المحقنة التي تحتوي على الفيروس كما هو موضح في الخطوة 1.1. في صدر الحيوان عبر الجانب السفلي الأيسر من الجسم.
- اقترب من طرف الإبرة في الجدار الحر الأمامي للبطين الأيسر وحقن ببطء 10-15 ميكرولتر من الفيروس. تحقق من نجاح الحقن في صور الموجات فوق الصوتية من خلال السطوع المحسن بالقرب من طرف الإبرة.
ملاحظة: كمية الفيروس المحقونة في كل موقع لا تزيد عن 15 ميكرولتر لمنع الضرر المادي لأنسجة عضلة القلب. - اسحب الإبرة من القلب وأدخلها في مناطق أخرى من البطين الأيسر للحصول على حقنة ثانية وثالثة من نفس الكمية من الفيروس.
ملاحظة: يتم تحديد العدد الإجمالي لمواقع الحقن من خلال التصميم التجريبي. وإذا كان التعبير المحوري المحوري مطلوبا، فلا حاجة إلا إلى حقنة واحدة؛ إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التعبير الجيني المحور، فعادة ما تكون هناك حاجة إلى مواقع حقن متعددة (من ثلاثة إلى خمسة). - بعد الانتهاء من الحقن ، أعد الحيوان إلى قفصه.
- راقب الحيوان بعناية حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص وإعادته إلى غرفة السكن الخاصة به.
- تطبيق البوبرينورفين حمض الهيدروكلوريك (0.1 ملغ/كغ، مرتين في اليوم للفئران، 0.05 ملغ/كغ، مرتين في اليوم للفئران، تحت الجلد) للحيوان لمدة 2 أيام التالية. أعد الحيوانات إلى بيت الحيوان وراقبها يوميا بحثا عن أي علامات غير عادية للألم أو الضيق ، وإذا وجدت ، فقم بمعالجة الحيوانات وفقا لبروتوكولات لجنة رعاية الحيوان المؤسسية.
2. تقييم قابلية عدم انتظام ضربات القلب
ملاحظة: بعد 4-6 أيام من حقن الفيروس الغدي و 1-2 أسابيع بعد حقن AAV ، قم بتقييم قابلية قلوب الحيوانات لعدم انتظام ضربات القلب باتباع الخطوات 2.1.-2.2.
- أداء نضح Langendorff من قلب الفئران أو الفأر.
- تحضير محلول Tyrode بإضافة ما يلي إلى 1 لتر من الماء: كلوريد الصوديوم ، 7.9 جم (النهائي = 135 مللي مول) ؛ KCl ، 0.37 جم (5.0 مللي مول) ؛ CaCl2 ، 0.27 جم (1.8 مللي متر) ؛ MgCl 2 ، 0.24 جم (1.2 مللي متر) ؛ HEPES ، 2.38 جم (10 مللي متر) ؛ والجلوكوز ، 1.8 جم (10 مللي مول). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.40 باستخدام NaOH (انظر جدول المواد).
- قم بتصفية المحلول بمرشح 0.2 ميكرومتر وفقاعة بنسبة 100٪ O 2 بشكل مستمر خلال الخطوات 2.1.6.-2.2.8.
- تطبيق الهيبارين على الجرذ أو الفأر (500 وحدة / كغ، حقن داخل الصفاق) وبعد 10 دقائق تخدير الحيوان باستخدام 3٪ إيزوفلوران. ضمان التخدير الكافي مع قرصة لطيفة على الجسم.
- استخدم مشرطا لعمل شق عمودي 1-1.5 سم في منتصف الترقوة لإجراء بضع الصدر الأيسر وكشف القلب.
- اجمع القلب عن طريق القطع بمقص على مستوى قوس الأبهر ووضع القلب على الفور في محلول Tyrode البارد.
ملاحظة: يجب توخي الحذر حتى لا تتلف القلب أثناء جمع القلب. - قنية الشريان الأورطي للقلب بإبرة حادة (18 جم للفئران ؛ 23 جم للفئران) متصلة بنظام نضح Langendorff المعدل (انظر جدول المواد) في وضع معدل التدفق الثابت. اضبط معدل التدفق للحفاظ على ضغط التروية عند 70-80 مم زئبق.
ملاحظة: يجب إزالة أي فقاعات في إبرة التروية قبل قنية الأبهر. باستخدام مجهر تشريح يسهل القنية. - ضع القلب المقنن في طبق بلاستيكي مغطى بالمطاط الصناعيالسيليكوني 9 ، 10 سم مع توجيه البطين الأيسر لأعلى وقم بتدوير القلب 9,12 بمحلول TyrodeO 2-bubbled عند 37 درجة مئوية.
- تحقق من قنية الأبهر الصحيحة في بداية التروية من خلال مراقبة غسل الدم من القلب خلال أول نبضتين إلى ثلاث نبضات قلب وتغيير لون القلب من الأحمر إلى الشحوب.
- ضع أقطاب نظام تخطيط القلب لحيوان صغير (انظر جدول المواد) حول القلب عن طريق إدخالها في طلاء المطاط الصناعي السيليكوني في الطبق (الشكل 1). سجل تخطيط القلب باستخدام برنامج متوافق.
- إجراء تحفيز مستقبلات الأدرينالية والتحفيز الكهربائي المبرمج للحث على عدم انتظام ضربات القلب البطيني.
- بعد نجاح قنية الأبهر ، استمر في تخلل القلب بمحلول Tyrode لمدة 20 دقيقة لتثبيت إعداد القلب.
- أضف 1 ميكرومتر إيزوبروتيرينول (انظر جدول المواد) إلى محلول Tyrode المستخدم لتروية القلب في الخطوات 2.2.3.-2.2.8.
- بعد 10 دقائق من تروية الأيزوبروتيرينول ، قم بتحفيز القلب في القمة باستخدام قطبين كهربائيين من البلاتين متصلين بمحفز كهربائي (انظر جدول المواد).
- ابدأ بإجراء التحفيز (الشكل 2) ، والذي يتضمن 10 محفزات متتالية (S1 ، 5 V ، فترات 100 مللي ثانية) يتبعها حافز إضافي (S2) بفاصل أولي يبلغ 80 مللي ثانية. قلل الفاصل الزمني S2 بشكل متكرر بمقدار 2 مللي ثانية في كل مرة حتى لا يمكن التقاط نبضات القلب (أي الوصول إلى فترة المقاومة الفعالة للقلب ، ERP)13.
- راقب أي حالات تسرع القلب البطيني المستحث (بما في ذلك تسرع القلب البطيني والرجفان) بواسطة تخطيط القلب.
- إذا لم يحدث عدم انتظام ضربات القلب بسبب الإجراء أعلاه ، أضف حافزا إضافيا آخر (S3) بعد S2 بنفس الفواصل الزمنية الأولية (80 مللي ثانية) والتناقص (بمقدار 2 مللي ثانية) حتى يتم الوصول إلى تخطيط موارد المؤسسات.
- إذا كان عدم تحفيز عدم انتظام ضربات القلب البطيني لا يزال غير مستحث، أضف محفزا إضافيا آخر (S4) بعد S3 بنفس الفواصل الزمنية الأولية والتناقص حتى يتم الوصول إلى تخطيط موارد المؤسسات.
- إذا كان عدم تحفيز عدم انتظام ضربات القلب البطيني لا يزال غير مستحث (كما هو متوقع في السيطرة على صحة القلب) ، أوقف بروتوكول التحفيز الكهربائي واعتبر القلب غير قابل للتحريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند اتباع البروتوكول الموصوف هنا (الشكل 1) ، ينبض قلب الجرذ أو الفأر المعزول بشكل إيقاعي وثابت لمدة 4 ساعات على الأقل. إذا كان التصميم التجريبي يتطلب فترة أطول من التروية القلبية ، فمن المفيد إضافة الألبومين إلى محلول التروية لتقليل حدوث وذمة عضلة القلب بعد التروية الطويلة14. يحاكي إدراج الأيزوبروتيرينول في محلول التروية تنشيط الجهاز العصبي الودي الذي يحدث في العديد من حالات عدم انتظام ضربات القلب مثل احتشاء عضلة القلب وفشل القلب. أثناء التحفيز الكهربائي المبرمج ، يتم التحقق من سرعة القلب الناجحة من خلال (1) التقاط 1: 1 لنبضات القلب أثناء محفزات S1 المتتالية و (2) مجمع QRS المطول (أو الأوسع) أثناء سرعة S1 (الشكل 3 والشكل 4). هذا الأخير هو أن القلب يسير بخطى في القمة والتوصيل البطيء للتنشيط في أنسجة البطين يزيد من مدة مجمع QRS.
كما هو موضح في البيانات المنشورة 2,7 (الشكل 3 والشكل 4) ، فإن هذه المحفزات الأدرينالية والكهربائية مجتمعة لم تحدث أي عدم انتظام ضربات القلب البطيني البطيني (يعرف بأنه ثلاثة على الأقل من مجمعات البطين المبكرة المتتالية ، PVCs) في قلوب الفئران السليمة (قلوب برية من النوع البري تعمل بالخداع في الشكل 3) أو في قلوب الفئران الضابطة (التحكم في قلوب الفئران المحقونة ب Ad-GFP في الشكل 4 ). على النقيض من ذلك ، تسبب نفس البروتوكول في عدم انتظام ضربات القلب البطيني في 77٪ من قلوب الفئران من النوع البري بعد احتشاء عضلة القلب (الشكل 3B) وفي ثلاثة من كل أربعة قلوب فئران بعد الحقن داخل عضلة القلب من Ad-Wnt3a (الشكل 4). هذا يدل على الدقة العالية لهذا النهج الذي يحفز عدم انتظام ضربات القلب البطيني.
يمكن التحقق من التعبير الناجح لجين التحوير داخل عضلة القلب بعد حقن الفيروس عن طريق mRNA المنظم ومستويات البروتين في جين التحوير في أنسجة عضلة القلب التي تم تحديدها بواسطة RT-PCR الكمي في الوقت الفعلي أو اللطخة الغربية أو الكيمياء المناعية. إذا كان الفيروس يعبر عن جين مراسل فلوري ، مثل GFP ، فيمكن أيضا التحقق من النقل الفيروسي الناجح في خلايا عضلية قلبية معزولة وحية ومفردة من خلال تعبيرها عن GFP9.
الشكل 1: نضح لانجيندورف لقلب فأر معزول. يتم جمع القلب من الحيوان ، ويتم تقليب الشريان الأورطي بإبرة حادة 18 جم. يتم توصيل الإبرة بحقنة سعة 10 مل مملوءة بمحلول تيرود 37 درجة مئوية عند ضغط 70-80 مم زئبق. يتم وضع القلب في طبق بلاستيكي مطلي بالمطاط الصناعي السيليكوني مقاس 10 سم مع توجيه البطين الأيسر لأعلى. يتم وضع الأقطاب الكهربائية (الألوان الأحمر والأخضر والأسود) لنظام تخطيط القلب للحيوانات الصغيرة حول القلب عن طريق إدخالها في طلاء المطاط الصناعي السيليكوني في الطبق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: المحفزات الأدرينالية والكهربائية للقلب الملتخلل في لانجيندورف. (أ) يتخلل قلب الجرذ أو الفأر على نظام لانجيندورف كما هو موضح في الشكل 1، ويضاف 1 ميكرومتر من الأيزوبروتيرينول إلى محلول تيرود الملتخلل لتحفيز مستقبلات القلب الأدرينالية β1. ثم يتم تحفيز القلب في القمة بواسطة قطبين كهربائيين من البلاتين متصلين بمحفز. ب: تمثيل التحفيز الكهربي المبرمج. لمعرفة التفاصيل، يرجى الاطلاع على الخطوة 2.2. تم تعديل الرقم بإذن من Wang et al.2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: عدم انتظام ضربات القلب البطيني الناجم في قلوب الفئران بعد احتشاء عضلة القلب. (أ) تخطيط القلب خارج الجسم الحي (الرصاص الثاني) يظهر تسرع القلب البطيني الناجم عن التحفيز الكهربائي المبرمج (PES) (VT ، المعرف على أنه ثلاثة أو أكثر من مجمعات البطين المبكرة المتتالية ، PVCs) في قلب فأر من النوع البري (WT) (بعد 8 أسابيع من احتشاء عضلة القلب ، MI) عند تحفيزه بحافز إضافي واحد (S2) ولكن PVC واحد فقط في خاص بالقلب قلب الفأر بالضربة القاضية β-catenin (KO) (في 8 أسابيع بعد MI) عند تحفيزه بثلاثة محفزات إضافية (S4). تم تضمين الأيزوبروتيرينول (1 ميكرومتر) في محلول Tyrode أثناء تحفيز PES. تم إنشاء فئران خروج المغلوب الخاصة بالقلب β-catenin (Ctnnb1) عن طريق تهجين فئران Ctnnb1 flox / flox (مع exons 2 إلى 6 floxed) مع فئران αMHC-MerCreMer. في عمر 8-12 أسبوعا ، Ctnnb1 flox / flox ؛ αMHC-MerCreMer +/- الفئران (KO) و Ctnnb1 flox / flox ؛ تلقت فئران αMHC-MerCreMer−/− (المستخدمة كفئران من النوع البري الضابط) حقنا يومية تحت الجلد من عقار تاموكسيفين (20 مجم / كجم / يوم) لمدة 5 أيام متتالية قبل أن يتم تعيينها إما في MI أو المجموعة الوهمية. (ب) ملخص PVCs و VTs التي يسببها PES في قلوب WT و KO في 1 أسبوع أو 8 أسابيع بعد MI. تم تعيين درجة عدم انتظام ضربات القلب لكل قلب وفقا للمعايير في الجدول الأيسر. في 8 أسابيع بعد MI ، تم تحفيز VT بنجاح في 77٪ من قلوب WT ولكن فقط في 18٪ من قلوب KO. تم تحليل البيانات من خلال ANOVA ثنائي الاتجاه ومقارنة Bonferroni اللاحقة. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي (SE). وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من وانغ وآخرين 2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: عدم انتظام ضربات القلب البطيني المستحث في قلوب الفئران بعد الحقن داخل عضلة القلب لفيروس يعبر عن Wnt3a. (أ) عدم انتظام ضربات القلب البطيني الناجم عن PES في قلوب الفئران (200-250 جم ، ذكر ، Sprague-Dawley) في اليوم 4-6 بعد الحقن داخل عضلة القلب لفيروس غدي يعبر عن Wnt3a (Ad-Wnt3a ، أسفل) ولكن ليس في القلوب المحقونة بالفيروس الغدي المتحكم الذي يعبر عن GFP (Ad-GFP ، أعلى). تم عزل القلوب وتثبيتها على نظام Langendorff. تم تضمين الأيزوبروتيرينول (1 ميكرومتر) في محلول Tyrode أثناء تحفيز PES. خارج الجسم الحي تم تسجيل تخطيط القلب بشكل مستمر أثناء تحفيز PES. لاحظ أنه تم استخدام 11 محفزا S1 متتاليا (اللون الأزرق) في هذه التجربة. (ب) ملخص الدراسات في اللوحة (أ): تم تحفيز تسرع القلب البطيني (VT) بواسطة PES في ثلاثة من أصل أربعة قلوب مع حقن Ad-Wnt3a ولكن في أي من القلوب الأربعة مع التحكم Ad-GFP. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من لو وآخرين 7. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك عدة خطوات حاسمة لنجاح إعداد القلب المعزول الذي يعمل بنظام Langendorff. أولا ، من المهم تجنب أي ضرر للقلب أثناء جمع القلب (على سبيل المثال ، بسبب الضغط العرضي أو القطع بالمقص). ثانيا ، من الأهمية بمكان وضع القلب الذي تم جمعه في محلول Tyrode البارد في أسرع وقت ممكن لأن هذا سيوقف ضربات القلب ويقلل من استهلاك الأكسجين في القلب. ثالثا ، يجب ألا يكون إدخال الإبرة في الشريان الأورطي عميقا جدا - من الناحية المثالية ، يكون طرف الإبرة قريبا من مستوى الصمام الأبهري بحيث يتم اختراق القلب جيدا عبر الشرايين التاجية. أخيرا ، يجب إزالة الفقاعات الموجودة في إبرة التروية قبل قنية الأبهر - من المفيد عادة تشغيل المضخة لبضع ثوان قبل القنية مباشرة لإزالة الفقاعة الموجودة في طرف الإبرة.
يتميز إعداد القلب Langendorff-perfused بالعديد من المزايا مقارنة بالدراسات في الجسم الحي في الحيوانات. أولا ، من الممكن التحكم بدقة في تركيز ومدة الأدوية المطبقة على القلب (على سبيل المثال ، الأيزوبروتيرينول ، كما هو مستخدم في هذه الدراسة). ثانيا ، يسمح بالوصول السهل إلى مناطق مختلفة من القلب إما للتحفيز (على سبيل المثال ، السرعة الكهربائية في القمة في هذه المخطوطة) أو تسجيل الإشارات الفسيولوجية (على سبيل المثال ، رسم الخرائط البصرية لأنسجة البطين بعد التحميل بصبغة حساسة ل Ca2+ أو حساسة للجهد ، وهو ما لم يتم وصفه هنا). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس وظيفة القلب ، مثل انقباض البطين ، بسهولة عن طريق إدخال بالون في البطين الأيسر وتوصيل البالون بمحول الضغط8. ثالثا ، يمكن التحقيق في الخصائص الجوهرية للقلب ، مثل معدل ضربات القلب وانقباض البطين ، دون العوامل المعقدة في الدراسات في الجسم الحي ، مثل الجهاز العصبي اللاإرادي والهرمونات المنتشرة. ومع ذلك ، فإن الحد من قلب Langendorff-perfused هو أنه يفتقر إلى الحديث المتبادل بين الأعضاء أو الأنسجة المختلفة في الجسم الحي15،16،17 إما عن طريق العوامل المنتشرة أو الجهاز العصبي اللاإرادي ، والذي قد يكون لاعبا حاسما في بعض الدراسات.
يتميز تسجيل تخطيط القلب خارج الجسم الحي لقلب Langendorff ، كما هو موضح هنا وفي المنشورات السابقة2،6،7،9 ، بميزة التسجيل بدون تلامس ولا يشكل أي اضطراب في وظيفة القلب مقارنة بالطرق الأخرى مثل رسم الخرائط البصرية ، والتي تتطلب تحميل Ca2+ - الأصباغ الحساسة أو الحساسة للجهد واستخدام جهاز فك اقتران الإثارة والانكماش لتقليل حركة القلب الميكانيكية (مثل بليبيستاتين)12,18. ومع ذلك ، فإن رسم الخرائط البصرية له ميزة توفير معلومات أكثر تفصيلا عن الأنشطة الكهربائية للقلب ، مثل أصل ضربات القلب ، ونمط تنشيط عضلة القلب ، وسرعة توصيل عضلة القلب.
يمكن أيضا استخدام طريقة الحقن المباشر داخل عضلة القلب للفيروس ، كما هو موضح هنا ، لتوصيل المواد العلاجية الأخرى19،20،21،22،23،24 ، مثل المواد الحيوية ، والإكسونات ، والحمض النووي الريبوزي المرسال المعدل ، وخلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية. يتميز الحقن داخل عضلة القلب الموجه بالتصوير بالموجات فوق الصوتية بالعديد من المزايا مقارنة بنهج الحقن التقليدي القائم على بضع الصدر. أولا ، إنه أقل توغلا ويسمح باستعادة أسرع للحيوانات بعد إجراء الحقن. هذا يقلل من الآثار المرتبطة بالإجراء على الحيوانات (على سبيل المثال ، تلك الناجمة عن ألم ما بعد الجراحة والتهاب أنسجة الصدر عند استخدام بضع الصدر الغازي). ثانيا ، يتحقق التصوير بالموجات فوق الصوتية من نجاح حقن الفيروس في القلب ، مما يزيد من اتساق النتائج وإمكانية استنساخها. ومع ذلك ، فإن الحد من نهج حقن الفيروس الموجه بالموجات فوق الصوتية هو أنه لا يمكن التحكم في مواقع مواقع حقن الفيروس بدقة كما هو الحال في النهج القائم على بضع الصدر ، والذي يسمح بالتوطين البصري لمناطق القلب المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل منح مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-148918 و PJT-180533 ، إلى WL) ، وجائزة الباحث الوظيفي المبكر CIHR (AR8-162705 ، إلى WL) ، ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية الكندية (HSFC) منحة ماكدونالد وجائزة الباحث الجديد (S-17-LI-0866 ، إلى WL) ، ومنح الطلاب (إلى JW و YX) ، وزمالة ما بعد الدكتوراه (إلى AL) من صناديق وقف القلب بجامعة أوتاوا في معهد القلب. ويشكر المؤلفون السيد ريتشارد سيمور على دعمه التقني. تم إنشاء الشكل 2 مع Biorender.com مع التراخيص المعتمدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
