Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.
Abstract
Herzerkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität. Aufgrund der einfachen Handhabung und des Reichtums an transgenen Stämmen sind Nagetiere zu unverzichtbaren Modellen für die kardiovaskuläre Forschung geworden. Spontane letale Herzrhythmusstörungen, die bei Patienten mit Herzerkrankungen häufig zum Tod führen, sind jedoch in Nagetiermodellen für Herzerkrankungen selten. Dies ist in erster Linie auf die Unterschiede in den elektrischen Eigenschaften des Herzens zwischen Menschen und Nagetieren zurückzuführen und stellt eine Herausforderung für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen an Nagetieren dar. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um eine effiziente Transgenexpression im ventrikulären Myokard von Maus und Ratte unter Verwendung von echokardiografischen intramuskulären Injektionen von rekombinantem Virus (Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus) zu ermöglichen. Diese Arbeit skizziert auch eine Methode, die eine zuverlässige Beurteilung der kardialen Anfälligkeit für Arrhythmien unter Verwendung isolierter, Langendorff-perfundierter Maus- und Rattenherzen mit sowohl adrenergen als auch programmierten elektrischen Stimulationen ermöglicht. Diese Techniken sind entscheidend für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen, die mit einem nachteiligen kardialen Umbau nach Verletzungen wie Myokardinfarkt verbunden sind.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache und kostetenallein im Jahr 2017 18 Millionen Menschen das Leben1. Nagetiere, insbesondere Mäuse und Ratten, sind aufgrund der einfachen Handhabung und der Verfügbarkeit verschiedener transgener Überexpressions- oder Knockout-Linien zum am häufigsten verwendeten Modell in der kardiovaskulären Forschung geworden. Nagetiermodelle waren von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und für die Identifizierung potenzieller neuer therapeutischer Ziele bei Myokardinfarkt2, Bluthochdruck3, Herzinsuffizienz4 und Atherosklerose5. Die Verwendung von Nagetieren in Studien zu Herzrhythmusstörungen ist jedoch durch ihre geringe Herzgröße und schnellere Herzfrequenz im Vergleich zu menschlichen oder großen Tiermodellen begrenzt. Daher sind spontane letale Arrhythmien bei Mäusen oder Ratten nach Myokardinfarkt selten2. Die Forscher sind gezwungen, sich auf indirekte sekundäre Veränderungen zu konzentrieren, die ein pro-arrhythmisches Substrat wie Fibrose oder Genexpression widerspiegeln könnten, ohne signifikante Veränderungen der Arrhythmiebelastung oder pro-arrhythmischer Tendenzen zu zeigen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird im vorliegenden Protokoll eine Methode beschrieben, die eine zuverlässige Beurteilung der Anfälligkeit von Mäuse- und Rattenherzen für ventrikuläre Tachyarrhythmien nach genetischer Veränderung 6,7 oder Myokardinfarkt2 ermöglicht. Diese Methode kombiniert die adrenerge Rezeptorstimulation mit der programmierten elektrischen Stimulation, um ventrikuläre Tachyarrhythmien in isolierten, Langendorff-perfundierten8 Maus- und Rattenherzen zu induzieren.
Standardansätze für den viralen Gentransfer in Nagetier-Myokardgewebe beinhalten häufig die Exposition des Herzens durch die Thorakotomie 9,10,11, die ein invasives Verfahren ist und mit einer verzögerten Genesung der Tiere nach dem Eingriff verbunden ist. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur direkten intramyokardialen Injektion von Viren unter Ultraschallbildgebung zur Überexpression von Transgenen. Dieses weniger invasive Verfahren ermöglicht im Vergleich zur Thorakotomie eine schnellere Genesung der Tiere nach der Virusinjektion und weniger Gewebeverletzungen, reduziert postoperative Schmerzen und Entzündungen beim Tier und ermöglicht somit eine bessere Beurteilung der Auswirkungen transgener Gene auf die Herzfunktion.
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Protocol
Alle beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom Animal Research Ethics Review Board an der University of Ottawa und dem Biosafety Review Committee am University of Ottawa Heart Institute genehmigt. Die entwickelten Sicherheitsprotokolle beinhalten, dass alle Verfahren, die sich mit rekombinantem Adenovirus oder Adeno-assoziiertem Virus (AAV) befassen, in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe II durchgeführt wurden. Alle Gegenstände, die mit dem Virus in Berührung kamen, wurden nach dem Experiment gründlich dekontaminiert. Für die vorliegende Studie wurden Ctnnb1 flox/flox und αMHC-MerCreMer Mäuse (8-12 Wochen alt, beiderlei Geschlechts) und Sprague-Dawley-Ratten (200-250g, männlich) verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren, die mit Tieren zu tun haben, wurden von Mitarbeitern durchgeführt, die von den institutionellen Regelungsausschüssen geschult und genehmigt wurden. Bei allen Eingriffen wurde eine angemessene persönliche Schutzausrüstung verwendet.
1. Virale Transgenexpression in ventrikulären Geweben von Nagetieren
HINWEIS: Lagern Sie rekombinantes Adenovirus oder AAV, das das Zielgen und das entsprechende Kontrollvirus exprimiert, wie z. B. Ad-GFP (Titer von 1 x 10 10 PFU/ml) oder AAV9-GFP (Titer von 1 x 1013 GC/ml) (siehe Materialtabelle), in einem Gefrierschrank von -80 °C.
- Am Tag der Virusinjektion tauen Sie das Virus auf Eis auf. Das Virus, das das Zielgen exprimiert, und das Kontrollvirus werden in zwei separate Spritzen (Volumen = 50 μL) mit 30 G 1/2 Nadeln abgesaugt und bis zur Verwendung auf Eis gehalten.
HINWEIS: Alle Blasen in der Spritze und Nadel müssen sorgfältig entfernt werden. - Verabreichung von Buprenorphin an Ratten oder Mäuse (0,05 mg/kg für Ratten, 0,1 mg/kg für Mäuse, subkutan), 1 h später eine Anästhesie mit 3% Isofluran induzieren und Isofluran bei 2% (in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,5-1,0 l/min) für das nachfolgende Verfahren halten.
- Kneifen Sie den Körper des Tieres (z. B. den Schwanz) vorsichtig mit einer Pinzette zusammen, und wenn das Tier nicht mit Körperbewegungen auf die Zwicke reagiert, wird eine ordnungsgemäße Anästhesie bestätigt.
- Halten Sie die Körpertemperatur mit einem elektrischen Heizkissen auf 37 °C. Rasieren Sie die Haare im Brustbereich mit einer Haarschneidemaschine.
HINWEIS: Bei der Verwendung eines elektrischen Heizkissens ist Vorsicht geboten, da die Wärmeverteilung ungleichmäßig sein kann. - Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Halten Sie das Tier in Rückenlage und verwenden Sie ein präklinisches Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) für die Ultraschallbildgebung des Herzens des Tieres in der Kurzachsenausrichtung.
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe II durchgeführt, die eine sterile Umgebung bietet. Es werden Standard-Sicherheitsverfahren, einschließlich solcher mit sicherer Nadelhandhabung, angewendet. - Sterilisieren Sie den linken unteren Brustbereich des Tieres mit abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis und Alkohol dreimal in kreisenden Bewegungen.
- Führen Sie unter Anleitung der Ultraschallbildgebung die 30 g 1/2 Nadel der Spritze mit dem Virus ein, wie in Schritt 1.1 hergestellt. über die linke untere Brustseite des Körpers in die Brust des Tieres.
- Nähern Sie sich der Nadelspitze in die linksventrikuläre vordere freie Wand und injizieren Sie langsam 10-15 μL des Virus. Überprüfen Sie die erfolgreiche Injektion in Ultraschallbildern durch die erhöhte Helligkeit in der Nähe der Nadelspitze.
HINWEIS: Die Menge an Virus, die an jeder Stelle injiziert wird, beträgt nicht mehr als 15 μl, um eine physische Schädigung des Myokardgewebes zu verhindern. - Ziehen Sie die Nadel aus dem Herzen und führen Sie sie in andere Regionen des linken Ventrikels ein, um eine zweite und dritte Injektion der gleichen Virusmenge zu erhalten.
ANMERKUNG: Die Gesamtzahl der Injektionsstellen wird durch das Versuchsdesign bestimmt. Wenn eine fokale Transgenexpression erforderlich ist, ist nur eine Injektion erforderlich. Wenn eine diffusivere Transgenexpression erforderlich ist, sind in der Regel mehrere Injektionsstellen (drei bis fünf) erforderlich. - Nach Abschluss der Injektionen ist das Tier wieder in seinen Käfig zu bringen.
- Überwachen Sie das Tier sorgfältig, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brusthöhlenliegen aufrechtzuerhalten, und bringen Sie es in seinen Aufenthaltsraum zurück.
- Verabreichen Sie dem Tier in den folgenden 2 Tagen Buprenorphin HCl (0,1 mg/kg, zweimal täglich bei Mäusen, 0,05 mg/kg, zweimal täglich bei Ratten, subkutan). Bringen Sie die Tiere in das Vivarium zurück und überwachen Sie sie täglich auf ungewöhnliche Anzeichen von Schmerzen oder Leiden, und wenn sie gefunden werden, behandeln Sie die Tiere gemäß den Protokollen des Institutional Animal Care Committee.
2. Beurteilung der Anfälligkeit für Herzrhythmusstörungen
HINWEIS: 4-6 Tage nach der Adenovirus-Injektion und 1-2 Wochen nach der AAV-Injektion ist die Anfälligkeit der Tierherzen für Herzrhythmusstörungen gemäß den Schritten 2.1.-2.2 zu beurteilen.
- Führen Sie eine Langendorff-Perfusion des Ratten- oder Mausherzens durch.
- Bereiten Sie Tyrode-Lösung vor, indem Sie Folgendes in 1 l Wasser geben: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); und Glukose, 1,8 g (10 mM). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein (siehe Materialtabelle).
- Die Lösung wird in den Schritten 2.1.6.-2.2.8 kontinuierlich mit einem 0,2-μm-Filter filtriert und mit 100%O2 aufgeblasen.
- Verabreichen Sie der Ratte oder Maus Heparin (500 E/kg, intraperitoneale Injektion) und betäuben Sie das Tier 10 Minuten später mit 3% Isofluran. Sorgen Sie für eine ausreichende Anästhesie mit einer sanften Prise auf den Körper.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen vertikalen Schnitt von 1-1,5 cm in der Mitte des Schlüsselbeins für eine linke Thorakotomie zu machen und das Herz freizulegen.
- Sammeln Sie das Herz, indem Sie mit einer Schere auf Höhe des Aortenbogens schneiden und geben Sie das Herz sofort in eiskalte Tyrode-Lösung.
HINWEIS: Es ist Vorsicht geboten, das Herz während der Herzentnahme nicht zu schädigen. - Die Aorta des Herzens wird mit einer stumpfen Nadel (18 g für Ratten; 23 g für Mäuse) kantiert, die mit einem modifizierten Langendorff-Perfusionssystem (siehe Materialtabelle) im Modus mit konstanter Durchflussrate verbunden ist. Stellen Sie die Durchflussrate ein, um den Perfusionsdruck bei 70-80 mmHg zu halten.
HINWEIS: Eventuelle Blasen in der Perfusionsnadel müssen vor der Aortenkanüle entfernt werden. Die Verwendung eines Präpariermikroskops erleichtert die Kanülierung. - Das kanülierte Herz wird mit dem linken Ventrikel nach oben in einemit Silikonelastomer beschichtete 9,10 cm Kunststoffschale gegeben und das Herz 9,12 mit O2-Bubbled-Tyrode-Lösung bei 37 °C durchblutet.
- Überprüfen Sie die korrekte Aortenkanülation zu Beginn der Perfusion, indem Sie das Auswaschen von Blut aus dem Herzen während der ersten zwei bis drei Herzschläge und die Veränderung der Herzfarbe von rot zu blass beobachten.
- Platzieren Sie die Elektroden eines Kleintier-EKG-Systems (siehe Materialtabelle) um das Herz herum, indem Sie sie in die Silikonelastomerbeschichtung in der Schale einführen (Abbildung 1). Zeichnen Sie das EKG mit einer kompatiblen Software auf.
- Führen Sie eine adrenerge Rezeptorstimulation und eine programmierte elektrische Stimulation durch, um ventrikuläre Tachyarrhythmien zu induzieren.
- Nach erfolgreicher Aortenkanüle wird das Herz 20 Minuten lang mit Tyrode-Lösung durchblutet, um das Herzpräparat zu stabilisieren.
- 1 μM Isoproterenol (siehe Materialtabelle) zu der Tyrode-Lösung geben, die in den Schritten 2.2.3.-2.2.8 für die Herzperfusion verwendet wird.
- Nach 10 Minuten Isoproterenol-Perfusion stimulieren Sie das Herz an der Spitze mit zwei Platinelektroden, die mit einem elektrischen Stimulator verbunden sind (siehe Materialtabelle).
- Beginnen Sie mit dem Stimulationsverfahren (Abbildung 2), das 10 aufeinanderfolgende Stimuli (S1, 5 V, 100 ms-Intervalle) umfasst, denen ein zusätzlicher Stimulus (S2) mit einem Anfangsintervall von 80 ms folgt. Reduzieren Sie das S2-Intervall jedes Mal wiederholt um 2 ms, bis der Herzschlag nicht mehr erfasst werden kann (d. h. die effektive Refraktärperiode des Herzens erreicht wird, ERP)13.
- Überwachen Sie alle induzierten ventrikulären Tachyarrhythmien (einschließlich ventrikulärer Tachykardie und Flimmern) durch EKG.
- Wenn durch das obige Verfahren keine Arrhythmien induziert werden, fügen Sie nach S2 einen weiteren zusätzlichen Stimulus (S3) mit den gleichen Anfangs- (80 ms) und Dekrementintervallen (um 2 ms) hinzu, bis das ERP erreicht ist.
- Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden, fügen Sie nach S3 einen weiteren zusätzlichen Stimulus (S4) mit den gleichen Anfangs- und Dekrementintervallen hinzu, bis das ERP erreicht ist.
- Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden (wie es bei gesunden Kontrollherzen zu erwarten ist), stoppen Sie das elektrische Stimulationsprotokoll und betrachten Sie das Herz als nicht induzierbar.
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Representative Results
Bei Perfusion nach dem hier beschriebenen Protokoll (Abbildung 1) schlägt ein isoliertes Ratten- oder Mausherz mindestens 4 Stunden lang rhythmisch und stabil. Wenn das Versuchsdesign eine längere Dauer der Herzdurchblutung erfordert, ist es hilfreich, Albumin in die Perfusionslösung zu geben, um das Auftreten von Myokardödemen nach längerer Perfusionzu reduzieren 14. Die Aufnahme von Isoproterenol in die Perfusionslösung ahmt die Aktivierung des sympathischen Nervensystems nach, die bei vielen arrhythmogenen Zuständen wie Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz auftritt. Während der programmierten elektrischen Stimulation wird das erfolgreiche Pacing des Herzens durch (1) die 1:1-Erfassung des Herzschlags während der aufeinanderfolgenden S1-Stimuli und (2) den verlängerten (oder breiteren) QRS-Komplex während des S1-Pacings verifiziert (Abbildung 3 und Abbildung 4). Letzteres liegt daran, dass das Herz an der Spitze getaktet wird und die langsamere Leitung der Aktivierung in den ventrikulären Geweben die Dauer des QRS-Komplexes erhöht.
Wie in den veröffentlichten Daten 2,7 gezeigt (Abbildung 3 und Abbildung 4), induzierten diese kombinierten adrenergen und elektrischen Stimulationen keine ventrikulären Tachyarrhythmien (definiert als mindestens drei aufeinanderfolgende vorzeitige ventrikuläre Komplexe, PVCs) in gesunden Mäuseherzen (scheinoperierte Wildtyp-Herzen in Abbildung 3) oder in Kontrollrattenherzen (Kontroll-Ad-GFP-injizierte Rattenherzen in Abbildung 4 ). Im Gegensatz dazu induzierte das gleiche Protokoll ventrikuläre Tachyarrhythmien bei 77 % der Wildtyp-Mäuseherzen nach Myokardinfarkt (Abbildung 3B) und bei drei von vier Rattenherzen nach intramyokardialer Injektion von Ad-Wnt3a (Abbildung 4). Dies zeigt die hohe Genauigkeit dieses ventrikulären Arrhythmie-induzierenden Ansatzes.
Eine erfolgreiche intramyokardiale Transgenexpression nach Virusinjektion kann durch hochregulierte mRNA- und Proteinspiegel des Transgens in den Myokardgeweben nachgewiesen werden, die durch quantitative Echtzeit-RT-PCR, Western Blot oder Immunhistochemie identifiziert wurden. Wenn das Virus ein fluoreszierendes Reportergen wie GFP exprimiert, kann eine erfolgreiche Virustransduktion auch in isolierten, lebenden, einzelnen Kardiomyozyten durch ihre Expression von GFP9 nachgewiesen werden.
Abbildung 1: Langendorff-Perfusion eines isolierten Rattenherzens. Das Herz wird dem Tier entnommen und die Aorta wird mit einer stumpfen 18-G-Nadel kanüliert. Die Nadel wird mit einer 10-ml-Spritze verbunden, die mit 37 °C Tyrode-Lösung bei einem Druck von 70-80 mmHg gefüllt ist. Das Herz wird in eine mit Silikonelastomer beschichtete, 10 cm große Kunststoffschale gelegt, wobei der linke Ventrikel nach oben zeigt. Elektroden (rot, grün und schwarz) eines Kleintier-EKG-Systems werden um das Herz gelegt, indem sie in die Silikonelastomerbeschichtung in der Schale eingeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Adrenerge und elektrische Stimulationen des Langendorff-perfundierten Herzens. (A) Ratten- oder Mausherz wird auf einem Langendorff-System perfundiert, wie in Abbildung 1 gezeigt, und 1 μM Isoproterenol wird der perfusionierenden Tyrode-Lösung zugesetzt, um die β1-adrenergen Rezeptoren des Herzens zu stimulieren. Das Herz wird dann an der Spitze durch zwei Platinelektroden stimuliert, die mit einem Stimulator verbunden sind. (B) Darstellung der programmierten elektrischen Stimulation. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 2.2. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Wang et al.2 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ventrikuläre Tachyarrhythmien, die in Mäuseherzen nach Myokardinfarkt induziert wurden. (A) Repräsentatives Ex-vivo-EKG (Blei II), das eine durch programmierte elektrische Stimulation (PES) induzierte ventrikuläre Tachykardie (VT, definiert als drei oder mehr aufeinanderfolgende vorzeitige ventrikuläre Komplexe, PVCs) in einem Wildtyp-Mausherz (8 Wochen nach Myokardinfarkt, MI) zeigt, wenn es mit einem zusätzlichen Stimulus (S2), aber nur einem einzigen PVC in einem herzspezifischen β-Catenin-Knockout-Mausherz (KO) (8 Wochen nach MI), wenn es mit drei zusätzlichen Stimuli stimuliert wird (S4). Isoproterenol (1 μM) wurde während der PES-Stimulation in die perfundierte Tyrode-Lösung aufgenommen. Herzspezifische β-Catenin (Ctnnb1)-Knockout-Mäuse wurden durch Kreuzung von Ctnnb1-Flox/Fox-Mäusen (mit Exons 2 bis 6 gefloxt) mit αMHC-MerCreMer-Mäusen erzeugt. Im Alter von 8-12 Wochen, Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− Mäuse (KO) und Wurfgeschwister Ctnnb1 flox/flox; αMHC-MerCreMer−/−-Mäuse (die als Kontroll-Wildtyp-Mäuse verwendet wurden) erhielten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen täglich subkutane Injektionen von Tamoxifen (20 mg/kg/Tag), bevor sie entweder der MI- oder der Scheingruppe zugeordnet wurden. (B) Zusammenfassung der PES-induzierten PVCs und VTs in WT- und KO-Herzen 1 Woche oder 8 Wochen nach MI. Jedem Herzen wurde ein Arrhythmie-Score gemäß den Kriterien in der linken Tabelle zugewiesen. 8 Wochen nach MI wurde VT bei 77% der WT-Herzen erfolgreich induziert, aber nur bei 18% der KO-Herzen. Die Daten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA und einem Bonferroni-Post-hoc-Vergleich analysiert. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (SE) an. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Wang et al.2 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Ventrikuläre Tachyarrhythmien, die in Rattenherzen nach intramyokardialer Injektion eines Virus, das Wnt3a exprimiert, induziert wurden. (A) PES-induzierte ventrikuläre Arrhythmien bei Rattenherzen (200-250 g, männlich, Sprague-Dawley) am Tag 4-6 nach intramyokardialer Injektion eines Adenovirus, das Wnt3a exprimiert (Ad-Wnt3a, unten), aber nicht bei Herzen, denen ein Kontroll-Adenovirus injiziert wurde, das GFP exprimiert (Ad-GFP, oben). Die Herzen wurden isoliert und auf einem Langendorff-System durchblutet. Isoproterenol (1 μM) wurde während der PES-Stimulation in die perfundierte Tyrode-Lösung aufgenommen. Ex vivo Das EKG wurde während der PES-Stimulation kontinuierlich aufgezeichnet. Beachten Sie, dass in diesem Experiment 11 aufeinanderfolgende S1-Stimuli (blaue Farbe) verwendet wurden. (B) Zusammenfassung der Studien in Panel (A): Ventrikuläre Tachykardie (VT) wurde durch PES bei drei von vier Herzen mit Ad-Wnt3a-Injektion induziert, aber bei keinem der vier Herzen mit Kontroll-Ad-GFP. Die Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Lu et al.7 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Langendorff-durchbluteten, isolierten Herzpräparation. Erstens ist es wichtig, eine Schädigung des Herzens während der Herzentnahme zu vermeiden (z.B. durch versehentliches Quetschen oder Schneiden mit der Schere). Zweitens ist es wichtig, das gesammelte Herz so schnell wie möglich in kalte Tyrode-Lösung zu geben, da dies den Herzschlag stoppt und den Sauerstoffverbrauch des Herzens reduziert. Drittens darf das Einführen der Nadel in die Aorta nicht zu tief sein – idealerweise befindet sich die Nadelspitze in der Nähe der Aortenklappe, damit das Herz gut durch die Koronararterien durchblutet wird. Schließlich müssen Blasen in der Perfusionsnadel vor der Aortenkanüle entfernt werden - es ist in der Regel hilfreich, die Pumpe kurz vor der Kanülierung für einige Sekunden einzuschalten, um die Blase an der Nadelspitze zu entfernen.
Das Langendorff-perfundierte Herzpräparat hat mehrere Vorteile gegenüber den in vivo Studien an Tieren. Erstens ist es möglich, die Konzentration und Dauer von Medikamenten, die auf das Herz aufgetragen werden (z. B. Isoproterenol, wie in dieser Studie verwendet), genau zu kontrollieren. Zweitens ermöglicht es einen einfachen Zugang zu den verschiedenen Regionen des Herzens entweder für die Stimulation (z. B. elektrisches Schrittmacher an der Spitze in diesem Manuskript) oder für die physiologische Signalaufzeichnung (z. B. optische Kartierung des ventrikulären Gewebes nach Belastung mit einem Ca2+-sensitiven oder spannungsempfindlichen Farbstoff, der hier nicht beschrieben wird). Darüber hinaus kann die Herzfunktion, wie z. B. die ventrikuläre Kontraktilität, leicht gemessen werden, indem ein Ballon in den linken Ventrikel eingeführt und der Ballon mit einem Druckwandler8 verbunden wird. Drittens können die intrinsischen Eigenschaften des Herzens, wie Herzfrequenz und ventrikuläre Kontraktilität, ohne die komplizierenden Faktoren in In-vivo-Studien untersucht werden, wie das autonome Nervensystem und zirkulierende Hormone. Die Einschränkung des Langendorff-perfundierten Herzens besteht jedoch darin, dass ihm die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Organen oder Geweben in vivo15,16,17 entweder über zirkulierende Faktoren oder das autonome Nervensystem fehlt, was in einigen Studien eine entscheidende Rolle spielen kann.
Die ex vivo EKG-Aufzeichnung des Langendorff-perfundierten Herzens, wie hier und in den vorangegangenen Publikationen 2,6,7,9 beschrieben, hat den Vorteil der berührungslosen Aufzeichnung und stellt im Vergleich zu anderen Ansätzen wie dem optischen Mapping, das die Belastung mit Ca2+ erfordert, keine Störung der Herzfunktion dar -empfindliche oder spannungsempfindliche Farbstoffe und die Verwendung eines Erregungs-Kontraktions-Entkopplers zur Verringerung der mechanischen Herzbewegung (z. B. Blebbistatin)12,18. Die optische Kartierung hat jedoch den Vorteil, dass sie detailliertere Informationen über die elektrischen Aktivitäten des Herzens liefert, wie z.B. den Ursprung des Herzschlags, das Muster der Myokardaktivierung und die myokardiale Leitungsgeschwindigkeit.
Das Verfahren der direkten intramyokardialen Injektion eines Virus, wie hier beschrieben, kann auch für die Verabreichung anderer therapeutischer Materialien 19,20,21,22,23,24 verwendet werden, wie z.B. Biomaterialien, Exons, modifizierte mRNA und aus Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten. Die durch Ultraschallbildgebung gesteuerte intramyokardiale Injektion hat mehrere Vorteile gegenüber dem traditionellen thorakotomiebasierten Injektionsansatz. Erstens ist es weniger invasiv und ermöglicht eine schnellere Genesung der Tiere nach dem Injektionsvorgang. Dadurch werden verfahrensbedingte Effekte auf die Tiere reduziert (z.B. durch postoperative Schmerzen und Entzündungen des Brustgewebes bei invasiver Thorakotomie). Zweitens verifiziert die Ultraschallbildgebung eine erfolgreiche Virusinjektion in das Herz, was die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht. Die Einschränkung des ultraschallgesteuerten Virusinjektionsansatzes besteht jedoch darin, dass die Lokalisation der Virusinjektionsstellen nicht so genau gesteuert werden kann wie beim thorakotomiebasierten Ansatz, der eine visuelle Lokalisierung der verschiedenen Herzregionen ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Projektzuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (PJT-148918 und PJT-180533 an WL), den CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, an WL), das McDonald-Stipendium und den New Investigator Award der Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) (S-17-LI-0866, an WL), Studentenstipendien (an JW und YX) und ein Postdoc-Stipendium (an AL) von den Cardiac Endowment Funds der University of Ottawa am Heart Institute. Die Autoren danken Herrn Richard Seymour für seine technische Unterstützung. Abbildung 2 wurde mit Biorender.com mit genehmigten Lizenzen erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
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