Summary
Le présent protocole décrit des méthodes d’expression transgénique dans le cœur de rats et de souris par injection intramyocardique directe du virus sous guidage échocardiographique. Les méthodes d’évaluation de la susceptibilité des cœurs aux arythmies ventriculaires par la stimulation électrique programmée de cœurs isolés perfusés par Langendorff sont également expliquées ici.
Abstract
Les maladies cardiaques sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. En raison de la facilité de manipulation et de l’abondance des souches transgéniques, les rongeurs sont devenus des modèles essentiels pour la recherche cardiovasculaire. Cependant, les arythmies cardiaques létales spontanées qui causent souvent la mortalité chez les patients atteints de maladies cardiaques sont rares chez les modèles de maladies cardiaques chez les rongeurs. Cela est principalement dû aux différences entre les espèces dans les propriétés électriques cardiaques entre les humains et les rongeurs et pose un défi à l’étude des arythmies cardiaques chez les rongeurs. Ce protocole décrit une approche permettant une expression transgénique efficace dans le myocarde ventriculaire de souris et de rat en utilisant des injections intramusculaires guidées par échocardiographie de virus recombinant (adénovirus et virus adéno-associé). Ce travail décrit également une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité cardiaque aux arythmies à l’aide de cœurs de souris et de rats isolés, perfusés par Langendorff, avec des stimulations électriques adrénergiques et programmées. Ces techniques sont essentielles pour étudier les troubles du rythme cardiaque associés à un remodelage cardiaque indésirable après des blessures, telles que l’infarctus du myocarde.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, coûtant la vie à 18 millions de personnes rien qu’en 20171. Les rongeurs, en particulier les souris et les rats, sont devenus le modèle le plus couramment utilisé dans la recherche cardiovasculaire en raison de la facilité de manipulation et de la disponibilité de diverses surexpressions transgéniques ou de lignes knockout. Les modèles de rongeurs ont été fondamentaux pour comprendre les mécanismes de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’infarctus du myocarde2, l’hypertension3, l’insuffisance cardiaque4 et l’athérosclérose5. Cependant, l’utilisation de rongeurs dans les études sur les arythmies cardiaques est limitée par leur petite taille cardiaque et leur fréquence cardiaque plus rapide par rapport aux modèles humains ou aux grands animaux. Par conséquent, les arythmies létales spontanées chez la souris ou le rat après un infarctus du myocarde sont rares2. Les chercheurs sont obligés de se concentrer sur les changements secondaires indirects qui pourraient refléter un substrat pro-arythmique, tels que la fibrose ou l’expression génique, sans montrer de changements significatifs dans la charge de l’arythmie ou les tendances pro-arythmiques. Pour surmonter cette limitation, une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité des cœurs de souris et de rats aux tachyarythmies ventriculaires après modification génétique 6,7 ou infarctus du myocarde2 est décrite dans le présent protocole. Cette méthode combine la stimulation des récepteurs adrénergiques avec la stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires dans des cœurs isolés de souris et de rats perfuséspar Langendorff.
Les approches standard pour le transfert de gènes viraux dans le tissu myocardique des rongeurs impliquent souvent l’exposition du cœur par thoracotomie 9,10,11, qui est une procédure invasive et est associée à une récupération retardée des animaux après la procédure. Cet article décrit une méthode d’injection intramyocardique directe de virus sous guidage d’imagerie par ultrasons pour la surexpression de transgènes. Cette procédure moins invasive permet une récupération plus rapide de l’animal après une injection virale et moins de lésions tissulaires, par rapport à la thoracotomie, réduit la douleur postopératoire et l’inflammation chez l’animal et, ainsi, permet une meilleure évaluation des effets des gènes transgéniques sur la fonction cardiaque.
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Protocol
Toutes les méthodes et procédures décrites ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche animale de l’Université d’Ottawa et le comité d’examen de la biosécurité de l’Institut de cardiologie de l’Université d’Ottawa. Les protocoles de sécurité élaborés comprennent que toutes les procédures relatives à l’adénovirus recombinant ou au virus adéno-associé (AAV) ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité de niveau II. Tous les objets en contact avec le virus ont été soigneusement décontaminés après l’expérience. Des souris Ctnnb1 flox/flox et αMHC-MerCreMer (âgées de 8 à 12 semaines, des deux sexes) et des rats Sprague-Dawley (200 à 250 g, mâles) ont été utilisés pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). Toutes les procédures concernant les animaux ont été effectuées par du personnel formé et approuvé par les comités de réglementation de l’établissement. Un équipement de protection individuelle approprié a été utilisé pendant toutes les procédures.
1. Expression d’un transgène viral dans les tissus ventriculaires de rongeurs
REMARQUE : Conserver l’adénovirus recombinant ou l’AAV qui exprime le gène cible et le virus témoin correspondant, tel que Ad-GFP (titre de 1 x 10 10 UFP/mL) ou AAV9-GFP (titre de 1 x 1013 GC/mL) (voir le tableau des matières), dans un congélateur à −80 °C.
- Le jour de l’injection du virus, décongelez le virus sur la glace. Aspirer le virus exprimant le gène cible et le virus témoin dans deux seringues distinctes (volume = 50 μL) avec des aiguilles de 30 G 1/2 et conserver sur la glace jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Toutes les bulles dans la seringue et l’aiguille doivent être soigneusement enlevées. - Administrer de la buprénorphine à des rats ou des souris (0,05 mg/kg pour les rats, 0,1 mg/kg pour les souris, sous-cutanée), induire une anesthésie 1 h plus tard en utilisant 3 % d’isoflurane, et maintenir l’isoflurane à 2 % (dans 100 % d’oxygène à un débit de 0,5 à 1,0 L/min) pour la procédure suivante.
- Pincez doucement le corps de l’animal (p. ex., la queue) avec une paire de pinces, et si l’animal ne répond pas au pincement par des mouvements du corps, une anesthésie appropriée est confirmée.
- Maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant électrique. Rasez les cheveux dans la région de la poitrine à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
REMARQUE: Des précautions doivent être prises lors de l’utilisation d’un coussin chauffant électrique en raison de la répartition inégale potentielle de la chaleur. - Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
- Gardez l’animal en décubitus dorsal et utilisez un système d’imagerie préclinique (voir le tableau des matériaux) pour l’imagerie échographique du cœur de l’animal dans l’orientation à axe court.
REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées dans une enceinte de biosécurité de niveau II qui fournit un environnement stérile. Les procédures de sécurité standard, y compris celles qui prévoient la manipulation sécuritaire des aiguilles, sont utilisées. - Stérilisez la région inférieure gauche de la poitrine de l’animal avec des rondes alternées d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et d’alcool trois fois dans un mouvement circulaire.
- Sous guidage d’imagerie par ultrasons, insérer l’aiguille de 30 G 1/2 de la seringue contenant le virus telle que préparée à l’étape 1.1. dans la poitrine de l’animal par le côté inférieur gauche de la poitrine du corps.
- Approchez l’extrémité de l’aiguille dans la paroi libre avant ventriculaire gauche et injectez lentement 10-15 μL du virus. Vérifier la réussite de l’injection dans les images échographiques par la luminosité améliorée près de la pointe de l’aiguille.
REMARQUE : La quantité de virus injectée à chaque site ne dépasse pas 15 μL pour prévenir les dommages physiques aux tissus myocardiques. - Retirez l’aiguille du cœur et insérez-la dans d’autres régions du ventricule gauche pour une deuxième et une troisième injection de la même quantité de virus.
REMARQUE : Le nombre total de sites d’injection est déterminé par le plan expérimental. Si l’expression du transgène focal est nécessaire, une seule injection est nécessaire; Si une expression transgénique plus diffuse est nécessaire, plusieurs sites d’injection (trois à cinq) sont généralement nécessaires. - Une fois les injections terminées, remettez l’animal dans sa cage.
- Surveillez attentivement l’animal jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale et le ramener dans sa chambre de logement.
- Administrer de la buprénorphine HCl (0,1 mg/kg, deux fois par jour pour les souris, 0,05 mg/kg, deux fois par jour pour les rats, sous-cutanée) à l’animal pendant les 2 jours suivants. Retourner les animaux au vivarium et surveiller quotidiennement tout signe inhabituel de douleur ou de détresse et, s’ils sont trouvés, traiter les animaux conformément aux protocoles du comité de protection des animaux de l’établissement.
2. Évaluation de la susceptibilité à l’arythmie cardiaque
NOTE: 4-6 jours après l’injection de l’adénovirus et 1-2 semaines après l’injection d’AAV, évaluer la sensibilité du cœur de l’animal aux arythmies cardiaques en suivant les étapes 2.1.-2.2.
- Effectuer une perfusion Langendorff du cœur de rat ou de souris.
- Préparer la solution Tyrode en ajoutant ce qui suit à 1 L d’eau: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); et glucose, 1,8 g (10 mM). Ajustez le pH à 7,40 avec NaOH (voir le tableau des matériaux).
- Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm et faire des bulles avec 100% O 2 en continu pendant les étapes 2.1.6.-2.2.8 .
- Administrer de l’héparine au rat ou à la souris (500 U/kg, injection intrapéritonéale) et anesthésier l’animal 10 min plus tard avec de l’isoflurane à 3%. Assurez-vous d’une anesthésie adéquate avec une légère pincement sur le corps.
- Utilisez un scalpel pour faire une incision verticale de 1 à 1,5 cm dans la ligne mi-claviculaire pour une thoracotomie gauche et exposer le cœur.
- Recueillir le cœur en coupant avec une paire de ciseaux au niveau de l’arc aortique et mettre immédiatement le cœur dans une solution de Tyrode glacée.
REMARQUE: Des précautions sont prises pour ne pas endommager le cœur pendant la collecte cardiaque. - Canuler l’aorte du cœur avec une aiguille émoussée (18 G pour les rats; 23 G pour les souris) reliée à un système de perfusion de Langendorff modifié (voir Tableau des matériaux) en mode débit constant. Ajustez le débit pour maintenir la pression de perfusion à 70-80 mmHg.
REMARQUE: Toutes les bulles dans l’aiguille de perfusion doivent être enlevées avant la canulation aortique. L’utilisation d’un microscope à dissection facilite la canulation. - Placer le cœur canulé dans une capsule en plastique de 9,10 cm recouverte d’élastomère de silicone, le ventricule gauche tourné vers le haut et perfuser le cœur 9,12 avec une solution de Tyrode à bulles d’O2 à 37 °C.
- Vérifiez la bonne canulation aortique au début de la perfusion en observant le lavage du sang du cœur pendant les deux ou trois premiers battements cardiaques et le changement de couleur du cœur du rouge au pâle.
- Placez les électrodes d’un système ECG pour petit animal (voir le tableau des matériaux) autour du cœur en les insérant dans le revêtement en élastomère de silicone de la capsule (Figure 1). Enregistrez l’ECG à l’aide d’un logiciel compatible.
- Effectuer une stimulation des récepteurs adrénergiques et une stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires.
- Après une canulation aortique réussie, continuez à perfuser le cœur avec la solution Tyrode pendant 20 minutes pour stabiliser la préparation cardiaque.
- Ajouter 1 μM d’isoprotérénol (voir le tableau des matériaux) à la solution Tyrode utilisée pour la perfusion cardiaque aux étapes 2.2.3.-2.2.8.
- Après 10 min de perfusion d’isoprotérenol, stimuler le cœur à l’apex avec deux électrodes de platine reliées à un stimulateur électrique (voir Tableau des matériaux).
- Commencez par la procédure de stimulation (Figure 2), qui comprend 10 stimuli consécutifs (intervalles S1, 5 V, 100 ms) suivis d’un stimulus supplémentaire (S2) avec un intervalle initial de 80 ms. Réduisez à plusieurs reprises l’intervalle S2 de 2 ms à chaque fois jusqu’à ce que le rythme cardiaque ne puisse plus être capturé (c.-à-d. atteindre la période réfractaire effective du cœur, ERP)13.
- Surveiller toute tachyarythmie ventriculaire induite (y compris la tachycardie ventriculaire et la fibrillation) par ECG.
- Si aucune arythmie n’est induite par la procédure ci-dessus, ajoutez un autre stimulus supplémentaire (S3) après S2 avec les mêmes intervalles initiaux (80 ms) et décrémentés (de 2 ms) jusqu’à ce que l’ERP soit atteint.
- Si les tachyarythmies ventriculaires ne sont toujours pas induites, ajoutez un stimulus supplémentaire (S4) après S3 avec les mêmes intervalles initiaux et décrémentaires jusqu’à ce que l’ERP soit atteint.
- Si les tachyarythmies ventriculaires ne sont toujours pas induites (comme prévu chez les cœurs sains de contrôle), arrêtez le protocole de stimulation électrique et considérez que le cœur n’est pas inductible.
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Representative Results
Lorsqu’il est perfusé suivant le protocole décrit ici (Figure 1), un cœur de rat ou de souris isolé bat de manière rythmique et stable pendant au moins 4 heures. Si la conception expérimentale nécessite une période plus longue de perfusion cardiaque, il est utile d’ajouter de l’albumine dans la solution de perfusion pour réduire l’apparition d’un œdème myocardique après une perfusion de longue durée14. L’inclusion d’isoprotérénol dans la solution de perfusion imite l’activation du système nerveux sympathique qui se produit dans de nombreuses conditions arythmogènes telles que l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Au cours de la stimulation électrique programmée, la stimulation réussie du cœur est vérifiée par (1) la capture 1:1 du rythme cardiaque pendant les stimuli S1 consécutifs et (2) le complexe QRS prolongé (ou plus large) pendant la stimulation S1 (Figure 3 et Figure 4). Ce dernier est dû au fait que le cœur est rythmé à l’apex et que la conduction plus lente de l’activation dans les tissus ventriculaires augmente la durée du complexe QRS.
Comme démontré dans les données publiées2,7 (Figure 3 et Figure 4), ces stimulations adrénergiques et électriques combinées n’ont induit aucune tachyarythmie ventriculaire (définie comme au moins trois complexes ventriculaires prématurés consécutifs, PVC) dans des cœurs de souris sains (cœurs de type sauvage opérés fictif sur la figure 3) ou dans des cœurs de rats témoins (cœurs de rats contrôlés injectés Ad-GFP à la figure 4 ). En revanche, le même protocole a induit des tachyarythmies ventriculaires chez 77% des cœurs de souris de type sauvage après un infarctus du myocarde (Figure 3B) et chez trois cœurs de rats sur quatre après injection intramyocardique d’Ad-Wnt3a (Figure 4). Cela démontre la haute fidélité de cette approche induisant l’arythmie ventriculaire.
L’expression réussie du transgène intramyocardique après l’injection du virus peut être vérifiée par des niveaux d’ARNm et de protéines régulés à la hausse du transgène dans les tissus myocardiques identifiés par RT-PCR quantitative en temps réel, Western blot ou immunohistochimie. Si le virus exprime un gène rapporteur fluorescent, tel que la GFP, une transduction virale réussie peut également être vérifiée dans des cardiomyocytes isolés, vivants et uniques par leur expression de GFP9.
Figure 1 : Perfusion de Langendorff d’un cœur de rat isolé. Le cœur est recueilli sur l’animal et l’aorte est canulée avec une aiguille émoussée de 18 G. L’aiguille est reliée à une seringue de 10 mL remplie d’une solution Tyrode à 37 °C à une pression de 70-80 mmHg. Le cœur est placé dans une boîte en plastique de 10 cm recouverte d’élastomère de silicone, le ventricule gauche tourné vers le haut. Les électrodes (couleurs rouge, vert et noir) d’un système ECG pour petit animal sont placées autour du cœur en les insérant dans le revêtement en élastomère de silicone dans le plat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stimulations adrénergiques et électriques du cœur perfusé par Langendorff. (A) Le cœur de rat ou de souris est perfusé sur un système de Langendorff comme le montre la figure 1, et 1 μM d’isoprotérénol est ajouté à la solution perfusante de Tyrode pour stimuler les récepteurs adrénergiques β1 du cœur. Le cœur est ensuite stimulé à l’apex par deux électrodes de platine reliées à un stimulateur. (B) Représentation de la stimulation électrique programmée. Pour plus de détails, voir l’étape 2.2. La figure est modifiée avec la permission de Wang et al.2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Tachyarythmies ventriculaires induites dans le cœur de souris après un infarctus du myocarde. (A) ECG ex vivo représentatif (plomb II) montrant une tachycardie ventriculaire induite par stimulation électrique programmée (PES) (VT, définie comme trois complexes ventriculaires prématurés consécutifs ou plus, PVC) dans un cœur de souris de type sauvage (WT) (à 8 semaines après l’infarctus du myocarde, IM) lorsqu’il est stimulé par un stimulus supplémentaire (S2) mais un seul PVC dans un β-caténine knockout (KO) cœur de souris (à 8 semaines après l’IM) lorsqu’il est stimulé par trois stimuli supplémentaires (S4). L’isoprotérénol (1 μM) a été inclus dans la solution perfusante de Tyrode pendant la stimulation de l’EPS. Des souris knockout β-caténine (Ctnnb1) spécifiques aux maladies cardiaques ont été générées par croisement de souris flox/flox Ctnnb1 (avec exons 2 à 6 floxed) avec des souris αMHC-MerCreMer. À l’âge de 8 à 12 semaines, souris Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− (KO) et Ctnnb1 flox/flox de portée; Les souris αMHC-MerCreMer−/− (utilisées comme souris témoins de type sauvage) ont reçu des injections sous-cutanées quotidiennes de tamoxifène (20 mg/kg/jour) pendant 5 jours consécutifs avant d’être assignées au groupe MI ou au groupe placebo. (B) Résumé des PVC et VT induits par les PES dans les cœurs WT et KO à 1 semaine ou 8 semaines après l’IM. Un score d’arythmie a été attribué à chaque cœur selon les critères du tableau de gauche. À 8 semaines après l’IM, la VT a été induite avec succès dans 77% des cœurs WT, mais seulement dans 18% des cœurs KO. Les données ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle et une comparaison post-hoc de Bonferroni. Les barres d’erreur indiquent l’erreur type (SE). La figure est reproduite avec la permission de Wang et al.2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Tachyarythmies ventriculaires induites dans le cœur de rat après injection intramyocardique d’un virus exprimant Wnt3a. (A) L’EPS a induit des arythmies ventriculaires dans le cœur de rats (200-250 g, mâle, Sprague-Dawley) aux jours 4-6 après injection intramyocardique d’un adénovirus exprimant Wnt3a (Ad-Wnt3a, en bas) mais pas dans les cœurs injectés avec un adénovirus témoin exprimant la GFP (Ad-GFP, en haut). Les cœurs ont été isolés et perfusés sur un système de Langendorff. L’isoprotérénol (1 μM) a été inclus dans la solution perfusante de Tyrode pendant la stimulation de l’EPS. Ex vivo L’ECG a été enregistré en continu pendant la stimulation de l’EPS. Notez que 11 stimuli S1 consécutifs (couleur bleue) ont été utilisés dans cette expérience. (B) Résumé des études dans le groupe (A): La tachycardie ventriculaire (VT) a été induite par l’EPS dans trois cœurs sur quatre avec injection d’Ad-Wnt3a, mais dans aucun des quatre cœurs avec Ad-GFP témoin. La figure est reproduite avec la permission de Lu et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Plusieurs étapes sont essentielles au succès de la préparation cardiaque isolée perfusée par Langendorff. Tout d’abord, il est important d’éviter tout dommage au cœur pendant la collecte du cœur (par exemple, en raison d’une compression accidentelle ou d’une coupure avec les ciseaux). Deuxièmement, il est essentiel de mettre le cœur recueilli dans une solution froide de Tyrode dès que possible, car cela arrêtera le rythme cardiaque et réduira la consommation d’oxygène du cœur. Troisièmement, l’insertion de l’aiguille dans l’aorte ne doit pas être trop profonde – idéalement, la pointe de l’aiguille est proche du niveau de la valve aortique afin que le cœur soit bien perfusé par les artères coronaires. Enfin, les bulles dans l’aiguille de perfusion doivent être enlevées avant la canulation aortique – il est généralement utile d’allumer la pompe pendant quelques secondes juste avant la canulation pour enlever la bulle au bout de l’aiguille.
La préparation cardiaque perfusée par Langendorff présente plusieurs avantages par rapport aux études in vivo chez l’animal. Premièrement, il est possible de contrôler avec précision la concentration et la durée des médicaments appliqués sur le cœur (p. ex., l’isoprotérénol, tel qu’utilisé dans cette étude). Deuxièmement, il permet un accès facile aux différentes régions du cœur pour la stimulation (par exemple, la stimulation électrique au sommet dans ce manuscrit) ou l’enregistrement du signal physiologique (par exemple, la cartographie optique des tissus ventriculaires après la charge avec un colorant sensible au Ca2+ ou à la tension, qui n’est pas décrit ici). De plus, la fonction cardiaque, telle que la contractilité ventriculaire, peut être facilement mesurée en insérant un ballonnet dans le ventricule gauche et en connectant le ballonnet à un transducteur de pression8. Troisièmement, les propriétés intrinsèques du cœur, telles que la fréquence cardiaque et la contractilité ventriculaire, peuvent être étudiées sans les facteurs de complication dans les études in vivo, telles que le système nerveux autonome et les hormones circulantes. Cependant, la limite du cœur perfusé par Langendorff est qu’il manque la diaphonie entre différents organes ou tissus in vivo15,16,17 via des facteurs circulants ou le système nerveux autonome, qui peuvent être des acteurs critiques dans certaines études.
L’enregistrement ECG ex vivo du cœur perfusé par Langendorff, tel que décrit ici et dans les publications précédentes 2,6,7,9, présente l’avantage de l’enregistrement sans contact et ne perturbe pas la fonction cardiaque par rapport à d’autres approches telles que la cartographie optique, qui nécessite la charge de Ca2+ -colorants sensibles ou sensibles à la tension et l’utilisation d’un découpleur d’excitation-contraction pour réduire les mouvements cardiaques mécaniques (tels que la blébbistatine)12,18. Cependant, la cartographie optique a l’avantage de fournir des informations plus détaillées sur les activités électriques du cœur, telles que l’origine du rythme cardiaque, le schéma d’activation myocardique et la vitesse de conduction myocardique.
La méthode d’injection intramyocardique directe d’un virus, telle que décrite ici, peut également être utilisée pour l’administration d’autres matériaux thérapeutiques 19,20,21,22,23,24, tels que les biomatériaux, les exons, l’ARNm modifié et les cardiomyocytes dérivés de cellules souches. L’injection intramyocardique guidée par imagerie par ultrasons présente plusieurs avantages par rapport à l’approche traditionnelle par injection basée sur la thoracotomie. Tout d’abord, il est moins invasif et permet une récupération plus rapide des animaux après la procédure d’injection. Cela réduit les effets associés à la procédure sur les animaux (p. ex. ceux causés par la douleur postopératoire et l’inflammation du tissu thoracique lorsqu’une thoracotomie invasive est utilisée). Deuxièmement, l’imagerie par ultrasons vérifie le succès de l’injection de virus dans le cœur, ce qui augmente la cohérence et la reproductibilité des résultats. Cependant, la limite de l’approche d’injection virale guidée par ultrasons est que les emplacements des sites d’injection du virus ne peuvent pas être contrôlés aussi précisément que dans l’approche basée sur la thoracotomie, qui permet la localisation visuelle des différentes régions cardiaques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par les subventions Projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (PJT-148918 et PJT-180533, à WL), la Bourse de chercheur en début de carrière des IRSC (AR8-162705, à WL), la Bourse McDonald et la Bourse de nouveau chercheur de la Fondation des maladies du cœur du Canada (FMCC) (S-17-LI-0866, à WL), des bourses d’études (à JW et YX) et une bourse postdoctorale (à AL) du Fonds de dotation en cardiologie de l’Université d’Ottawa à l’Institut de cardiologie. Les auteurs remercient M. Richard Seymour pour son soutien technique. La figure 2 a été créée avec Biorender.com avec des licences approuvées.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
