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Cancer Research

हेमटोपोइएटिक साइटोकिन के साथ ट्यूमर टीकाकरण का उपयोग करके प्रयोगात्मक मेलेनोमा इम्यूनोथेरेपी मॉडल

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64082
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1La Jolla Institute for Immunology

Summary

प्रोटोकॉल एफएलटी 3 एल-व्यक्त बी 16-एफ 10 मेलेनोमा के साथ सेल-आधारित ट्यूमर टीकाकरण का उपयोग करके एक कैंसर इम्यूनोथेरेपी मॉडल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करता है, जिसमें सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी, ट्यूमर प्रत्यारोपण, सेल विकिरण, ट्यूमर के विकास का माप, इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण शामिल हैं।

Abstract

एफएमएस जैसे टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड (एफएलटी 3 एल) एक हेमटोपोइएटिक साइटोकिन है जो डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) के अस्तित्व और भेदभाव को बढ़ावा देता है। इसका उपयोग ट्यूमर टीकों में जन्मजात प्रतिरक्षा को सक्रिय करने और एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए किया गया है। यह प्रोटोकॉल सेल-आधारित ट्यूमर वैक्सीन का उपयोग करके एक चिकित्सीय मॉडल प्रदर्शित करता है जिसमें ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विश्लेषण के साथ एफएलटी 3 एल-व्यक्त बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाएं शामिल हैं। सुसंस्कृत ट्यूमर सेल तैयारी, ट्यूमर आरोपण, सेल विकिरण, ट्यूमर आकार माप, इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिका अलगाव और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एक प्रीक्लिनिकल ठोस ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी मॉडल प्रदान करना है, और ट्यूमर कोशिकाओं और घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक शोध मंच है। यहां वर्णित इम्यूनोथेरेपी प्रोटोकॉल को अन्य चिकित्सीय तौर-तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे कि प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी (एंटी-सीटीएलए -4, एंटी-पीडी -1, एंटी-पीडी-एल 1 एंटीबॉडी) या मेलेनोमा के कैंसर चिकित्सीय प्रभाव में सुधार के लिए कीमोथेरेपी।

Introduction

कैंसर इम्यूनोथेरेपी को इसके कम विषाक्त दुष्प्रभावों और अधिक टिकाऊ प्रतिक्रियाओं के आधार पर एक आशाजनक चिकित्सीय रणनीति के रूप में मान्यता दी गई है। कई प्रकार के इम्यूनोथेरेपी विकसित किए गए हैं, जिनमें ऑनकोलिटिक वायरस थेरेपी, कैंसर टीके, साइटोकिन थेरेपी, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, दत्तक सेल ट्रांसफर (सीएआर-टी कोशिकाएं या सीएआर-एनके), और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी1 शामिल हैं।

कैंसर के टीकों के लिए, चिकित्सीय टीकों के विभिन्न रूप हैं, जैसे कि पूरे सेल-आधारित टीके, प्रोटीन या पेप्टाइड टीके, और आरएनए या डीएनए टीके। टीकाकरण ट्यूमर-विशिष्ट एंटीजन सहित ट्यूमर एंटीजन को संसाधित करने के लिए एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीआई) की क्षमता पर निर्भर करता है, और उन्हें टी कोशिकाओं को एक इम्युनोजेनिक रूप में प्रस्तुत करता है। डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) को सबसे शक्तिशाली एपीआई के रूप में जाना जाता है और माना जाता है कि एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा 2,3 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये कोशिकाएं ट्यूमर एंटीजन को लेती हैं और संसाधित करती हैं, और फिर टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) और कोस्टिमुलेटरी अणुओं की सगाई के माध्यम से ट्यूमर-विशिष्ट टी प्रभावक (टेफ) कोशिकाओं को प्राइम और सक्रिय करने के लिए ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स (डीएलएन) में स्थानांतरित होती हैं। इसके परिणामस्वरूप ट्यूमर-विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (सीटीएल) का भेदभाव और विस्तार होता है, जो ट्यूमर में घुसपैठ करते हैं और ट्यूमर कोशिकाओं को मारतेहैं। नतीजतन, डीसी की सक्रियता और परिपक्वता ट्यूमर एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा को प्रोत्साहित करने के लिए आकर्षक रणनीतियों का प्रतिनिधित्व करती है।

Flt3L कार्यात्मक रूप से परिपक्व DCs की परिपक्वता और विस्तार को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है जो MHC वर्ग II, CD11c, DEC205 और CD86 प्रोटीन5 को व्यक्त करते हैं। इंट्राट्यूमरल, लेकिन अंतःशिरा नहीं, एफएलटी 3 एल जीन (एडीवी-एफएलटी 3 एल ) को शामिल करने वाले एडेनोवायरस वेक्टर के प्रशासन को ऑर्थ्रोटोपिक ट्यूमर6 के खिलाफ प्रतिरक्षा चिकित्सीय गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। एफएलटी 3 एल का उपयोग ट्यूमर सेल-आधारित टीकों में भी किया गया है जिसमें विकिरणित बी 16-एफ 10 कोशिकाएं शामिल हैं जो डीसी द्वारा ट्यूमर एंटीजन की क्रॉस-प्रस्तुति को बढ़ाने के तरीके के रूप में रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूस्ड एफएलटी 3 एल को स्थिर रूप से व्यक्त करती हैं और इस प्रकार, एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बढ़ाती हैं। यहां वर्णित बी 16-एफएलटी 3 एल ट्यूमर टीकाकरण का प्रोटोकॉल डॉ जेम्स एलिसन के समूह7 द्वारा प्रकाशित एक अध्ययन पर आधारित है। इस पेपर में, उन्होंने बताया कि सीटीएलए -4 नाकाबंदी के साथ संयुक्त बी 16-एफएलटी 3 एल वैक्सीन ने सहक्रियात्मक रूप से स्थापित मेलेनोमा की अस्वीकृति को प्रेरित किया, जिसके परिणामस्वरूप जीवित रहने में वृद्धि हुई।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मेलेनोमा के लिए प्रीक्लिनिकल इम्यूनोथेरेपी मॉडल प्रदान करना है। यहां, ट्यूमर के टीके तैयार करने और प्रत्यारोपित करने के तरीके की विस्तृत प्रक्रियाएं, और ठोस ट्यूमर से इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संरचना और कार्य का विश्लेषण कैसे करें, इसका वर्णन किया गया है।

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Protocol

अध्ययन में इस्तेमाल किए गए सभी चूहों को नियंत्रित तापमान और आर्द्रता के साथ विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में ला जोला इंस्टीट्यूट फॉर इम्यूनोलॉजी (एलजेआई) के विवेरियम में बनाए रखा गया था। एलजेआई पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुसार 8-14 सप्ताह की मादा सी 57बीएल / 6 चूहों के साथ पशु प्रयोग किए गए थे।

1. आरोपण के लिए सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी

  1. इसकोव के मॉडिफाइड डलबेको के माध्यम (आईएमडीएम) में कल्चर बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाएं जिसमें 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, 2 एमएम ग्लूटामाइन, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 1 एमएम एमईएम गैर-अमीनो एसिड और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 यू / एमएल शामिल हैं। 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल लाइन बनाए रखें।
  2. बीज 1.5-2 x 106 B16-F10 कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए 175T फ्लास्क और कल्चर में। फसल कोशिकाएं जब वे 75% -80% कॉन्फ्लुएंट होती हैं।
  3. कल्चर माध्यम को हटा दें और फ्लास्क को एक बार पीबीएस से धो लें। एस्पिरेटेड पीबीएस और 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 एमएल जोड़ें, इसके बाद कल्चर फ्लास्क के रिम को कठोर रूप से टैप करें।
  4. ट्रिप्सिन-ईडीटीए को बेअसर करने के लिए 15 एमएल कल्चर माध्यम जोड़ें और फ्लास्क की सामग्री को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। डिश की सतह को 10 एमएल पीबीएस के साथ धोएं और उसी 50 एमएल ट्यूब में डालें।
  5. कोशिकाओं को 200 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और ट्यूब के निचले हिस्से को उंगली से टैप करके सेल पेलेट को तोड़ दें।
  6. ठंडा 10 एमएल पीबीएस जोड़ें और धीरे से सेल निलंबन को पाइप करें; फिर, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से गिनते हैं। इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।

2. ट्यूमर प्रत्यारोपण

  1. गैस फ्यूम हुड में 1.0 एल प्रति मिनट की गैस प्रवाह दर पर 5% आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करती है। चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड करने के बाद प्रवाह दर को 2% आइसोफ्लुरेन की रखरखाव खुराक में बदलें। इस प्रोटोकॉल के लिए, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग दिशानिर्देशों का पालन करते हुए पशु चिकित्सक द्वारा एनेस्थेटाइजेशन किया गया था।
  2. चूहों के बाएं फ्लैंक पर बालों को शेव करें और अल्कोहल वाइप्स का उपयोग करके इंजेक्शन साइट को निष्फल करें। इंट्राडर्मल रूप से (यानी) बी 16-एफ 10 ट्यूमर कोशिकाओं को 5 x 105 कोशिकाओं में 50 μL ठंडे पीबीएस में 30 जी सुई का उपयोग करके बाएं फ्लैंक में प्रत्यारोपित करें।
    नोट: सफल ट्यूमर विकास के लिए प्रत्यारोपित बी 16-एफ 10 ट्यूमर कोशिकाओं की खुराक को 0.5-5 x 105 कोशिकाओं की सीमा में समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  3. आरोपण के बाद, इलेक्ट्रॉनिक डिजिटल कैलिपर का उपयोग करके सप्ताह में तीन बार ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापें। सूत्र का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा (मिमी3) की गणना करें:
    ट्यूमर की मात्रा (मिमी3) = चौड़ाई2 × लंबाई × 0.5
    ट्यूमर वैक्सीन के साथ चूहों का इलाज करें जब ट्यूमर ≥2 मिमी के आकार तक पहुंच गया है।
    नोट: ट्यूमर को आमतौर पर 5 x10 5 ट्यूमर कोशिकाओं के आरोपण के बाद दिन 3 पर मापा जा सकता है। पुरुष C57BL/6, Rag1-/-, या Rag2-/-γc-/-चूहों में तेजी से B16-F10 ट्यूमर वृद्धि दर देखी गई। इसी तरह के अवलोकन का वर्णन अन्यअध्ययनों में किया गया था। चूहों के लिंग को सुसंगत रखने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, ध्यान दें कि एनआईएच बायोमेडिकल अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण जैविक चर के रूप में सेक्स पर जोर देता है।

3. Flt3L-व्यक्त B16-F10 (B16-Flt3L) कोशिकाओं का टीका तैयार करना और इंजेक्शन

  1. डीएमईएम में बी 16-एफएलटी 3 एल कोशिकाओं को बनाए रखें जिसमें 8% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, 2 एमएम ग्लूटामाइन, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रत्येक 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
  2. बीज 1 x 106 B16-Flt3L कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए 175T फ्लास्क और कल्चर में। फसल कोशिकाएं जब वे चरण 1.3 से 1.6 में वर्णित 75% -80% कॉन्फ्लुएंट होती हैं और ठंडे पीबीएस के 1 एमएल में निलंबित होती हैं।
  3. 160 केवी और 25 एमए पैरामीटर सेटिंग के साथ एक्स-रे इरेडिएटर का उपयोग करके गामा किरणों की 150 जीवाई खुराक पर विकिरणित कोशिकाएं। इंजेक्शन से पहले ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग द्वारा सेल व्यवहार्यता की गणना और जांच करें।
  4. गैस एनेस्थेटाइज चूहों को पहले वर्णित करती है और अल्कोहल वाइप्स का उपयोग करके इंजेक्शन साइट को निष्फल करती है। इंट्राडर्मल रूप से चूहों को 1 x 106 विकिरणित बी 16-एफएलटी 3 एल कोशिकाओं के साथ 50 μL ठंडे पीबीएस में मूल ट्यूमर प्रत्यारोपण के समान फ्लैंक पर इंजेक्ट किया जाता है, प्रारंभिक सेल प्रत्यारोपण के बाद 3, 6 और 9 दिनों में प्राथमिक ट्यूमर की साइट से ~ 1 सेमी दूर।
  5. प्राथमिक ट्यूमर से अलग करने के लिए एक रंगीन पेन के साथ वैक्सीन इंजेक्शन साइटों को चिह्नित करें।
    नोट: यदि 0.5 x 105 B16-F10 कोशिकाओं को शुरू में प्रत्यारोपित किया जाता है, तो 8, 11 और 14 दिनों में टीका उपचार करने की सिफारिश की जाती है।

4. इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिका अलगाव

  1. प्रयोग के अंत में फ्यूम हुड में सीओ2 और ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करके चूहों का बलिदान करें (ट्यूमर प्रत्यारोपण के बाद 15 वें दिन; चित्र 1)।
  2. शल्य चिकित्सा द्वारा प्रत्येक माउस से त्वचा के साथ ट्यूमर को हटा दें और इसे 1 एमएल 10% एफबीएस / आरपीएमआई -1640 माध्यम के साथ 24-वेल प्लेट में डालें। वजन करने से पहले एक पेपर तौलिया का उपयोग करके ट्यूमर को सुखाएं।
  3. ट्यूमर को छोटे टुकड़ों में काट लें। आरपीएमआई -1640 माध्यम में 2 एमएल पाचन बफर (100 μg / mL लिबेरेस और 200 μg / mL DNase I जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. पाचन को रोकने के लिए 10% एफबीएस / आरपीएमआई -1640 माध्यम का 10 एमएल जोड़ें। 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और 40 μm सेल छन्नी पर ऊतक को पीसने के लिए 1 एमएल सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करें।
  5. कोशिकाओं को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस में 40% घनत्व ढाल विशिष्ट माध्यम के 5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, 1x सांद्रता तक पतला)।
  6. पीबीएस युक्त 80% घनत्व-ढाल-विशिष्ट माध्यम के 5 एमएल के शीर्ष पर सेल निलंबन धीरे-धीरे जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 23 मिनट के लिए कम ब्रेक सेटिंग के साथ 325 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 40% और 80% घनत्व-ढाल-विशिष्ट माध्यम के बीच इंटरफ़ेस पर ल्यूकोसाइट्स परत को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें और इसे 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से पारित करें। कोशिकाओं को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. आरटी पर 5 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लाइसिस बफर के 2 एमएल में गोली को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, आरबीसी लाइसिस बफर को बुझाने के लिए 10% एफबीएस / आरपीएमआई -1640 माध्यम का 10 एमएल जोड़ें।
  9. कोशिकाओं को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। आरपीएमआई -1640 माध्यम के 0.5 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग करने से पहले कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
    नोट: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय की सिंचाई रणनीति के लिए नियंत्रण के रूप में प्लीहा या डीएलएन एकत्र करें। निम्नलिखित परिवर्तनों के साथ ऊपर वर्णित सेल अलगाव विधि का पालन करें: 70 μm जाल फिल्टर पर ऊतक को पीसने के लिए 1 एमएल सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करें। एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ऊतक को 10% एफबीएस / आरपीएमआई -1640 माध्यम से धोएं। जैसा कि वर्णित है, आरबीसी को लाइस करें।

5. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

नोट: ल्यूकोसाइट्स परत से एकत्रित कोशिकाओं में प्रतिरक्षा कोशिकाएं और ट्यूमर कोशिकाएं होती हैं। दो स्वतंत्र धुंधला पैनलों की सिफारिश की जाती है।

  1. सतह का धुंधलापन
    1. कोशिकाओं को 96-वेल वी-आकार-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ धोएं और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेल व्यवहार्यता डाई (50-100 μL / वेल) के साथ दाग दें।
    2. कोशिकाओं को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। बर्फ पर30 मिनट (50-100 μL / कुएं) के लिए FACS बफर (पीबीएस में 1% FBS और 0.05% NaN 3) में मिश्रित एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका में विस्तृत कमजोर पड़ने) के साथ सतह मार्करों को दाग दें।
    3. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और उन्हें दो बार एफएसीएस बफर के साथ धोएं।
    4. कोशिकाओं को बर्फ पर 35 मिनट के लिए सेल फिक्सेशन बफर (50-100 μL / वेल) के साथ ठीक करें। कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और उन्हें FACS बफर के साथ दो बार धोएं।
    5. नमूने को एफएसीएस बफर (150-200 μL / ट्यूब) में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और प्रकाश से बचाएं। प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने प्राप्त करें। डीसी और टी कोशिकाओं की आबादी के लिए, चित्रा 2 बी और चित्रा 3 ए में प्रदान की गई गेटिंग रणनीतियों का पालन करें।
      नोट: माइलॉयड डीसी के धुंधला होने के लिए, सतह एंटीबॉडी इनक्यूबेशन (चरण 5.1.2) से पहले बर्फ पर 15 मिनट के लिए एफसी-ब्लॉकर (चूहा एंटी-माउस सीडी 16 / सीडी 32) की सिफारिश की जाती है।
  2. विवो पुन: उत्तेजना पर साइटोकिन विश्लेषण
    1. कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम में प्लेट करें (आरपीएमआई -1640 को 10% एफबीएस, 10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.2-7.6, 0.1 एमएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 100 यू / एमएल प्रत्येक पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 एसएम 2-मर्कैप्टोएथेनॉल, और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक) और 50 एनजी / एमएल पीएमए प्लस 1 एम एम आयनमाइसिन के साथ उत्तेजितकरें।
    2. चरण 5.1 में ऊपर वर्णित सतह मार्करों के लिए सतह धुंधला करें।
    3. परमेबिलाइजेशन समाधान (50-100 μL / वेल) जोड़ें और इंट्रासेल्युलर धुंधला होने के लिए RT पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को साइटोकिन्स या परमाणु प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ परमेबिलाइजेशन समाधान (50-100 μL / वेल) में बर्फ पर 60 मिनट के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और उन्हें दो बार एफएसीएस बफर के साथ धोएं। नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और प्रकाश से बचाएं। प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने प्राप्त करें।
      नोट: इष्टतम धुंधलापन पूरा करने के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को आवश्यकतानुसार समायोजित करना पड़ सकता है।

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Representative Results

प्रत्यारोपित बी 16-एफ 10 कोशिकाओं का एक दृश्यमान काला बिंदु आमतौर पर ट्यूमर प्रत्यारोपण के 3 दिन बाद त्वचा की सतह पर देखा जाता है। ट्यूमर नोड्यूल के ≥2 मिमी के आकार तक पहुंचने के 3, 6 और 9 दिन बाद ट्यूमर वैक्सीन के साथ चूहों का इलाज किया जाता है। हमने ट्यूमर प्रत्यारोपण के 2 सप्ताह बाद टीकाकरण वाले चूहों समूह में ट्यूमर के विकास में महत्वपूर्ण कमी देखी (चित्रा 1)। प्रयोग के अंत में, हमने इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग किया और उनकी संख्या और सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया, साथ ही ऊपर वर्णित इन विट्रो उत्तेजना के बाद साइटोकिन उत्पादन भी किया। ल्यूकोसाइट्स परत से एकत्र की गई कोशिकाओं में अभी भी कई ट्यूमर कोशिकाएं होती हैं, जिससे लिम्फोसाइट आबादी को आसानी से परिभाषित करना कुछ मुश्किल हो जाता है। इसलिए, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (चित्रा 2 ए) में इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय के उचित गेटिंग के लिए समानांतर स्प्लेनोसाइट्स का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यहां, मुआवजा मैट्रिक्स (तालिका 1 और तालिका 2) के साथ सीडी 103 + सीडी 11 सी + डीसी, सीडी 8 + , सीडी 4 + और ट्रेग की गेटिंग रणनीतियों को दिखाया गया है (चित्रा 2 बी और चित्रा 3 ए)। अधिग्रहित गणना और प्रत्येक जनसंख्या की आवृत्ति का प्रतिनिधि डेटा भी चित्रा 2 सी और चित्रा 3 बी में प्रदान किया गया है।

इंट्राट्यूमरल सीडी 103 + सीडी 11 सी + डीसी, जो सबसे शक्तिशाली ट्यूमर एंटीजन-प्रोसेसिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं और टीका लगाए गए चूहों से 9,10 कोशिकाओं को प्रस्तुत करते हैं, ने कोस्टिमुलेटरी लिगैंड सीडी 86 (चित्रा 4) की काफी ऊंची अभिव्यक्ति प्रदर्शित की। टीका लगाए गए चूहों ने ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8 + और सीडी 4 + फॉक्सपी 3 − टी कोशिकाओं (चित्रा 5 ए) के साथ-साथ सीडी 8 + जीजेडएमबी + और आईएफएन -γ + सीटीएल (चित्रा 5 बी) में भी वृद्धि प्रदर्शित की। इन परिणामों से पता चलता है कि यह ट्यूमर टीकाकरण डीसी परिपक्वता को बढ़ावा देता है और मजबूत एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा को प्रेरित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एफएलटी 3 एल-व्यक्त बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग करके सेल-आधारित ट्यूमर वैक्सीन के चिकित्सीय मॉडल में ट्यूमर के विकास का विश्लेषण। मादा C57BL/6 चूहों को B16-F10 कोशिकाओं (5 x 105) के साथ प्रत्यारोपित किया गया था और उसी फ्लैंक पर एक आसन्न साइट में विकिरणित (150 GY) B16-Flt3L कोशिकाओं (1 x 106) के साथ इंजेक्ट किया गया था। तीर के निशान टीकाकरण के समय बिंदुओं को इंगित करते हैं। चार प्रयोगों के संचयी डेटा दिखाए गए हैं (नियंत्रण, एन = 12; B16-Flt3L, n = 10)। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। बोनफेरोनी पोस्ट-टेस्ट के साथ एनोवा परीक्षण को दो-तरफा दोहराए गए उपायों द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। * पी < 0.05; पी < 0.001. इस आंकड़े को11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लिम्फोसाइटों और सीडी 103 + सीडी 11 सी + डीसी की गेटिंग रणनीतियां। (ए) तिल्ली और ट्यूमर के नमूनों में लिम्फोसाइटों की गेटिंग रणनीतियां। (बी) ट्यूमर के नमूने में इंट्राट्यूमरल सीडी 103 + सीडी 11 सी + डीसी की गेटिंग रणनीतियां। (सी) एक प्रतिनिधि बिना टीकाकरण वाले नियंत्रण माउस से प्रत्येक आबादी की अधिग्रहित गणना और आवृत्ति दिखाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीडी 8 +, सीडी 4 +, और ट्रेग की गेटिंग रणनीतियां। (ए) ट्यूमर के नमूने में टी कोशिकाओं की गेटिंग रणनीतियां। (बी) एक प्रतिनिधि बिना टीकाकरण वाले नियंत्रण माउस से प्रत्येक आबादी की अधिग्रहित गणना और आवृत्ति दिखाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सीडी 103 + इंट्राट्यूमरल डीसी पर सीडी 86 सतह अभिव्यक्ति। अभिव्यक्ति को नियंत्रण समूह (= 1) में औसत एमएफआई के लिए सामान्यीकृत औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) के रूप में रिपोर्ट किया गया है। नियंत्रण, एन = 8; B16-Flt3L, n = 10. डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। ** पी < 0.01. इस आंकड़े को11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: नियंत्रण और टीकाकरण चूहों में इंट्राट्यूमरल टी कोशिकाओं का विश्लेषण। (ए) ट्यूमर ऊतक के प्रति ग्राम सीडी 8 + (बाएं) और गैर-ट्रेग सीडी 4 + (दाएं) में घुसपैठ करने वाले ट्यूमर की गणना। (बी) इंट्राट्यूमरल जीजेडएमबी + (बाएं) और आईएफएन + (दाएं) सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गणना। नियंत्रण, एन = 11; B16-Flt3L, n = 10. डेटा को एसईएम के औसत ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। * पी < 0.05; ** पी < 0.01. इस आंकड़े को11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: चित्रा 2 का मुआवजा मैट्रिक्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एलिसन के समूह द्वारा अध्ययन पर आधारित है। उन्होंने दिखाया कि सीटीएलए -4 नाकाबंदी के साथ बी 16-एफएलटी 3 एल वैक्सीन के संयोजन ने जीवित रहने की दर और ट्यूमर के विकास पर एक सहक्रियात्मक प्रभाव दिखाया, जबकि बी 16-एफएलटी 3 एल वैक्सीन या एंटी-सीटीएलए -4 एंटीबॉडी उपचार प्राप्त करने वालेचूहों में ट्यूमर के विकास में कोई कमी नहीं देखी गई। हाल के अध्ययनों से एक नया ट्रेग-आंतरिक सीटीएलए 4-पीकेसी सिग्नलिंग मार्ग सामने आया है जो ट्रेग11 की संपर्क-निर्भर दमनकारी गतिविधि को विनियमित करने में महत्वपूर्ण अनिवार्य भूमिका निभाता है। अकेले बी 16-एफएलटी 3 एल वैक्सीन उपचार या ट्रेग-विशिष्ट पीकेसी विलोपन के साथ वैक्सीन संयोजन दोनों ने ट्यूमर के विकास को काफी कम कर दिया जब एलीसन के अध्ययन (1 x 10 4) कोशिकाओं की तुलना में बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं की उच्च संख्या (0.5-5 x 105) प्रत्यारोपित की गई थी। मेलेनोमा कोशिकाओं या चूहों के स्रोत में सूक्ष्म अंतर इस अंतर के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। इसलिए, प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या को कम करने की सिफारिश की जाती है। प्राथमिक ट्यूमर में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की बढ़ी हुई घुसपैठ पिछले अध्ययन7 में इसी तरह देखी गई थी। इसके अलावा, हमने इंट्राट्यूमरल सीडी 103 + सीडी 11 सी + डीसी पर सीडी 86 अभिव्यक्ति में वृद्धि देखी, जो संभवतः सीडी 8 + सीटीएल में ट्यूमर घुसपैठ के मजबूत सक्रियण और विस्तार के लिए जिम्मेदार है।

यह प्रोटोकॉल, एफएलटी 3 एल व्यक्त करने वाले सेल-आधारित ट्यूमर वैक्सीन का उपयोग करके, उपयोग करने के लिए सुविधाजनक और सीधा है, और डीसी सहित इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय मॉडल के रूप में कार्य करता है। उदाहरण के लिए, ट्रेग की संपर्क-निर्भर दमनकारी गतिविधि के लिए पीकेसी सिग्नलिंग की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, Prkch−/− ट्रेग ने एक ट्रेग-डीसी इन विट्रो कोकल्चर सिस्टम में एपीसी के साथ उच्च संयुग्मन दक्षता प्रदर्शित की, जो संपर्क तोड़ने और संलग्न डीसी12 से अलग होने के लिए Prkch−/− ट्रेग की क्षमता में दोष का संकेत देता है। बी 16-एफएलटी 3 एल टीकाकरण संभवतः अधिक परिपक्व डीसी की भर्ती करता है जो ट्यूमर-विशिष्ट एंटीजन को अधिक कुशलता से प्रस्तुत करते हैं और इस प्रकार, यह लाइव सेल इमेजिंग द्वारा ट्यूमर-घुसपैठ ट्रेग और डीसी के बीच बातचीत के अवलोकन की सुविधा प्रदान करने की संभावना है।

प्राथमिक ट्यूमर और ट्यूमर वैक्सीन के बीच पर्याप्त दूरी रखना इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण विशेषता है। प्राथमिक ट्यूमर के विकास के लिए जगह देने और दो ट्यूमर प्रत्यारोपण के बीच संभावित संलयन से बचने के लिए यह शारीरिक पृथक्करण महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, ट्यूमर वैक्सीन को प्राथमिक ट्यूमर के सापेक्ष विपरीत फ्लैंक में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, क्योंकि यह ट्यूमर के विकास को रोकने के लिए भीबताया गया था। अध्ययन की एक सीमा बी 16-एफएलटी 3 एल सेल लाइन के वाणिज्यिक स्रोत की कमी है, लेकिन एक ही अवधारणा को अन्य ट्यूमर प्रकारों पर लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, टीआरएमपी-सी 2 प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा7।

यद्यपि यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक ट्यूमर मॉडल के रूप में बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग करता है, अंतर्निहित सिद्धांतों को अन्य ठोस ट्यूमर के लिए इम्यूनोथेरेप्यूटिक मॉडल स्थापित करने के लिए आवश्यक रूप से अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले टीकाकरण प्रोटोकॉल को अन्य चिकित्सीय तौर-तरीकों के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है, जैसे, सीटीएलए -4- या पीडी -1- आधारित चेकपॉइंट नाकाबंदी, ताकि योजक या सहक्रियात्मक प्रभाव प्राप्त किया जा सके जो संभावित रूप से अधिक शक्तिशाली एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा और अस्तित्व में वृद्धि कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट समर्थन के लिए बी 16-एफएलटी 3 एल कोशिकाओं और एलजेआई पशु और प्रवाह साइटोमेट्री सुविधाओं के कर्मचारियों को प्रदान करने के लिए डॉ स्टीफन स्कोनबर्गर को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA  Gibco 25200-056
10% heat-inactivated FBS Omega Scientific FB-02  Lot# 209018
30G needle BD Biosciences 305106
96 well V-shape-bottom plate SARSTEDT 83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI  Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines ATCC CRL-6475
Centrifuge 5810R Eppendorf
Cytofix fixation buffer  BD Biosciences BDB554655 Cell fixation buffer (4.2% PFA) 
Cytofix/Cytoperm kit  BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I Sigma 11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)  Corning 10013CV
Electronic digital caliper Fisherbrand 14-648-17
FlowJo software  Tree Star Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor) BD Biosciences 554724 1:1500 dilution
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Ionomycin Sigma I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) Thermo Fisher 12440053
LSR-II cytometers  BD Biosciences Flow cytometer
MEM nonessential amino acids Gibco 11140-050
penicillin and streptomycin  Gibco 15140-122
Percoll  GE Healthcare Life Sciences GE17-0891-02 density gradient specific medium
PMA Sigma P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid Sigma R7757-100ML
RPMI 1640 medium Corning 10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator Rad Source Technologies
sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sterile cell strainer 40 μm Fisherbrand 22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm Fisherbrand 22-363-548
TL Liberase Roche 477530
Zombie Aqua fixable viability kit BioLegend 423101
Antibodies
Anti-mCD45 BioLegend 103135 Clone: 30-F11
Fluorophore: BV570
Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε BioLegend 100327 Clone: 145-2C11
Fluorophore: PerCP-Cy5.5
Dilution: 1:200
Anti-mCD8 BioLegend 100730
100724		 Clone: 53-6.7
Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647
Dilution: 1:200
Anti-mCD4 BioLegend 100414 Clone: GK1.5
Fluorophore: APC-Cy7
Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3 Thermo Fisher Scientific 11577382 Clone: FJK-16s
Fluorophore: FITC
Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB BioLegend 372208 Clone: QA16A02
Fluorophore: PE
Dilution: 1:100
Anti-mIFNg BioLegend 505826 Clone: XMG1.2
Fluorophore: PE-Cy7
Dilution: 1:100
Anti-mCD19 BioLegend 115543 Clone: 6D5
Fluorophore: BV785
Dilution: 1:100
Anti-mGr1 BioLegend 108423 Clone: RB6-8C5
Fluorophore: APC/Cy7
Dilution: 1:200
Anti-mCD11b BioLegend 101223 Clone: M1/70
Fluorophore: Pacific blue
Dilution: 1:100
Anti-mF4/80 BioLegend 123114 Clone: BM8
Fluorophore: PECy7
Dilution: 1:100
Anti-mCD11c BioLegend 117328 Clone: N418
Fluorophore: PerCP Cy5.5
Dilution: 1:100
Anti-mMHCII BioLegend 107622 Clone: M5/114.15.2
Fluorophore: AF700
Dilution: 1:400
Anti-mCD103 BioLegend 121410 Clone: 2E7
Fluorophore: Alexa Fluor 647
Dilution: 1:200
Anti-mCD86 BioLegend 105007 Clone: GL-1
Fluorophore: PE
Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) BD Biosciences 553141 Clone: 2.4G2
Dilution: 1:200

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References

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  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
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Liu, H. Y., Altman, A., Canonigo-Balancio, A. J., Croft, M. Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine. J. Vis. Exp. (192), e64082, doi:10.3791/64082 (2023).

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