Summary
该协议提出了一种癌症免疫治疗模型，使用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤进行基于细胞的肿瘤疫苗接种。该协议演示了程序，包括培养的肿瘤细胞的制备，肿瘤植入，细胞照射，肿瘤生长的测量，肿瘤内免疫细胞的分离和流式细胞术分析。
Abstract
Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）是一种造血细胞因子，可促进树突状细胞（DC）的存活和分化。它已被用于肿瘤疫苗中，以激活先天免疫并增强抗肿瘤反应。该协议展示了使用基于细胞的肿瘤疫苗的治疗模型，该疫苗由表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞以及肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的表型和功能分析组成。描述了培养的肿瘤细胞制备、肿瘤植入、细胞照射、肿瘤大小测量、肿瘤内免疫细胞分离和流式细胞术分析的程序。该方案的总体目标是提供一个临床前实体瘤免疫治疗模型，以及一个研究肿瘤细胞与浸润免疫细胞之间关系的研究平台。这里描述的免疫治疗方案可以与其他治疗方式相结合，例如免疫检查点阻断（抗CTLA-4，抗PD-1，抗PD-L1抗体）或化疗，以提高黑色素瘤的癌症治疗效果。
Introduction
癌症免疫疗法因其毒性副作用较小和反应更持久而被认为是一种有前途的治疗策略。已经开发了几种类型的免疫疗法，包括溶瘤病毒疗法、癌症疫苗、细胞因子疗法、单克隆抗体、过继细胞转移（CAR-T 细胞或 CAR-NK）和免疫检查点阻断1。
对于癌症疫苗，有不同形式的治疗性疫苗，例如基于全细胞的疫苗，蛋白质或肽疫苗以及RNA或DNA疫苗。疫苗接种依赖于抗原呈递细胞（APC）处理肿瘤抗原（包括肿瘤特异性抗原）并将其以免疫原性形式呈递给T细胞的能力。树突状细胞（DC）已知是最有效的APC，被认为在抗肿瘤免疫中起重要作用2，3。这些细胞吸收并处理肿瘤抗原，然后迁移到引流淋巴结（dLN），通过T细胞受体（TCR）和共刺激分子的参与来启动和激活肿瘤特异性T效应（Teff）细胞。这导致肿瘤特异性细胞毒性T细胞（CTL）的分化和扩增，CTL浸润肿瘤并杀死肿瘤细胞4。因此，DC的活化和成熟代表了刺激肿瘤抗原免疫的有吸引力的策略。
已知 Flt3L 可促进表达 MHC II 类、CD11c、DEC205 和 CD86 蛋白的功能成熟 DC 的成熟和扩增5。肿瘤内而非静脉内给药含有 Flt3L 基因 （Adv-Flt3L） 的腺病毒载体已被证明可促进针对口位肿瘤的免疫治疗活性6。Flt3L还被用于基于肿瘤细胞的疫苗，该疫苗由稳定表达逆转录病毒转导的Flt3L的辐照B16-F10细胞组成，作为增强DC对肿瘤抗原交叉呈递的一种方式，从而增加抗肿瘤反应。这里描述的B16-Flt3L肿瘤疫苗接种方案基于James Allison博士的第7组发表的一项研究。在本文中，他们报告说，B16-Flt3L疫苗与CTLA-4阻断相结合，协同诱导对已建立的黑色素瘤的排斥反应，从而提高生存率。
该协议的目标是为黑色素瘤提供临床前免疫治疗模型。这里描述了如何制备和植入肿瘤疫苗的详细程序，以及如何分析实体瘤肿瘤内免疫细胞的组成和功能。
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Protocol
研究中使用的所有小鼠均在受控温度和湿度的特定无病原体条件下维持并饲养在拉霍亚免疫学研究所（LJI）的动物饲养室中。根据LJI动物护理委员会批准的指南和方案，对8-14周龄的雌性C57BL / 6小鼠进行动物实验。
1.培养的肿瘤细胞植入用的制备
- 在含有 10% 热灭活 FBS、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1 mM MEM 非必需氨基酸以及青霉素和链霉素各 100 U/mL 的 Ico 改良 Dulbecco 培养基 （IMDM） 中培养 B16-F10 黑色素瘤细胞。将细胞系保持在37°C的5%CO2下。
- 在175T烧瓶中接种1.5-2 x 106 B16-F10细胞并培养2天。当细胞汇合75%-80%时收获细胞。
- 取出培养基并用PBS洗涤烧瓶一次。吸出PBS并加入5mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，然后用力敲击培养瓶的边缘。
- 加入 15 mL 培养基以中和胰蛋白酶-EDTA，并将烧瓶的内容物倒入 50 mL 离心管中。用 10 mL PBS 清洗培养皿表面，然后倒入同一个 50 mL 管中。
- 将细胞以200 x g 离心5分钟。弃去上清液，用手指敲击管底部破碎细胞沉淀。
- 加入冷的 10 mL PBS 并轻轻移液细胞悬液;然后，使用血细胞计数器手动计数细胞。注射前将细胞放在冰上。
2.肿瘤植入
- 在通风橱中以每分钟1.0L的气体流速用5%异氟醚气体麻醉小鼠。一旦小鼠完全麻醉，将流速更改为2%异氟醚的维持剂量。对于该方案，麻醉由兽医按照机构动物护理和使用指南进行。
- 剃掉小鼠左胁的毛发，并使用酒精湿巾对注射部位进行消毒。使用30G针头在左胁的50μL冷PBS中以5 x 10 5细胞皮内（i.d.）植入B16-F10肿瘤细胞。
注意：植入的B16-F10肿瘤细胞的剂量可能需要在0.5-5 x 105 细胞的范围内进行调整，以成功发展肿瘤。 - 植入后，使用电子数字卡尺每周测量肿瘤长度和宽度三次。使用以下公式计算肿瘤体积（mm3）：
肿瘤体积（mm3）=宽度2 ×长度×0.5
当肿瘤达到≥2毫米大小时，用肿瘤疫苗治疗小鼠。
注意：肿瘤通常可以在植入5 x 105肿瘤细胞后的第3天测量。在雄性C57BL / 6，Rag1-/-或Rag2-/-γc-/-小鼠中观察到更快的B16-F10肿瘤生长速率。 其他研究8也描述了类似的观察结果。建议保持小鼠的性别一致。但是，请注意，NIH强调性别是生物医学研究中的重要生物变量。
3. 表达Flt3L的B16-F10（B16-Flt3L）细胞的疫苗制备和注射
- 将B16-Flt3L细胞维持在含有8%热灭活FBS，2mM谷氨酰胺和青霉素和链霉素各100U / mL的DMEM中，在37°C和5%CO2下。
- 在175T烧瓶中接种1 x 106 B16-Flt3L细胞并培养2天。如步骤 1.3 至 1.6 中所述，当细胞融合 75%-80% 时收获细胞，并悬浮在 1 mL 冷 PBS 中。
- 使用具有 150 kV 和 25 mA 参数设置的 X 射线辐照器以 160 Gy 剂量的伽马射线照射细胞。注射前通过台盼蓝染色计数并检查细胞活力。
- 如前所述对小鼠进行气体麻醉，并使用酒精湿巾对注射部位进行消毒。在初始细胞植入后的第3、6和9天，在距离原发肿瘤部位~1cm的50μL冷PBS中皮内注射1 x 106 个辐照的B16-Flt3L细胞。
- 用彩色笔标记疫苗注射部位，以将其与原发肿瘤区分开来。
注意：如果最初植入0.5 x 105 B16-F10细胞，建议在第8天，第11天和第14天进行疫苗治疗。
4.瘤内免疫细胞分离
- 在实验结束时（肿瘤植入后第15天;图1）。
- 用每只小鼠的皮肤手术切除肿瘤，并将其放入具有1mL 10%FBS / RPMI-1640培养基的24孔板中。在称重之前用纸巾擦干肿瘤。
- 将肿瘤切成小块。在RPMI-1640培养基中加入2mL消化缓冲液（100μg/ mLTL自由酶和200μg/ mL脱氧核糖核酸酶I），并在37°C下孵育25分钟。
- 加入 10 mL 的 10% FBS/RPMI-1640 培养基以停止消化。使用25 mL血清移液管转移细胞，并使用1 mL注射器的柱塞在40 μm细胞过滤器上研磨组织。
- 在4°C下以500× g 离心细胞5分钟。 将沉淀重悬于PBS中5mL的40%密度梯度特定培养基中，稀释至1x浓度）。
- 将细胞悬液缓慢加入 5 mL 含有 PBS 的 80% 密度梯度特异性培养基上。在室温（RT）下以低制动设置以325 x g 离心细胞23分钟。
- 离心后，小心地收集40%和80%密度梯度特异性培养基之间界面处的白细胞层，并将其通过40μm细胞过滤器。在4°C下以500× g 离心细胞5分钟。
- 将沉淀在 2 mL 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液中在室温下孵育 5 分钟。孵育后，加入 10 mL 10% FBS/RPMI-1640 培养基以淬灭红细胞裂解缓冲液。
- 在4°C下以500× g 离心细胞5分钟。 将细胞重悬于0.5 mL的10%FBS / RPMI-1640培养基中，并在使用前计数细胞总数以进行进一步分析。
注意：收集脾脏或dLN作为通过流式细胞术分析免疫细胞亚群门控策略的对照。按照上述细胞分离方法进行以下更改：使用 1 mL 注射器的柱塞在 70 μm 网状过滤器上研磨组织。用10%FBS / RPMI-1640培养基洗涤组织以获得单细胞悬浮液。按说明裂解红细胞。
5. 流式细胞术分析
注意：从白细胞层收集的细胞含有免疫细胞和肿瘤细胞。建议使用两个独立的染色小组。
- 表面染色
- 将细胞转移到96孔V形底板中。用PBS洗涤细胞，并在室温下用细胞活力染料（50-100μL/孔）染色15分钟。
- 在4°C下以500×g离心细胞5分钟。 在FACS缓冲液（1%FBS和PBS中0.05%NaN3）中用混合抗体（详细稀释度在材料表中提供）染色表面标志物30分钟（50-100μL /孔）。
- 将细胞以500× g 离心5分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。
- 用细胞固定缓冲液（50-100μL /孔）在冰上固定细胞35分钟。将细胞以500× g 离心5分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。
- 将样品储存在4°C的FACS缓冲液（150-200μL/管）中并避光。在流式细胞仪上采集样品。对于DC和T细胞群，遵循图2B和图3A中提供的门控策略。
注意：对于骨髓DC的染色，建议在表面抗体孵育（步骤5.1.2）之前在冰上孵育FC阻滞剂（大鼠抗小鼠CD16 / CD32）15分钟。
- 离体再刺激时的细胞因子分析
- 将细胞铺在完全培养基中（RPMI-1640补充有10%FBS，10mM HEPES，pH 7.2-7.6，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，青霉素和链霉素各100U / mL，50μM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺），并在蛋白质转运抑制剂存在下用50ng / mL的PMA加1μM离霉素刺激4小时在37°C下在5%CO2下。
- 按照上述步骤5.1中所述对表面标记物进行表面染色。
- 加入透化溶液（50-100μL/孔），并在室温下孵育5分钟以进行细胞内染色。将细胞与细胞因子或核蛋白特异性抗体在透化溶液（50-100μL /孔）中在冰上孵育60分钟或在4°C下过夜。
- 将细胞以500× g 离心5分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。将样品储存在4°C并避光。在流式细胞仪上采集样品。
注意：可能需要根据需要调整抗体稀释度以实现最佳染色。
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Representative Results
植入的B16-F10细胞的可见黑点通常在肿瘤植入后~3天在皮肤表面观察到。在肿瘤结节达到≥2mm大小后3，6和9天用肿瘤疫苗治疗小鼠。我们观察到接种疫苗的小鼠组在肿瘤植入后~2周的肿瘤生长显着减少（图1）。在实验结束时，我们分离了肿瘤内免疫细胞，并分析了它们的数量和细胞表面标志物表达，以及如上所述的短暂体外刺激后的细胞因子产生。从白细胞层收集的细胞仍然含有许多肿瘤细胞，这使得很容易定义淋巴细胞群变得有些困难。因此，建议在流式细胞术分析中平行使用脾细胞对肿瘤内免疫细胞亚群进行适当的设门（图2A）。图中显示了CD103 + CD11c + DC，CD8 +，CD4 +和Treg的门控策略（图2B和图3A）以及补偿矩阵（表1和表2）。图2C和图3B还提供了每个群体的采集计数和频率的代表性数据。
来自接种疫苗的小鼠的肿瘤内CD103 + CD11c + DCs代表了最有效的肿瘤抗原加工和呈递细胞9，10，显示出共刺激配体CD86的表达显着升高（图4）。接种疫苗的小鼠还显示肿瘤浸润CD8 +和CD4 + Foxp3 - T细胞增加（图5A），以及CD8 + GzmB +和IFN-γ + CTL（图5B）。这些结果表明，这种肿瘤疫苗接种促进了DC成熟并诱导更强的抗肿瘤免疫力。
图 1：使用表达 Flt3L 的 B16-F10 黑色素瘤细胞的基于细胞的肿瘤疫苗治疗模型中的肿瘤生长分析。 将雌性C57BL / 6小鼠与B16-F10细胞（5 x 105）内嵌，并在同一侧翼的相邻部位注射辐照（150 Gy）B16-Flt3L细胞（1 x 106）。箭头表示疫苗接种的时间点。显示了四个实验的累积数据（对照，n = 12;B16-Flt3L， n = 10）。数据以平均值表示± SEM。 通过双向重复测量进行统计分析 方差分析检验与邦弗朗尼后检验。*P < 0.05;P < 0.001。这一数字已从11修改而来。 请点击此处查看此图的大图。
图2：淋巴细胞和CD103 + CD11c + DC的门控策略。 （A）脾脏和肿瘤样本中淋巴细胞的门控策略。（B）肿瘤样本中肿瘤内CD103 + CD11c + DC的门控策略。（C）显示从代表性的未接种疫苗的对照小鼠获得的每个群体的计数和频率。请点击此处查看此图的大图。
图 3：CD8+、CD4+ 和 Treg 的设门策略。 （A）肿瘤样本中T细胞的门控策略。（B）显示从代表性的未接种疫苗的对照小鼠获得的每个群体的计数和频率。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：CD103+ 肿瘤内 DC 上的 CD86 表面表达。 表达报告为对照组中的中位荧光强度（MFI）归一化为平均MFI（= 1）。控制，n = 8;B16-Flt3L， n = 10.数据表示为SEM±平均值。 通过未配对学生 t 检验进行统计分析。**P < 0.01。这一数字已从11修改而来。 请点击此处查看此图的大图。
图5：对照组和接种疫苗小鼠的肿瘤内T细胞分析。 （A）每克肿瘤组织肿瘤浸润CD8+（左）和非Treg CD4+（右）的计数。（B）肿瘤内GzmB +（左）和IFNγ+（右）CD8 + T细胞的计数。控制，n = 11;B16-Flt3L， n = 10.数据表示为SEM±平均值。 通过未配对的学生 t 检验进行统计分析。*P < 0.05;**P < 0.01。这一数字已从11修改而来。请点击此处查看此图的大图。
表1：图2的补偿矩阵。请按此下载此表格。
表2：图3的补偿矩阵。请按此下载此表格。
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Discussion
这里描述的协议是基于Allison小组的研究。他们证明，B16-Flt3L疫苗与CTLA-4阻断的组合对存活率和肿瘤生长显示出协同作用，而在单独接受B16-Flt3L疫苗或抗CTLA-4抗体治疗的小鼠中没有观察到肿瘤生长减少7。最近的研究揭示了一种新型的Treg内在CTLA4-PKCη信号通路，该通路在调节Treg11的接触依赖性抑制活性中起着重要的强制性作用。单独使用B16-Flt3L疫苗治疗或具有Treg特异性PKCη缺失的疫苗组合在植入B16-F10黑色素瘤细胞数量（0.5-5 x 105）时均显着降低了肿瘤的生长。黑色素瘤细胞或小鼠来源的细微差异可能是造成这种差异的原因。因此，建议滴定植入的肿瘤细胞数量。在先前的研究7中同样观察到CD8 + T细胞在原发性肿瘤中的浸润增加。此外，我们观察到肿瘤内CD103 + CD11c + DC上的CD86表达增加，这可能是肿瘤浸润CD8 + CTL更强的激活和扩增的原因。
该协议使用表达Flt3L的基于细胞的肿瘤疫苗，使用方便且直接，可作为研究肿瘤内免疫细胞浸润（包括DC）的可靠模型。例如，PKCη信号是Treg的接触依赖性抑制活性所必需的。因此，Prkch−/− Treg 在 Treg -DC 体外共培养系统中与 APC 表现出更高的偶联效率，表明 Prkch−/− Treg 与附着的 DC 断开接触和脱离的能力存在缺陷12。B16-Flt3L疫苗接种可能会招募更成熟的DC，这些DC更有效地呈递肿瘤特异性抗原，因此，它可能有助于通过活细胞成像观察肿瘤浸润Treg和DC之间的相互作用。
在原发肿瘤和肿瘤疫苗之间保持足够的距离是该方案的一个重要特征。这种物理分离对于允许原发肿瘤的生长空间并避免两个肿瘤植入物之间的潜在融合至关重要。或者，肿瘤疫苗可以植入相对于原发肿瘤的对侧，因为据报道这也抑制肿瘤生长7。该研究的一个局限性是缺乏B16-Flt3L细胞系的商业来源，但相同的概念可以应用于其他肿瘤类型，例如TRAMP-C2前列腺腺癌7。
尽管此处描述的方案使用B16-F10黑色素瘤细胞作为肿瘤模型，但可以根据需要调整和修改其基本原则，以建立其他实体瘤的免疫治疗模型。此外，我们使用的疫苗接种方案可以很容易地与其他治疗方式相结合，例如，基于CTLA-4或PD-1的检查点阻断，以实现加性或协同效应，从而可能导致更有效的抗肿瘤免疫和增加生存率。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Stephen Schoenberger博士提供B16-Flt3L细胞，并感谢LJI动物和流式细胞术设施的工作人员提供出色的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
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