Summary
O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.
Abstract
O ligante tirosina quinase 3 semelhante ao Fms (Flt3L) é uma citocina hematopoiética que promove a sobrevivência e diferenciação de células dendríticas (DCs). Tem sido usado em vacinas tumorais para ativar a imunidade inata e melhorar as respostas antitumorais. Este protocolo demonstra um modelo terapêutico usando vacina tumoral baseada em células que consiste em células de melanoma B16-F10 expressando Flt3L, juntamente com análise fenotípica e funcional de células imunes no microambiente tumoral (TME). Procedimentos para preparação de células tumorais cultivadas, implantação de tumor, irradiação celular, medição do tamanho do tumor, isolamento intratumoral de células imunes e análise de citometria de fluxo são descritos. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um modelo pré-clínico de imunoterapia de tumores sólidos e uma plataforma de pesquisa para estudar a relação entre células tumorais e células imunes infiltrantes. O protocolo de imunoterapia aqui descrito pode ser combinado com outras modalidades terapêuticas, como bloqueio de checkpoint imunológico (anticorpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) ou quimioterapia, a fim de melhorar o efeito terapêutico do melanoma sobre o câncer.
Introduction
A imunoterapia contra o câncer tem sido reconhecida como uma estratégia terapêutica promissora com base em seus efeitos colaterais menos tóxicos e respostas mais duráveis. Vários tipos de imunoterapias foram desenvolvidos, incluindo terapias com vírus oncolíticos, vacinas contra o câncer, terapias com citocinas, anticorpos monoclonais, transferência de células adotivas (células CAR-T ou CAR-NK) e bloqueio de ponto de verificação imune1.
Para vacinas contra o câncer, existem diferentes formas de vacinas terapêuticas, como vacinas baseadas em células inteiras, vacinas de proteínas ou peptídeos e vacinas de RNA ou DNA. A vacinação baseia-se na capacidade das células apresentadoras de antígenos (APCs) de processar antígenos tumorais, incluindo antígenos específicos do tumor, e apresentá-los de forma imunogênica às células T. Sabe-se que as células dendríticas (DCs) são as APCs mais potentes e acredita-se que desempenhem um papel importante na imunidade antitumoral 2,3. Essas células absorvem e processam antígenos tumorais e, em seguida, migram para os gânglios linfáticos drenantes (dLN) para preparar e ativar células efetoras T específicas do tumor (Teff) através do envolvimento do receptor de células T (TCR) e moléculas costimulatórias. Isso resulta na diferenciação e expansão das células T citotóxicas específicas do tumor (CTL), que se infiltram no tumor e matam as células tumorais4. Consequentemente, a ativação e a maturação das DO representam estratégias atraentes para estimular a imunidade contra antígenos tumorais.
Sabe-se que o Flt3L promove a maturação e expansão de CDs funcionalmente maduras que expressam as proteínas MHC classe II, CD11c, DEC205 e CD865. A administração intratumoral, mas não intravenosa, de um vetor de adenovírus incorporando o gene Flt3L (Adv-Flt3L) demonstrou promover atividade imunoterapêutica contra tumores ortrotópicos6. O Flt3L também tem sido usado em vacinas baseadas em células tumorais que consistem em células B16-F10 irradiadas expressando de forma estável o Flt3L transduzido retroviralmente como forma de melhorar a apresentação cruzada de antígenos tumorais por CDs e, assim, aumentar as respostas antitumorais. O protocolo de vacinação contra o tumor B16-Flt3L descrito aqui é baseado em um estudo publicado pelo grupo7 do Dr. James Allison. Neste artigo, eles relataram que uma vacina B16-Flt3L combinada com o bloqueio CTLA-4 induziu sinergicamente a rejeição do melanoma estabelecido, resultando em aumento da sobrevida.
O objetivo deste protocolo é fornecer um modelo de imunoterapia pré-clínica para melanoma. Aqui, procedimentos detalhados de como preparar e implantar vacinas tumorais e como analisar a composição e a função das células imunes intratumorais do tumor sólido são descritos.
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Protocol
Todos os camundongos utilizados no estudo foram mantidos e alojados no biotério do Instituto de Imunologia de La Jolla (LJI) em condições específicas livres de patógenos com temperatura e umidade controladas. Experimentos em animais foram realizados com camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-14 semanas de idade de acordo com diretrizes e protocolos aprovados pelo LJI Animal Care Committee.
1. Preparação de células tumorais cultivadas para implantação
- Cultura de células de melanoma B16-F10 no meio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) contendo 10% de FBS inativado pelo calor, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 1 mM de aminoácidos não essenciais MEM e 100 U/mL de penicilina e estreptomicina. Manter a linhagem celular a 37 °C a 5% de CO2.
- Sementes 1,5-2 x 106 células B16-F10 em balão de 175T e cultura durante 2 dias. Colha as células quando elas são 75%-80% confluentes.
- Retire o meio de cultura e lave o balão uma vez com PBS. Aspirar PBS e adicionar 5 mL de tripsina-EDTA a 0,25%, seguido de bater duramente na borda do frasco de cultura.
- Adicionar 15 ml de meio de cultura para neutralizar o EDTA de tripsina e deitar o conteúdo do balão num tubo de centrífuga de 50 ml. Lave a superfície do prato com 10 mL de PBS e despeje no mesmo tubo de 50 mL.
- Centrifugar as células durante 5 min a 200 x g. Descarte o sobrenadante e quebre a pastilha celular batendo com o dedo no fundo do tubo.
- Adicionar frio 10 mL de PBS e pipetar suavemente a suspensão celular; em seguida, conte manualmente as células usando hemocitômetro. Mantenha as células no gelo antes da injeção.
2. Implantação do tumor
- O gás anestesia camundongos com isoflurano a 5% a uma taxa de fluxo de gás de 1,0 L por minuto no exaustor. Altere a taxa de fluxo para a dose de manutenção de isoflurano a 2%, uma vez que os ratos estejam totalmente anestesiados. Para este protocolo, a anestesia foi realizada pelo médico veterinário seguindo as diretrizes institucionais de cuidados e uso dos animais.
- Raspe o cabelo no flanco esquerdo dos ratos e esterilize o local da injeção usando lenços umedecidos com álcool. Implante intradérmico (i.d.) células tumorais B16-F10 em 5 x 105 células em 50 μL de PBS frio no flanco esquerdo usando uma agulha 30 G.
NOTA: A dose de células tumorais B16-F10 implantadas pode precisar ser ajustada na faixa de 0,5-5 x 105 células para o desenvolvimento bem-sucedido do tumor. - Após o implante, meça o comprimento e a largura do tumor três vezes por semana usando um paquímetro digital eletrônico. Calcule o volume do tumor (mm3) usando a fórmula:
Volume do tumor (mm3) = largura2 × comprimento × 0,5
Trate ratos com vacina contra tumores quando os tumores atingirem um tamanho de ≥2 mm.
NOTA: Os tumores geralmente podem ser medidos no dia 3 após a implantação de 5 x 105 células tumorais. Maior taxa de crescimento do tumor B16-F10 foi observada em camundongos machos C57BL/6, Rag1-/-, ou Rag2-/-γc-/-. Observação semelhante foi descrita em outros estudos8. Recomenda-se manter o gênero dos ratos consistente. No entanto, note que o NIH coloca ênfase no sexo como uma variável biológica importante na pesquisa biomédica.
3. Preparação e injeção da vacina de células B16-F10 (B16-Flt3L) que expressam Flt3L
- Manter as células B16-Flt3L em DMEM contendo 8% de FBS inativado pelo calor, 2 mM de glutamina e 100 U/mL cada de penicilina e estreptomicina a 37 °C sob 5% de CO2.
- Sementes 1 x 106 células B16-Flt3L num balão de 175T e cultura durante 2 dias. Colhem as células quando estiverem 75%-80% confluentes, conforme descrito nas etapas 1.3 a 1.6, e suspendam em 1 mL de PBS frio.
- Irradiar células na dose de 150 Gy de raios gama utilizando Irradiador de Raios X com parametrização de 160 kV e 25 mA. Conte e verifique a viabilidade celular por coloração azul de tripano antes da injeção.
- O gás anestesia os ratos conforme descrito anteriormente e esteriliza o local da injeção usando lenços umedecidos com álcool. Injetar intradermicamente os camundongos com 1 x 10 6 células B16-Flt3L irradiadas em 50 μL de PBS frio no mesmo flanco do implante tumoral original, ~1 cm de distância do local do tumor primário nos dias 3,6 e 9 após o implante celular inicial.
- Marque os locais de injeção da vacina com uma caneta colorida para distingui-la do tumor primário.
NOTA: Se 0,5 x 105 células B16-F10 forem inicialmente implantadas, recomenda-se realizar o tratamento vacinal nos dias 8, 11 e 14.
4. Isolamento intratumoral de células imunes
- Sacrificar camundongos usando CO2 e luxação cervical no exaustor no final do experimento (no dia 15 após o implante do tumor; Figura 1).
- Remova cirurgicamente o tumor com a pele de cada rato e coloque-o em placa de 24 poços com 1 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10%. Seque os tumores usando uma toalha de papel antes de pesá-lo.
- Corte os tumores em pequenos pedaços. Adicionar 2 mL de tampão de digestão (100 μg/mL TL Liberase e 200 μg/mL DNase I em meio RPMI-1640) e incubar por 25 min a 37 °C.
- Adicione 10 mL de 10% de meio FBS/RPMI-1640 para interromper a digestão. Transfira as células usando uma pipeta sorológica de 25 mL e use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer o tecido em um filtro celular de 40 μm.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender o pellet em 5 mL de meio específico de gradiente de densidade de 40% em PBS, diluído para concentração de 1x).
- Adicione a suspensão celular lentamente em cima de 5 mL de meio específico de gradiente de densidade de 80% contendo PBS. Centrifugar as células a 325 x g com travagem baixa durante 23 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Após a centrifugação, coletar cuidadosamente a camada de leucócitos na interface entre 40% e 80% de meio específico de gradiente de densidade e passá-la através de um filtro celular de 40 μm. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Incubar o pellet em 2 mL de tampão de lise de hemácias (hemácias) por 5 min no RT. Após a incubação, adicione 10 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10% para extinguir o tampão de lise RBC.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender as células em 0,5 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10% e contar o número total de células antes do uso para análise posterior.
NOTA: Coletar o baço ou dLN como controles para a estratégia de gating de subconjuntos de células imunes por análise de citometria de fluxo. Siga o método de isolamento celular descrito acima com as seguintes alterações: Use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer o tecido em um filtro de malha de 70 μm. Lave o tecido com 10% de meio FBS/RPMI-1640 para obter suspensões unicelulares. Lyse o RBC como descrito.
5. Análise da citometria de fluxo
NOTA: As células coletadas da camada de leucócitos contêm células imunes e células tumorais. Recomendam-se dois painéis de coloração independentes.
- Coloração de superfície
- Transfira as células para uma placa inferior em forma de V de 96 poços. Lave as células com PBS e manche-as com corante de viabilidade celular (50-100 μL/poço) por 15 min no RT.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Coloração dos marcadores de superfície com anticorpos mistos (diluição detalhada é fornecida na Tabela de Materiais) em tampão FACS (1% FBS e 0,05% NaN3 em PBS) por 30 min em gelo (50-100 μL / poço).
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 minutos e lavá-las com tampão FACS duas vezes.
- Fixe as células com tampão de fixação celular (50-100 μL / poço) por 35 min no gelo. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min e lavá-las duas vezes com tampão FACS.
- Armazenar as amostras em tampão FACS (150-200 μL/tubo) a 4 °C e proteger da luz. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo. Para a população de CDs e células T, siga as estratégias de gating fornecidas na Figura 2B e na Figura 3A.
NOTA: Para a coloração de CDs mielóides, recomenda-se a incubação do bloqueador FC (Rat anti-rato CD16/CD32) durante 15 minutos no gelo antes da incubação dos anticorpos de superfície (passo 5.1.2).
- Análise de citocinas na reestimulação ex vivo
- Chapear as células em meio completo (RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, HEPES 10 mM, pH 7,2-7,6, aminoácido não essencial 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, 100 U/mL cada penicilina e estreptomicina, 50 μM 2-mercaptoetanol e 2 mM L-glutamina) e estimular com 50 ng/mL de PMA mais 1 μM de ionomicina na presença de inibidor de transporte de proteínas por 4 h a 37 °C sob 5% de CO2.
- Efectuar a coloração da superfície para os marcadores de superfície, conforme descrito acima no passo 5.1.
- Adicionar a solução de permeabilização (50-100 μL/poço) e incubar por 5 min no RT para coloração intracelular. Incubar as células com anticorpos específicos para citocinas ou proteínas nucleares em solução de permeabilização (50-100 μL/poço) durante 60 min no gelo ou durante a noite a 4 °C.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 minutos e lavá-las com tampão FACS duas vezes. Conservar as amostras a 4 °C e proteger da luz. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo.
NOTA: A diluição de anticorpos pode ter que ser ajustada conforme necessário para realizar a coloração ideal.
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Representative Results
Um ponto preto visível das células B16-F10 implantadas é geralmente observado na superfície da pele ~ 3 dias após o implante do tumor. Os ratos são tratados com a vacina tumoral 3, 6 e 9 dias após o nódulo tumoral ter atingido um tamanho de ≥2 mm. Observamos uma redução significativa no crescimento tumoral no grupo de camundongos vacinados ~2 semanas após o implante do tumor (Figura 1). Ao final do experimento, isolamos as células imunes intratumorais e analisamos seu número e expressão de marcadores de superfície celular, bem como a produção de citocinas após uma curta estimulação in vitro, conforme descrito acima. As células coletadas da camada de leucócitos ainda contêm muitas células tumorais, tornando um pouco difícil definir prontamente a população de linfócitos. Portanto, recomenda-se o uso em esplenócitos paralelos para o tratamento adequado de subconjuntos de células imunes intratumorais na análise da citometria de fluxo (Figura 2A). Aqui, são mostradas estratégias de gating de CD103+CD11c+DC, CD8+, CD4+ e Treg (Figura 2B e Figura 3A) juntamente com a matriz de compensação (Tabela 1 e Tabela 2). Dados representativos das contagens adquiridas e frequência de cada população também são fornecidos na Figura 2C e na Figura 3B.
Os CD103+CD11c+CD11c+CDs intratumorais, que representam as células mais potentes de processamento e apresentação de antígenos tumorais 9,10, dos camundongos vacinados, apresentaram expressão significativamente elevada do ligante costimulatório CD86 (Figura 4). Os camundongos vacinados também apresentaram aumento nas células T CD8+ e CD4+Foxp3− infiltradoras de tumores (Figura 5A), bem como nas CTLs CD8+GzmB+ e IFN-γ+ (Figura 5B). Estes resultados sugerem que esta vacinação tumoral promove a maturação da DC e induz uma imunidade antitumoral mais forte.
Figura 1: Análise do crescimento tumoral em um modelo terapêutico de vacina tumoral baseada em células usando células de melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Camundongos fêmeas C57BL/6 foram implantados i.d. com células B16-F10 (5 x 105) e injetados com células B16-Flt3L irradiadas (150 Gy) (1 x 106) em um local adjacente no mesmo flanco. As pontas das setas indicam os pontos de tempo da vacinação. Dados cumulativos de quatro experimentos são mostrados (Controle, n = 12; B16-Flt3L, n = 10). Os dados são apresentados como a média ± MEV. Análise estatística por ANOVA de medidas repetidas bidirecionais com pós-teste de Bonferroni. *P < 0,05; P < 0,001. Este número foi modificado de11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégias de gating de linfócitos e CD103+CD11c+DCs. (A) Estratégias de gating de linfócitos em amostras de baço e tumor. (B) Estratégias de gating de CD103+CD11c+DCs intratumorais em amostra tumoral. (C) São mostradas as contagens adquiridas e a frequência de cada população de um rato de controlo representativo não vacinado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estratégias de bloqueio de CD8+, CD4+ e Treg. (A) Estratégias de gating de células T em amostra tumoral. (B) As contagens adquiridas e a frequência de cada população de um rato de controlo não vacinado representativo são mostradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão da superfície CD86 nas CDs intratumorais CD103+. A expressão é relatada como intensidade de fluorescência mediana (IFM) normalizada para a média da IFM no grupo controle (= 1). Controle, n = 8; B16-Flt3L, n = 10. Os dados são apresentados como a média ± MEV. Análise estatística pelo teste t de Student não pareado. **P < 0,01. Este número foi modificado de11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de células T intratumorais em camundongos controle e vacinados. (A) Enumeração de infiltração tumoral CD8+ (esquerda) e CD4+ não-Treg (direita) por grama de tecido tumoral. (B) Enumeração das células T CD8+ intratumorais GzmB+ (esquerda) e IFNγ+ (direita). Controle, n = 11; B16-Flt3L, n = 10. Os dados são apresentados como a média ± MEV. Análise estatística pelo teste t de Student não pareado. *P < 0,05; **P < 0,01. Este número foi modificado de11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Matriz de compensação da Figura 2. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Matriz de remuneração da Figura 3. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
O protocolo aqui descrito é baseado no estudo do grupo de Allison. Eles demonstraram que a combinação da vacina B16-Flt3L com o bloqueio CTLA-4 mostrou um efeito sinérgico na taxa de sobrevivência e no crescimento do tumor, enquanto nenhuma redução do crescimento tumoral foi observada em camundongos que receberam a vacina B16-Flt3L ou o tratamento com anticorpos anti-CTLA-4 isoladamente7. Estudos recentes revelaram uma nova via de sinalização CTLA4-PKCη intrínseca ao Treg que desempenha um importante papel obrigatório na regulação da atividade supressora dependente de contato do Treg11. Tanto o tratamento com a vacina B16-Flt3L isoladamente quanto a combinação da vacina com a deleção PKCη específica de Treg reduziram significativamente o crescimento do tumor quando um número maior (0,5-5 x 105) de células de melanoma B16-F10 do que no estudo de Allison (1 x 104) células foi implantado. Diferenças sutis na fonte de células de melanoma ou camundongos podem explicar essa diferença. Portanto, recomenda-se a titulação do número de células tumorais implantadas. O aumento da infiltração de células T CD8+ no tumor primário foi observado de forma semelhante no estudo anterior7. Além disso, observamos aumento da expressão de CD86 em CD103+CD11c+DCs intratumorais, o que provavelmente é responsável por uma ativação e expansão mais fortes de CTLs CD8+ infiltrantes tumorais.
Este protocolo, usando uma vacina tumoral baseada em células que expressa Flt3L, é conveniente e simples de usar, e serve como um modelo confiável para estudar infiltrados de células imunes intratumorais, incluindo CDs. Por exemplo, a sinalização PKCη é necessária para a atividade supressora dependente de contato de Treg. Assim, Prkch−/− Treg apresentou maior eficiência de conjugação com APCs em um sistema de cocultura in vitro Treg-DC, indicando um defeito na capacidade de Prkch−/− Treg de quebrar contato e desengatar de CDs anexadas12. A vacinação contra B16-Flt3L provavelmente recruta CDs mais maduras que apresentam antígenos específicos do tumor de forma mais eficiente e, portanto, é provável que facilite a observação da interação entre Treg infiltrante de tumores e DC por imagens de células vivas.
Manter uma distância suficiente entre o tumor primário e a vacina tumoral é uma característica importante deste protocolo. Esta separação física é fundamental para permitir espaço para o crescimento do tumor primário e evitar a fusão potencial entre os dois implantes tumorais. Alternativamente, a vacina tumoral pode ser implantada no flanco oposto em relação ao tumor primário, pois também foi relatado que isso também inibe o crescimento do tumor7. Uma limitação do estudo é a falta de uma fonte comercial de linhagem celular B16-Flt3L, mas o mesmo conceito pode ser aplicado a outros tipos de tumores, por exemplo, adenocarcinomas de próstata TRAMP-C27.
Embora o protocolo aqui descrito utilize células de melanoma B16-F10 como modelo tumoral, os princípios subjacentes podem ser adaptados e modificados conforme necessário para estabelecer modelos imunoterapêuticos para outros tumores sólidos. Além disso, o protocolo de vacinação que usamos pode ser prontamente combinado com outras modalidades terapêuticas, por exemplo, bloqueio de ponto de verificação baseado em CTLA-4 ou PD-1, a fim de alcançar efeitos aditivos ou sinérgicos que podem potencialmente resultar em imunidade antitumoral mais potente e aumento da sobrevida.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Stephen Schoenberger por fornecer células B16-Flt3L e à equipe das instalações de citometria de fluxo e animal LJI pelo excelente suporte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
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