Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.
Fms-achtige tyrosinekinase 3 ligand (Flt3L) is een hematopoëtisch cytokine dat de overleving en differentiatie van dendritische cellen (DC’s) bevordert. Het is gebruikt in tumorvaccins om aangeboren immuniteit te activeren en antitumorresponsen te verbeteren. Dit protocol demonstreert een therapeutisch model met behulp van een op cellen gebaseerd tumorvaccin bestaande uit Flt3L-tot expressie brengende B16-F10 melanoomcellen samen met fenotypische en functionele analyse van immuuncellen in de tumormicro-omgeving (TME). Procedures voor kweekcelvoorbereiding, tumorimplantatie, celbestraling, tumorgroottemeting, intratumorale immuuncelisolatie en flowcytometrieanalyse worden beschreven. Het algemene doel van dit protocol is om een preklinisch solide tumorimmunotherapiemodel te bieden en een onderzoeksplatform om de relatie tussen tumorcellen en infiltrerende immuuncellen te bestuderen. Het hier beschreven immunotherapieprotocol kan worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten, zoals immuuncheckpointblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1-antilichamen) of chemotherapie om het kankertherapeutische effect van melanoom te verbeteren.
Kankerimmunotherapie is erkend als een veelbelovende therapeutische strategie op basis van de minder toxische bijwerkingen en duurzamere reacties. Er zijn verschillende soorten immunotherapieën ontwikkeld, waaronder oncolytische virustherapieën, kankervaccins, cytokinetherapieën, monoklonale antilichamen, adoptieve celoverdracht (CAR-T-cellen of CAR-NK) en immuuncheckpointblokkade1.
Voor kankervaccins zijn er verschillende vormen van therapeutische vaccins, zoals vaccins op basis van hele cellen, eiwit- of peptidevaccins en RNA- of DNA-vaccins. Vaccinatie is afhankelijk van het vermogen van antigeen-presenterende cellen (APC’s) om tumorantigeen, waaronder tumorspecifieke antigenen, te verwerken en in een immunogene vorm aan T-cellen te presenteren. Van dendritische cellen (DC’s) is bekend dat ze de krachtigste APC’s zijn en worden verondersteld een belangrijke rol te spelen in de immuniteit van de antitumor 2,3. Deze cellen nemen tumorantigenen op en verwerken deze en migreren vervolgens naar de drainerende lymfeklieren (dLN) om tumorspecifieke T-effectorcellen (Teff) te primen en te activeren door betrokkenheid van de T-celreceptor (TCR) en costimulatorische moleculen. Dit resulteert in differentiatie en uitbreiding van tumorspecifieke cytotoxische T-cellen (CTL), die de tumor infiltreren en tumorcellen doden4. Bijgevolg vertegenwoordigen activering en rijping van DC’s aantrekkelijke strategieën om de immuniteit tegen tumorantigenen te stimuleren.
Van Flt3L is bekend dat het de rijping en uitbreiding bevordert van functioneel volwassen DC’s die MHC klasse II, CD11c, DEC205 en CD86 eiwitten tot expressie brengen5. Intratumorale, maar niet intraveneuze toediening van een adenovirusvector waarin het Flt3L-gen (Adv-Flt3L) is opgenomen, heeft aangetoond dat het immuuntherapeutische activiteit tegen ortrotopische tumoren bevordert6. Flt3L is ook gebruikt in op tumorcellen gebaseerde vaccins bestaande uit bestraalde B16-F10-cellen die stabiel retroviraal getransduceerde Flt3L tot expressie brengen als een manier om de kruispresentatie van tumorantigenen door DC’s te verbeteren en zo de antitumorresponsen te verhogen. Het protocol van B16-Flt3L tumorvaccinatie dat hier wordt beschreven, is gebaseerd op een studie gepubliceerd door Dr. James Allison’s groep7. In dit artikel meldden ze dat een B16-Flt3L-vaccin in combinatie met CTLA-4-blokkade synergetisch de afwijzing van vastgesteld melanoom veroorzaakte, wat resulteerde in een verhoogde overleving.
Het doel van dit protocol is om een preklinisch immunotherapiemodel voor melanoom te bieden. Hier worden gedetailleerde procedures beschreven voor het bereiden en implanteren van tumorvaccins en het analyseren van de samenstelling en functie van intratumorale immuuncellen van solide tumoren.
Het hier beschreven protocol is gebaseerd op de studie van allison’s groep. Ze toonden aan dat de combinatie van B16-Flt3L-vaccin met CTLA-4-blokkade een synergetisch effect had op de overlevingskans en tumorgroei, terwijl er geen vermindering van tumorgroei werd gezien bij muizen die alleen het B16-Flt3L-vaccin of anti-CTLA-4-antilichaambehandelingkregen 7. Recente studies hebben een nieuwe Treg-intrinsieke CTLA4-PKCη signaleringsroute onthuld die een belangrijke verplichte rol speelt bij het re…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Dr. Stephen Schoenberger voor het leveren van B16-Flt3L-cellen en het personeel van de LJI-dier- en flowcytometriefaciliteiten voor uitstekende ondersteuning.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
DNase I | Sigma | 11284932001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
PMA | Sigma | P1585 | |
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
TL Liberase | Roche | 477530 | |
Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
Antibodies | |||
Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |