Summary
Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.
Abstract
Fms-achtige tyrosinekinase 3 ligand (Flt3L) is een hematopoëtisch cytokine dat de overleving en differentiatie van dendritische cellen (DC's) bevordert. Het is gebruikt in tumorvaccins om aangeboren immuniteit te activeren en antitumorresponsen te verbeteren. Dit protocol demonstreert een therapeutisch model met behulp van een op cellen gebaseerd tumorvaccin bestaande uit Flt3L-tot expressie brengende B16-F10 melanoomcellen samen met fenotypische en functionele analyse van immuuncellen in de tumormicro-omgeving (TME). Procedures voor kweekcelvoorbereiding, tumorimplantatie, celbestraling, tumorgroottemeting, intratumorale immuuncelisolatie en flowcytometrieanalyse worden beschreven. Het algemene doel van dit protocol is om een preklinisch solide tumorimmunotherapiemodel te bieden en een onderzoeksplatform om de relatie tussen tumorcellen en infiltrerende immuuncellen te bestuderen. Het hier beschreven immunotherapieprotocol kan worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten, zoals immuuncheckpointblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1-antilichamen) of chemotherapie om het kankertherapeutische effect van melanoom te verbeteren.
Introduction
Kankerimmunotherapie is erkend als een veelbelovende therapeutische strategie op basis van de minder toxische bijwerkingen en duurzamere reacties. Er zijn verschillende soorten immunotherapieën ontwikkeld, waaronder oncolytische virustherapieën, kankervaccins, cytokinetherapieën, monoklonale antilichamen, adoptieve celoverdracht (CAR-T-cellen of CAR-NK) en immuuncheckpointblokkade1.
Voor kankervaccins zijn er verschillende vormen van therapeutische vaccins, zoals vaccins op basis van hele cellen, eiwit- of peptidevaccins en RNA- of DNA-vaccins. Vaccinatie is afhankelijk van het vermogen van antigeen-presenterende cellen (APC's) om tumorantigeen, waaronder tumorspecifieke antigenen, te verwerken en in een immunogene vorm aan T-cellen te presenteren. Van dendritische cellen (DC's) is bekend dat ze de krachtigste APC's zijn en worden verondersteld een belangrijke rol te spelen in de immuniteit van de antitumor 2,3. Deze cellen nemen tumorantigenen op en verwerken deze en migreren vervolgens naar de drainerende lymfeklieren (dLN) om tumorspecifieke T-effectorcellen (Teff) te primen en te activeren door betrokkenheid van de T-celreceptor (TCR) en costimulatorische moleculen. Dit resulteert in differentiatie en uitbreiding van tumorspecifieke cytotoxische T-cellen (CTL), die de tumor infiltreren en tumorcellen doden4. Bijgevolg vertegenwoordigen activering en rijping van DC's aantrekkelijke strategieën om de immuniteit tegen tumorantigenen te stimuleren.
Van Flt3L is bekend dat het de rijping en uitbreiding bevordert van functioneel volwassen DC's die MHC klasse II, CD11c, DEC205 en CD86 eiwitten tot expressie brengen5. Intratumorale, maar niet intraveneuze toediening van een adenovirusvector waarin het Flt3L-gen (Adv-Flt3L) is opgenomen, heeft aangetoond dat het immuuntherapeutische activiteit tegen ortrotopische tumoren bevordert6. Flt3L is ook gebruikt in op tumorcellen gebaseerde vaccins bestaande uit bestraalde B16-F10-cellen die stabiel retroviraal getransduceerde Flt3L tot expressie brengen als een manier om de kruispresentatie van tumorantigenen door DC's te verbeteren en zo de antitumorresponsen te verhogen. Het protocol van B16-Flt3L tumorvaccinatie dat hier wordt beschreven, is gebaseerd op een studie gepubliceerd door Dr. James Allison's groep7. In dit artikel meldden ze dat een B16-Flt3L-vaccin in combinatie met CTLA-4-blokkade synergetisch de afwijzing van vastgesteld melanoom veroorzaakte, wat resulteerde in een verhoogde overleving.
Het doel van dit protocol is om een preklinisch immunotherapiemodel voor melanoom te bieden. Hier worden gedetailleerde procedures beschreven voor het bereiden en implanteren van tumorvaccins en het analyseren van de samenstelling en functie van intratumorale immuuncellen van solide tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen die in de studie werden gebruikt, werden onderhouden en gehuisvest in het vivarium van het La Jolla Institute for Immunology (LJI) onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Dierproeven werden uitgevoerd met 8-14 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen volgens richtlijnen en protocollen goedgekeurd door de LJI Animal Care Committee.
1. Voorbereiding van gekweekte tumorcellen voor implantatie
- Kweek B16-F10 melanoomcellen in Iscove's Modified Dulbecco's medium (IMDM) met 10% warmte-geïnactiveerde FBS, 2 mM glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1 mM MEM niet-essentiële aminozuren en 100 U / ml elk van penicilline en streptomycine. Houd de cellijn op 37 °C onder 5% CO2.
- Zaai 1,5-2 x 106 B16-F10 cellen in een 175T kolf en kweek gedurende 2 dagen. Oogst cellen wanneer ze 75% -80% confluent zijn.
- Verwijder het kweekmedium en was de kolf eenmaal met PBS. Aspirateer PBS en voeg 5 ml 0,25% trypsine-EDTA toe, gevolgd door hard op de rand van de kweekkolf te tikken.
- Voeg 15 ml kweekmedium toe om de trypsine-EDTA te neutraliseren en giet de inhoud van de kolf in een centrifugebuis van 50 ml. Was het afwasoppervlak met 10 ml PBS en giet in dezelfde buis van 50 ml.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g. Gooi het supernatant weg en breek de celkorrel door met de vinger op de onderkant van de buis te tikken.
- Voeg koude 10 ml PBS toe en pipetteer voorzichtig de celsuspensie; tel vervolgens handmatig cellen met behulp van de hemocytometer. Houd de cellen op ijs voor injectie.
2. Tumorimplantatie
- Gas verdoof muizen met 5% isofluraan bij een gasdebiet van 1,0 l per minuut in de zuurkast. Verander het debiet in de onderhoudsdosis van 2% isofluraan zodra de muizen volledig verdoofd zijn. Voor dit protocol werd anesthesie uitgevoerd door de dierenarts volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van de instelling voor dieren.
- Scheer het haar op de linkerflank van de muizen en steriliseer de injectieplaats met behulp van alcoholdoekjes. Intradermaal (d.w.z.) implanteren B16-F10 tumorcellen bij 5 x 105 cellen in 50 μL koude PBS in de linkerflank met behulp van een naald van 30 G.
OPMERKING: De dosis geïmplanteerde B16-F10-tumorcellen moet mogelijk worden aangepast in het bereik van 0,5-5 x 105 cellen voor een succesvolle tumorontwikkeling. - Meet na implantatie drie keer per week de lengte en breedte van de tumor met behulp van een elektronische digitale remklauw. Bereken het tumorvolume (mm3) met behulp van de formule:
Tumorvolume (mm3) = breedte2 × lengte × 0,5
Behandel muizen met tumorvaccin wanneer tumoren een grootte van ≥2 mm hebben bereikt.
OPMERKING: Tumoren kunnen meestal worden gemeten op dag 3 na implantatie van 5 x 105 tumorcellen. Snellere B16-F10 tumorgroeisnelheid werd waargenomen bij mannelijke C57BL/6, Rag1-/-, of Rag2-/-γc-/-muizen. Een soortgelijke observatie werd beschreven in andere studies8. Het wordt aanbevolen om het geslacht van de muizen consistent te houden. Merk echter op dat de NIH de nadruk legt op seks als een belangrijke biologische variabele in biomedisch onderzoek.
3. Vaccinbereiding en injectie van Flt3L-tot expressie brengende B16-F10 (B16-Flt3L) cellen
- Onderhoud de B16-Flt3L-cellen in DMEM met 8% warmte-geïnactiveerde FBS, 2 mM glutamine en 100 U / ml elk van penicilline en streptomycine bij 37 ° C onder 5% CO2.
- Zaai 1 x 106 B16-Flt3L cellen in een 175T kolf en kweek gedurende 2 dagen. Oogst cellen wanneer ze 75% -80% confluent zijn zoals beschreven in stap 1.3 tot 1.6 en suspensie in 1 ml koude PBS.
- Bestraal cellen met een dosis gammastraling van 150 Gy met behulp van een röntgenbestralingsapparaat met een parameterinstelling van 160 kV en 25 mA. Tel en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-kleuring vóór injectie.
- Gas verdoof muizen zoals eerder beschreven en steriliseer de injectieplaats met behulp van alcoholdoekjes. Injecteer de muizen intradermaal met 1 x 106 bestraalde B16-Flt3L-cellen in 50 μL koude PBS op dezelfde flank als de oorspronkelijke tumorimplantatie, ~ 1 cm verwijderd van de plaats van de primaire tumor op dag 3, 6 en 9 na de eerste celimplantatie.
- Markeer de injectieplaatsen van het vaccin met een gekleurde pen om deze te onderscheiden van de primaire tumor.
OPMERKING: Als 0,5 x 105 B16-F10-cellen in eerste instantie worden geïmplanteerd, wordt aanbevolen om een vaccinbehandeling uit te voeren op dag 8, 11 en 14.
4. Intratumorale immuuncelisolatie
- Offer muizen op met behulp van CO2 en cervicale dislocatie in de zuurkast aan het einde van het experiment (op dag 15 na tumorimplantatie; Figuur 1).
- Verwijder de tumor operatief met de huid van elke muis en plaats deze in een 24-well plaat met 1 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium. Droog de tumoren af met een papieren handdoek voordat u het weegt.
- Snijd de tumoren in kleine stukjes. Voeg 2 ml digestiebuffer (100 μg/ml TL Liberase en 200 μg/ml DNase I in RPMI-1640 medium) toe en incubeer gedurende 25 minuten bij 37 °C.
- Voeg 10 ml 10% FBS/RPMI-1640 medium toe om de spijsvertering te stoppen. Breng de cellen over met een serologische pipet van 25 ml en gebruik de zuiger van een spuit van 1 ml om weefsel op een celzeef van 40 μm te malen.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in 5 ml van 40% dichtheid gradiëntspecifiek medium in PBS, verdund tot 1x concentratie).
- Voeg de celsuspensie langzaam toe bovenop 5 ml 80% dichtheidsgradiëntspecifiek medium dat PBS bevat. Centrifugeer de cellen bij 325 x g met lage reminstelling gedurende 23 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verzamel na centrifugatie zorgvuldig de leukocytenlaag op het grensvlak tussen 40% en 80% dichtheidsgradiëntspecifiek medium en passeer het door een celzeef van 40 μm. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Incubeer de pellet in 2 ml rode bloedcel (RBC) lysisbuffer gedurende 5 minuten bij RT. Voeg na incubatie 10 ml 10% FBS/RPMI-1640 medium toe om de RBC-lysisbuffer te doven.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in 0,5 ml van 10% FBS / RPMI-1640 medium en tel het totale aantal cellen voor gebruik voor verdere analyse.
OPMERKING: Verzamel de milt of dLN als controles voor gating-strategie van immuuncelsubsets door flowcytometrie-analyse. Volg de celisolatiemethode zoals hierboven beschreven met de volgende wijzigingen: Gebruik de zuiger van een spuit van 1 ml om weefsel te malen op een 70 μm mesh-filter. Was het weefsel met 10% FBS/RPMI-1640 medium om eencellige suspensies te krijgen. Lyse de RBC zoals beschreven.
5. Flowcytometrie analyse
OPMERKING: Cellen verzameld uit de leukocytenlaag bevatten immuuncellen en tumorcellen. Twee onafhankelijke kleuringspanelen worden aanbevolen.
- Oppervlaktevlekken
- Breng de cellen over in een 96-well V-shape-bottom plaat. Was de cellen met PBS en kleur ze met cel levensvatbaarheidskleurstof (50-100 μL / put) gedurende 15 minuten op RT.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Kleur de oppervlaktemarkers met gemengde antilichamen (gedetailleerde verdunning is opgenomen in de tabel met materialen) in FACS-buffer (1% FBS en 0,05% NaN3 in PBS) gedurende 30 minuten op ijs (50-100 μL / put).
- Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten en was ze tweemaal met FACS-buffer.
- Bevestig de cellen met celfixatiebuffer (50-100 μL/ putje) gedurende 35 minuten op ijs. Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten en was ze twee keer met FACS-buffer.
- Bewaar de monsters in FACS-buffer (150-200 μL/buis) bij 4 °C en bescherm tegen licht. Verkrijg de monsters op een flowcytometer. Volg voor dc's en T-cellenpopulatie de gatingstrategieën in figuur 2B en figuur 3A.
OPMERKING: Voor het kleuren van myeloïde DC's wordt aanbevolen om FC-blocker (Rat anti-muis CD16/CD32) gedurende 15 minuten op ijs te incuberen voordat oppervlakteantistoffen incubatie (stap 5.1.2) worden aanbevolen.
- Cytokine-analyse bij ex vivo herstimulatie
- Plaats de cellen in volledig medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM niet-essentieel aminozuur, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U/ml per penicilline en streptomycine, 50 μM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine) en stimuleer met 50 ng/ml PMA plus 1 μM ionomycine in aanwezigheid van eiwittransportremmer gedurende 4 uur bij 37 °C onder 5% CO2.
- Voer oppervlaktekleuring uit voor oppervlaktemarkers zoals hierboven beschreven in stap 5.1.
- Voeg de permeabilisatieoplossing (50-100 μL/put) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij RT voor intracellulaire kleuring. Incubeer de cellen met antilichamen die specifiek zijn voor cytokines of nucleaire eiwitten in permeabilisatieoplossing (50-100 μL/put) gedurende 60 minuten op ijs of een nacht bij 4 °C.
- Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten en was ze tweemaal met FACS-buffer. Bewaar de monsters bij 4 °C en bescherm tegen licht. Verkrijg de monsters op een flowcytometer.
OPMERKING: Antilichaamverdunning moet mogelijk indien nodig worden aangepast om optimale kleuring te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een zichtbare zwarte stip van de geïmplanteerde B16-F10-cellen wordt meestal waargenomen op het huidoppervlak ~ 3 dagen na tumorimplantatie. Muizen worden behandeld met het tumorvaccin 3, 6 en 9 dagen nadat de tumorknobbel een grootte van ≥2 mm heeft bereikt. We zagen een significante vermindering van tumorgroei in gevaccineerde muizengroep ~ 2 weken na tumorimplantatie (figuur 1). Aan het einde van het experiment isoleerden we de intratumorale immuuncellen en analyseerden we hun aantal en celoppervlakmarkerexpressie, evenals cytokineproductie na een korte in vitro stimulatie zoals hierboven beschreven. Cellen verzameld uit de leukocytenlaag bevatten nog steeds veel tumorcellen, waardoor het enigszins moeilijk is om de lymfocytenpopulatie gemakkelijk te definiëren. Daarom wordt het gebruik in parallelle splenocyten aanbevolen voor een goede gating van intratumorale immuuncelsubsets in flowcytometrieanalyse (figuur 2A). Hier worden gatingstrategieën van CD103+CD11c+DC, CD8+, CD4+ en Treg getoond (figuur 2B en figuur 3A) samen met de compensatiematrix (tabel 1 en tabel 2). Representatieve gegevens van verworven tellingen en frequentie van elke populatie zijn ook weergegeven in figuur 2C en figuur 3B.
Intratumorale CD103+CD11c+DC's, die de krachtigste tumorantigeenverwerkings- en presentatiecellenvertegenwoordigen 9,10, van gevaccineerde muizen vertoonden een significant verhoogde expressie van het costimulatoire ligand CD86 (figuur 4). Gevaccineerde muizen vertoonden ook een toename van tumorinfiltrerende CD8+ en CD4+Foxp3− T-cellen (figuur 5A), evenals in CD8+GzmB+ en IFN-γ+ CTL's (Figuur 5B). Deze resultaten suggereren dat deze tumorvaccinatie DC-rijping bevordert en een sterkere antitumorimmuniteit induceert.
Figuur 1: Analyse van tumorgroei in een therapeutisch model van celgebaseerd tumorvaccin met flt3L-tot expressie brengende B16-F10 melanoomcellen. Vrouwelijke C57BL/6-muizen werden i.d. geïmplanteerd met B16-F10-cellen (5 x 105) en geïnjecteerd met bestraalde (150 Gy) B16-Flt3L-cellen (1 x 106) op een aangrenzende locatie op dezelfde flank. De pijlpunten geven de tijdstippen van vaccinatie aan. Cumulatieve gegevens van vier experimenten worden getoond (Controle, n = 12; B16-Flt3L, n = 10). Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. Statistische analyse door tweeweg herhaalde metingen ANOVA-test met Bonferroni post-test. *P < 0,05; ***P < 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gating strategieën van lymfocyten en CD103+CD11c+DC's. (A) Gating strategieën van lymfocyten in milt en tumor monsters. (B) Gating strategieën van intratumorale CD103+CD11c+DC's in tumormonster. (C) Verworven tellingen en frequentie van elke populatie van een representatieve niet-gevaccineerde controlemuis worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gating strategieën van CD8+, CD4+ en Treg. (A) Gating strategieën van T-cellen in tumormonster. (B) Verworven tellingen en frequentie van elke populatie van een representatieve niet-gevaccineerde controlemuis worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CD86-oppervlakte-expressie op CD103+ intratumorale DC's. Expressie wordt gerapporteerd als mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) genormaliseerd tot gemiddelde MFI in de controlegroep (= 1). Controle, n = 8; B16-Flt3L, n = 10. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. Statistische analyse door ongepaarde Student's t-test. **P < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Analyse van intratumorale T-cellen in controle- en gevaccineerde muizen. (A) Inventarisatie van tumorinfiltrerende CD8+ (links) en niet-Treg CD4+ (rechts) per gram tumorweefsel. (B) Inventarisatie van intratumorale GzmB+ (links) en IFNγ+ (rechts) CD8+ T cellen. Controle, n = 11; B16-Flt3L, n = 10. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. Statistische analyse door ongepaarde Student's t-test. *P < 0,05; **P < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Compensatiematrix van figuur 2. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Compensatiematrix van figuur 3. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol is gebaseerd op de studie van allison's groep. Ze toonden aan dat de combinatie van B16-Flt3L-vaccin met CTLA-4-blokkade een synergetisch effect had op de overlevingskans en tumorgroei, terwijl er geen vermindering van tumorgroei werd gezien bij muizen die alleen het B16-Flt3L-vaccin of anti-CTLA-4-antilichaambehandelingkregen 7. Recente studies hebben een nieuwe Treg-intrinsieke CTLA4-PKCη signaleringsroute onthuld die een belangrijke verplichte rol speelt bij het reguleren van de contactafhankelijke onderdrukkende activiteit van Treg11. Zowel B16-Flt3L-vaccinbehandeling alleen als vaccincombinatie met Treg-specifieke PKCη-deletie verminderde de groei van tumor aanzienlijk wanneer een hoger aantal (0,5-5 x 105) B16-F10 melanoomcellen werd geïmplanteerd dan in de Studie van Allison (1 x 104) cellen werden geïmplanteerd. Subtiele verschillen in de bron van melanoomcellen of muizen kunnen dit verschil verklaren. Daarom wordt het getitreerd aantal geïmplanteerde tumorcellen aanbevolen. Verhoogde infiltratie van CD8+ T-cellen in de primaire tumor werd op dezelfde manier waargenomen in de vorige studie7. Bovendien zagen we verhoogde CD86-expressie op intratumorale CD103 + CD11c + DC's, wat waarschijnlijk verantwoordelijk is voor een sterkere activering en uitbreiding van tumorinfiltrerende CD8 + CTL's.
Dit protocol, met behulp van een op cellen gebaseerd tumorvaccin dat Flt3L tot expressie brengt, is handig en eenvoudig te gebruiken en dient als een betrouwbaar model om intratumorale immuuncelinfiltraten, inclusief DC's, te bestuderen. Pkcη-signalering is bijvoorbeeld vereist voor de contactafhankelijke onderdrukkende activiteit van Treg. Prkch−/− Treg vertoonde dus een hogere conjugatie-efficiëntie met APC's in een Treg-DC in vitro cocultuursysteem, wat wijst op een defect in het vermogen van Prkch−/− Treg om contact te verbreken en los te koppelen van aangesloten DC's12. B16-Flt3L-vaccinatie rekruteert waarschijnlijk meer volwassen DC's die tumorspecifieke antigenen efficiënter presenteren en dus waarschijnlijk de observatie van de interactie tussen tumorinfiltrerende Treg en DC door live cell imaging vergemakkelijken.
Het houden van voldoende afstand tussen de primaire tumor en het tumorvaccin is een belangrijk kenmerk van dit protocol. Deze fysieke scheiding is van cruciaal belang om ruimte te bieden voor groei van de primaire tumor en mogelijke fusie tussen de twee tumorimplantaten te voorkomen. Als alternatief kan het tumorvaccin worden geïmplanteerd in de tegenovergestelde flank ten opzichte van de primaire tumor, omdat dit ook werd gemeld om de tumorgroei te remmen7. Een beperking van de studie is het ontbreken van een commerciële bron van B16-Flt3L cellijn, maar hetzelfde concept kan worden toegepast op andere tumortypen, bijvoorbeeld TRAMP-C2 prostaat adenocarcinomen7.
Hoewel het hier beschreven protocol B16-F10 melanoomcellen gebruikt als tumormodel, kunnen de onderliggende principes indien nodig worden aangepast en gewijzigd om immunotherapeutische modellen voor andere solide tumoren vast te stellen. Bovendien kan het vaccinatieprotocol dat we gebruikten gemakkelijk worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten, bijvoorbeeld CTLA-4- of PD-1-gebaseerde checkpointblokkade, om additieve of synergetische effecten te bereiken die mogelijk kunnen resulteren in krachtigere antitumorimmuniteit en verhoogde overleving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Stephen Schoenberger voor het leveren van B16-Flt3L-cellen en het personeel van de LJI-dier- en flowcytometriefaciliteiten voor uitstekende ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al.
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
