Protokollen presenterer en kreftimmunterapimodell ved bruk av cellebasert tumorvaksinasjon med Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanom. Denne protokollen demonstrerer prosedyrene, inkludert fremstilling av dyrkede tumorceller, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorvekst, isolering av intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.
Fms-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Flt3L) er et hematopoietisk cytokin som fremmer overlevelse og differensiering av dendrittiske celler (DC). Det har blitt brukt i tumorvaksiner for å aktivere medfødt immunitet og forbedre antitumorresponser. Denne protokollen demonstrerer en terapeutisk modell ved bruk av cellebasert tumorvaksine bestående av Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanomceller sammen med fenotypisk og funksjonell analyse av immunceller i tumormikromiljøet (TME). Prosedyrer for dyrkede tumorcellepreparater, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorstørrelse, intratumoral immuncelleisolasjon og flowcytometrianalyse er beskrevet. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en preklinisk solid tumor immunterapi modell, og en forskningsplattform for å studere forholdet mellom tumorceller og infiltrerende immunceller. Immunterapiprotokollen som er beskrevet her, kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter, for eksempel immunkontrollpunktblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antistoffer) eller kjemoterapi for å forbedre kreftterapeutisk effekt av melanom.
Kreftimmunterapi har blitt anerkjent som en lovende terapeutisk strategi basert på mindre giftige bivirkninger og mer holdbare responser. Flere typer immunterapier er utviklet, inkludert onkolytiske virusterapier, kreftvaksiner, cytokinbehandlinger, monoklonale antistoffer, adoptivcelleoverføring (CAR-T-celler eller CAR-NK) og immunkontrollpunktblokkade1.
For kreftvaksiner finnes det ulike former for terapeutiske vaksiner, som helcellebaserte vaksiner, protein- eller peptidvaksiner, og RNA- eller DNA-vaksiner. Vaksinasjon er avhengig av evnen til antigenpresenterende celler (APCs) til å behandle tumorantigener, inkludert tumorspesifikke antigener, og presentere dem i immunogen form til T-celler. Dendrittiske celler (DCs) har vært kjent for å være de mest potente APCene og antas å spille en viktig rolle i antitumorimmunitet 2,3. Disse cellene tar opp og behandler tumorantigener, og migrerer deretter til drenerende lymfeknuter (dLN) for å prime og aktivere tumorspesifikke T-effektorceller (Teff) gjennom engasjement av T-cellereseptoren (TCR) og kostimulatoriske molekyler. Dette resulterer i differensiering og utvidelse av tumorspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL), som infiltrerer svulsten og dreper tumorceller4. Følgelig representerer aktivering og modning av DCs attraktive strategier for å stimulere immunitet mot tumorantigener.
Flt3L er kjent for å fremme modning og utvidelse av funksjonelt modne DCer som uttrykker MHC klasse II, CD11c, DEC205 og CD86 proteiner5. Intratumoral, men ikke intravenøs, administrering av en adenovirusvektor som inneholder Flt3L-genet ( Adv-Flt3L ) har vist seg å fremme immunterapeutisk aktivitet mot ortrotopiske svulster6. Flt3L har også blitt brukt i tumorcellebaserte vaksiner som består av bestrålte B16-F10-celler som stabilt uttrykker retroviralt transducert Flt3L som en måte å øke krysspresentasjonen av tumorantigener av DCs og dermed øke antitumorresponsen. Protokollen for B16-Flt3L tumorvaksinasjon beskrevet her er basert på en studie publisert av Dr. James Allisons gruppe7. I dette papiret rapporterte de at en B16-Flt3L-vaksine kombinert med CTLA-4-blokkering synergistisk induserte avvisningen av etablert melanom, noe som resulterte i økt overlevelse.
Målet med denne protokollen er å gi en preklinisk immunterapimodell for melanom. Her beskrives detaljerte prosedyrer for hvordan man forbereder og implanterer tumorvaksiner, og hvordan man analyserer sammensetningen og funksjonen til intratumorale immunceller fra solid tumor.
Protokollen beskrevet her er basert på studien av Allisons gruppe. De viste at kombinasjonen av B16-Flt3L-vaksine med CTLA-4-blokkering viste en synergistisk effekt på overlevelse og tumorvekst, mens ingen reduksjon av tumorvekst ble sett hos mus som fikk B16-Flt3L-vaksinen eller anti-CTLA-4-antistoffbehandlingen alene7. Nylige studier har avslørt en ny Treg-inneboende CTLA4-PKCη signalvei som spiller en viktig obligatorisk rolle i å regulere den kontaktavhengige undertrykkende aktiviteten ti…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Stephen Schoenberger for å gi B16-Flt3L-celler og personalet på LJI-dyret og flowcytometrifasilitetene for utmerket støtte.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
DNase I | Sigma | 11284932001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
PMA | Sigma | P1585 | |
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
TL Liberase | Roche | 477530 | |
Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
Antibodies | |||
Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |