Summary

Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

Il protocollo presenta un modello di immunoterapia del cancro che utilizza la vaccinazione tumorale basata su cellule con melanoma B16-F10 che esprime Flt3L. Questo protocollo dimostra le procedure, compresa la preparazione di cellule tumorali in coltura, l’impianto del tumore, l’irradiazione cellulare, la misurazione della crescita tumorale, l’isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l’analisi della citometria a flusso.

Abstract

Il ligando tirosin-chinas-simile 3 (Flt3L) è una citochina ematopoietica che promuove la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule dendritiche (DC). È stato utilizzato nei vaccini tumorali per attivare l’immunità innata e migliorare le risposte antitumorali. Questo protocollo dimostra un modello terapeutico che utilizza un vaccino tumorale basato su cellule costituito da cellule di melanoma B16-F10 che esprimono Flt3L insieme all’analisi fenotipica e funzionale delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale (TME). Vengono descritte le procedure per la preparazione delle cellule tumorali in coltura, l’impianto del tumore, l’irradiazione cellulare, la misurazione delle dimensioni del tumore, l’isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l’analisi della citometria a flusso. L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un modello preclinico di immunoterapia dei tumori solidi e una piattaforma di ricerca per studiare la relazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie infiltranti. Il protocollo di immunoterapia qui descritto può essere combinato con altre modalità terapeutiche, come il blocco del checkpoint immunitario (anticorpi anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la chemioterapia al fine di migliorare l’effetto terapeutico del melanoma sul cancro.

Introduction

L’immunoterapia del cancro è stata riconosciuta come una strategia terapeutica promettente basata sui suoi effetti collaterali meno tossici e risposte più durature. Sono stati sviluppati diversi tipi di immunoterapie, tra cui terapie con virus oncolitici, vaccini contro il cancro, terapie con citochine, anticorpi monoclonali, trasferimento cellulare adottivo (cellule CAR-T o CAR-NK) e blocco del checkpoint immunitario1.

Per i vaccini contro il cancro, ci sono diverse forme di vaccini terapeutici, come vaccini a base di cellule intere, vaccini proteici o peptidici e vaccini a RNA o DNA. La vaccinazione si basa sulla capacità delle cellule presentanti l’antigene (APC) di elaborare gli antigeni tumorali, compresi gli antigeni tumorali specifici, e presentarli in forma immunogenica alle cellule T. Le cellule dendritiche (DC) sono note per essere le APC più potenti e si ritiene che svolgano un ruolo importante nell’immunità antitumorale 2,3. Queste cellule assorbono ed elaborano gli antigeni tumorali e quindi migrano verso i linfonodi drenanti (dLN) per innescare e attivare le cellule effettrici T tumore-specifiche (Teff) attraverso l’impegno del recettore delle cellule T (TCR) e delle molecole costimolatorie. Ciò si traduce nella differenziazione e nell’espansione delle cellule T citotossiche tumore-specifiche (CTL), che si infiltrano nel tumore e uccidono le cellule tumorali4. Di conseguenza, l’attivazione e la maturazione delle DC rappresentano strategie interessanti per stimolare l’immunità contro gli antigeni tumorali.

Flt3L è noto per promuovere la maturazione e l’espansione di DC funzionalmente mature che esprimono le proteine MHC di classe II, CD11c, DEC205 e CD865. La somministrazione intratumorale, ma non endovenosa, di un vettore adenovirus che incorpora il gene Flt3L (Adv-Flt3L) ha dimostrato di promuovere l’attività terapeutica immunitaria contro i tumori ortotopici6. Flt3L è stato utilizzato anche in vaccini basati su cellule tumorali costituiti da cellule B16-F10 irradiate che esprimono stabilmente Flt3L trasdotta in modo retroviralmente come un modo per migliorare la presentazione incrociata degli antigeni tumorali da parte delle DC e, quindi, aumentare le risposte antitumorali. Il protocollo di vaccinazione antitumorale B16-Flt3L qui descritto si basa su uno studio pubblicato dal gruppo7 del Dr. James Allison. In questo articolo, hanno riferito che un vaccino B16-Flt3L combinato con il blocco CTLA-4 ha indotto sinergicamente il rigetto del melanoma stabilito, con conseguente aumento della sopravvivenza.

L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un modello di immunoterapia preclinica per il melanoma. Qui vengono descritte procedure dettagliate su come preparare e impiantare vaccini tumorali e come analizzare la composizione e la funzione delle cellule immunitarie intratumorali dal tumore solido.

Protocol

Tutti i topi utilizzati nello studio sono stati mantenuti e ospitati nel vivaio dell’Istituto di immunologia La Jolla (LJI) in specifiche condizioni prive di agenti patogeni con temperatura e umidità controllate. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con topi femmina C57BL / 6 di 8-14 settimane secondo le linee guida e i protocolli approvati dal LJI Animal Care Committee. 1. Preparazione di cellule tumorali in coltura per l’impianto Cellule di melanoma B…

Representative Results

Un punto nero visibile delle cellule B16-F10 impiantate viene solitamente osservato sulla superficie della pelle ~ 3 giorni dopo l’impianto del tumore. I topi vengono trattati con il vaccino tumorale 3, 6 e 9 giorni dopo che il nodulo tumorale ha raggiunto una dimensione di ≥2 mm. Abbiamo osservato una significativa riduzione della crescita tumorale nel gruppo di topi vaccinati ~ 2 settimane dopo l’impianto del tumore (Figura 1). Alla fine dell’esperimento, abbiamo isolato le cellule immun…

Discussion

Il protocollo qui descritto si basa sullo studio del gruppo di Allison. Hanno dimostrato che la combinazione del vaccino B16-Flt3L con il blocco CTLA-4 ha mostrato un effetto sinergico sul tasso di sopravvivenza e sulla crescita del tumore, mentre nessuna riduzione della crescita tumorale è stata osservata nei topi che hanno ricevuto il vaccino B16-Flt3L o il trattamento con anticorpi anti-CTLA-4 da solo7. Studi recenti hanno rivelato una nuova via di segnalazione CTLA4-PKCη intrinseca Treg-intr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Stephen Schoenberger per aver fornito cellule B16-Flt3L e il personale delle strutture di citometria animale e a flusso LJI per l’eccellente supporto.

Materials

0.25% trypsin-EDTA  Gibco 25200-056
10% heat-inactivated FBS Omega Scientific FB-02  Lot# 209018
30G needle BD Biosciences 305106
96 well V-shape-bottom plate SARSTEDT 83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI  Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines ATCC CRL-6475
Centrifuge 5810R Eppendorf
Cytofix fixation buffer  BD Biosciences BDB554655 Cell fixation buffer (4.2% PFA) 
Cytofix/Cytoperm kit  BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I Sigma 11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)  Corning 10013CV
Electronic digital caliper Fisherbrand 14-648-17
FlowJo software  Tree Star Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor) BD Biosciences 554724 1:1500 dilution
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Ionomycin Sigma I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) Thermo Fisher 12440053
LSR-II cytometers  BD Biosciences Flow cytometer
MEM nonessential amino acids Gibco 11140-050
penicillin and streptomycin  Gibco 15140-122
Percoll  GE Healthcare Life Sciences GE17-0891-02 density gradient specific medium
PMA Sigma P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid Sigma R7757-100ML
RPMI 1640 medium Corning 10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator Rad Source Technologies
sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sterile cell strainer 40 μm Fisherbrand 22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm Fisherbrand 22-363-548
TL Liberase Roche 477530
Zombie Aqua fixable viability kit BioLegend 423101
Antibodies
Anti-mCD45 BioLegend 103135 Clone: 30-F11
Fluorophore: BV570
Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε BioLegend 100327 Clone: 145-2C11
Fluorophore: PerCP-Cy5.5
Dilution: 1:200
Anti-mCD8 BioLegend 100730
100724
Clone: 53-6.7
Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647
Dilution: 1:200
Anti-mCD4 BioLegend 100414 Clone: GK1.5
Fluorophore: APC-Cy7
Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3 Thermo Fisher Scientific 11577382 Clone: FJK-16s
Fluorophore: FITC
Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB BioLegend 372208 Clone: QA16A02
Fluorophore: PE
Dilution: 1:100
Anti-mIFNg BioLegend 505826 Clone: XMG1.2
Fluorophore: PE-Cy7
Dilution: 1:100
Anti-mCD19 BioLegend 115543 Clone: 6D5
Fluorophore: BV785
Dilution: 1:100
Anti-mGr1 BioLegend 108423 Clone: RB6-8C5
Fluorophore: APC/Cy7
Dilution: 1:200
Anti-mCD11b BioLegend 101223 Clone: M1/70
Fluorophore: Pacific blue
Dilution: 1:100
Anti-mF4/80 BioLegend 123114 Clone: BM8
Fluorophore: PECy7
Dilution: 1:100
Anti-mCD11c BioLegend 117328 Clone: N418
Fluorophore: PerCP Cy5.5
Dilution: 1:100
Anti-mMHCII BioLegend 107622 Clone: M5/114.15.2
Fluorophore: AF700
Dilution: 1:400
Anti-mCD103 BioLegend 121410 Clone: 2E7
Fluorophore: Alexa Fluor 647
Dilution: 1:200
Anti-mCD86 BioLegend 105007 Clone: GL-1
Fluorophore: PE
Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) BD Biosciences 553141 Clone: 2.4G2
Dilution: 1:200

References

  1. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
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Cite This Article
Liu, H. Y., Altman, A., Canonigo-Balancio, A. J., Croft, M. Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine. J. Vis. Exp. (192), e64082, doi:10.3791/64082 (2023).

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