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Genetics

कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस में जीवनकाल और हेल्थस्पैन को मापने के लिए कम लागत वाले तरीकों का सर्वेक्षण करना

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64091
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस स्वास्थ्य, जीवनकाल और तनाव के लिए लचीलापन के सर्वेक्षण के लिए मजबूत और कम लागत वाले तरीकों के साथ एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के रूप में काम करते हैं।

Abstract

एक मॉडल जीव के रूप में कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस की खोज और विकास जीव विज्ञान में प्रभावशाली था, खासकर उम्र बढ़ने के क्षेत्र में। कई ऐतिहासिक और समकालीन अध्ययनों ने आनुवंशिक उत्परिवर्तन, ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति और हार्मेसिस, तनाव के लिए एक फायदेमंद, निम्न-श्रेणी के जोखिम सहित हजारों जीवनकाल-फेरबदल प्रतिमानों की पहचान की है। इसके कई फायदों के साथ, जिसमें एक छोटा जीवनकाल, आसान और कम लागत वाला रखरखाव, और सभी मानव जीनों के लगभग दो-तिहाई तक होमोलॉजी के साथ पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम शामिल है, सी एलिगेंस को तनाव और उम्र बढ़ने वाले जीव विज्ञान के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में जल्दी से अपनाया गया है। यहां, जीवनकाल और स्वास्थ्य को मापने के लिए कई मानकीकृत तरीकों का सर्वेक्षण किया जाता है जिन्हें आसानी से लगभग किसी भी शोध वातावरण में अनुकूलित किया जा सकता है, खासकर सीमित उपकरण और धन वाले। एलिगेंस की अविश्वसनीय उपयोगिता को चित्रित किया गया है, जो व्यापक बुनियादी ढांचे की आवश्यकता के बिना उम्र बढ़ने वाले जीव विज्ञान में शक्तिशाली आनुवंशिक विश्लेषण करने की क्षमता को उजागर करता है। अंत में, प्रत्येक विश्लेषण और वैकल्पिक दृष्टिकोण की सीमाओं पर विचार के लिए चर्चा की जाती है।

Introduction

1974 में सिडनी ब्रेनर के सबसे प्रभावशाली लेखों में से एक 'द जेनेटिक्स ऑफ कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस' के प्रकाशन के समय से, इस सूक्ष्म कीड़े को जैविक रहस्यों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली माना जाता है1. 1977 में, माइकल आर क्लास ने सी एलिगेंस के जीवनकाल को मापने की विधि प्रकाशित की और उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल प्रणाली की स्थापनाकी 2. तनाव और दीर्घायु के बीच संबंधों को समझने के लिए जांच उम्र -1 जीन में एक एकल उत्परिवर्तन की पहचान के साथ शुरू हुई है, जिसके परिणामस्वरूप सी एलिगेंस3 में जीवनकाल विस्तार हुआ है। इसके अलावा, समकालीन अध्ययनों ने अन्य जीवनकाल-बढ़ते उत्परिवर्तनों की पहचान की है, जो लंबे समय तक रहने वाले उत्परिवर्ती कीड़े का खुलासा करते हैं जो तनाव 4,5,6 के प्रतिरोध में वृद्धि प्रदर्शित करते हैं। एक छोटे जीवनकाल, आसान रखरखाव, सभी मानव रोग पैदा करने वाले जीन के लगभग दो-तिहाई तक होमोलॉजी युक्त पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) पुस्तकालयों का उपयोग करने की उपलब्धता और आसानी, और मनुष्यों के साथ शारीरिक समानता सहितइसके कई फायदे के साथ 7,8,9, सी।

शायद सी एलिगेंस की सबसे बड़ी उपयोगिताओं में रखरखाव की बेहद कम लागत, प्रयोग में आसानी और अध्ययन के लिए उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की विविधता है। एलिगेंस आमतौर पर एक ठोस अगर माध्यम पर ई कोलाई खाद्य स्रोत के साथ उगाए जाते हैं। दो आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ई कोलाई उपभेद मानक ओपी 50 हैं, एक बी तनाव जो शायद सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला10 है, और एचटी 115, एक के -12 तनाव जो मुख्य रूप से आरएनएआई प्रयोगों11,12 के लिए उपयोग किया जाता है। एचटी 115 के -12 तनाव आरएनएआईआईआई आरएनएएसई में एक विलोपन करता है, एक उत्परिवर्तन जो आरएनएआई विधियों के लिए आवश्यक है, जहां व्यक्तिगत सी एलिगेंस जीन के अनुरूप डीएसआरएनए व्यक्त करने वाले प्लास्मिड का उपयोग किया जाता है। डीएसआरएनए फीडिंग वैक्टर जटिल क्रॉस या जीनोम संपादन की आवश्यकता के बिना सी एलिगेंस जीन के मजबूत नॉकडाउन की अनुमति देते हैं, क्योंकि इन प्लास्मिड को ले जाने वाले बैक्टीरिया को सीधे नेमाटोड में खिलाया जा सकता है। इनमें से हजारों जीवाणु आरएनएआई वैक्टर एचटी 115 पृष्ठभूमि में मौजूद हैं, जिसमें >19,000 व्यक्तिगत आरएनएआई के साथ सबसे लोकप्रिय विडाल आरएनएआई लाइब्रेरी13 का निर्माण करती है और 16,757 आरएनएआई के साथ अहरिंगर आरएनएआई लाइब्रेरी14 का निर्माण करती है। हालांकि, ओपी 50 और एचटी 115 जीवाणु आहार में चयापचय प्रोफ़ाइल में बड़े अंतर हैं, जिसमें विटामिन बी 1215,16 में अंतर शामिल है। इसलिए, जीन-आहार इंटरैक्शन से बचने के लिए, यदि संभव हो तो एक ही बैक्टीरिया स्रोत पर सभी प्रयोगों को करने की सिफारिश की जाती है जो पहलेवर्णित 17,18,19 के रूप में कई भ्रमित कारकों का परिचय दे सकते हैं। इसकी आसानी के कारण, जानवरों को यहां वर्णित सभी प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए ओपी 50 पर बनाए रखा जाता है, लेकिन सभी प्रयोग एचटी 115 पर किए जाते हैं जैसा कि पहले20 वर्णित है। संक्षेप में, जानवरों को ओपी 50 पर बनाए रखा जाता है और आरएनएआई बनाम गैर-आरएनएआई प्रयोगों के बीच स्थिरता के लिए एचटी 115 पोस्ट-सिंक्रनाइज़ेशन (विरंजन के बाद) में स्थानांतरित किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, ई कोलाई के 12 एचटी 115 तनाव में पाए जाने वाले आरएनएआईआईआई आरएनएकेई के समान विलोपन वाले आरएनएआई-सक्षम ओपी 50 तनाव का भी उपयोग किया जा सकता है।

शायद सी एलिगेंस में आरएनएआई प्रयोगों की एक प्रमुख सीमा नॉकडाउन दक्षता की चिंता है। जबकि नॉकडाउन दक्षता को क्यूपीसीआर या पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से मान्य किया जा सकता है, इन्हें महंगे उपकरण और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और थोक विश्लेषण तक सीमित होते हैं। यह न्यूरॉन्स जैसे विशिष्ट कोशिकाओं को देखते हुए और भी अधिक चिंता का विषय है, जो आरएनएआई के लिए दुर्दम्य (कम संवेदनशील) हैं। जबकि विशिष्ट कोशिकाओं में आरएनएआई दक्षता को एसआईडी -1 के ओवरएक्सप्रेशन के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है, डीएसआरएनए अपटेक22 के लिए आवश्यक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, यह अभी भी इन निर्माणों के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रमोटरों के सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न तक सीमित है, और इस प्रकार जीन नॉकआउट और उत्परिवर्तन जीन कार्यों को कम करने का सबसे मूर्खतापूर्ण साधन हैं। आरएनएआई-मध्यस्थता वाले नॉकडाउन से परे, सी एलिगेंस सीआरआईएसपीआर-आधारित रणनीतियों 23,24,25 के साथ जीनोम संपादन के लिए भी अत्यधिक उत्तरदायी हैं और माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से ट्रांसजेनिक निर्माण ओवरएक्सप्रेशन, विकिरण या ट्रांसपोसन-आधारित एकीकरण 26,27,28,29 के माध्यम से ट्रांसजेनिक निर्माणों को एकीकृत करने के विकल्प के साथ . हालांकि, इन विधियों को महंगे माइक्रोइंजेक्शन उपकरण की आवश्यकता होती है, और गाइड आरएनए या कैस 9 एंजाइम की उच्च लागत सीमित धन वाले संस्थानों में इन तरीकों को प्रतिबंधित कर सकती है। इसके बजाय, हजारों ट्रांसजेनिक लाइनें और म्यूटेंट कैनोरहाब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) और नेशनल बायोरिसोर्स प्रोजेक्ट (एनबीआरपी) दोनों में कुछ डॉलर के लिए आसानी से उपलब्ध हैं। एनबीआरपी बड़ी संख्या में सी एलिगेंस जीन के लिए पृथक म्यूटेंट प्रदान करता है, जिसमें प्रकाशित और इसलिए सत्यापित उत्परिवर्ती उपभेद, पायलट परियोजनाओं से प्राप्त म्यूटेंट और म्यूटेंट शामिल हैं जिन्हें अभी तक विशेषता नहीं दी गई है। इसके विपरीत, सीजीसी अनुसंधान समुदाय से ज्यादातर प्रकाशित और स्थापित सी एलिगेंस लाइनों का एक डिपॉजिटरी है। वे दोनों बहुत ही उचित दरों पर दुनिया भर में उपभेदों को जहाज करते हैं और घर में उपभेदों को संश्लेषित करने की सीमित क्षमता वाले लोगों के लिए विभिन्न प्रकार के विकल्प प्रदान करते हैं।

यहां, एक क्यूरेटेड विधियों के संग्रह की पेशकश की जाती है, जो सी एलिगेंस में जीवनकाल और स्वास्थ्य की जांच के लिए सबसे कम लागत वाले तरीके होने की संभावना है। यहां प्रस्तुत सभी विधियों के लिए कम लागत वाले उपकरण और आपूर्ति की आवश्यकता होती है, और केवल सीजीसी से आसानी से उपलब्ध उपभेदों का उपयोग करते हैं। शायद सी एलिगेंस में दीर्घायु और उत्तरजीविता परख के लिए सबसे निषेधात्मक नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों की लागत है। चूंकि सी एलिगेंस हेर्मैफ्रोडाइट्स और आत्म-निषेचित हैं, मानक उत्तरजीविता परख के लिए वयस्क जानवरों को संतानों से संदूषण से बचने के लिए लगातार अपनी संतान से दूर ले जाने की आवश्यकता होती है। न केवल यह प्रक्रिया समय लेने वाली है, यह एक जीवनकाल परख चलाने के लिए प्रति स्थिति लगभग 100 प्लेटों की आवश्यकता के कारण महंगा हो सकता है। यहां, दो विकल्प प्रदान किए गए हैं: तापमान-संवेदनशील जर्मलाइन-कम उत्परिवर्ती, जीएलपी -4 (बीएन 2), या 5-फ्लोरो -2 '-डीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) का उपयोग करके रासायनिक नसबंदी का उपयोग। जीएलपी -4 एक वैलिल एमिनोसिल टीआरएनए सिंथेटेज को एन्कोड करता है, और तापमान-संवेदनशील जीएलपी -4 (बीएन 2) प्रोटीन अनुवाद30,31 में कमी के कारण प्रतिबंधात्मक तापमान पर प्रजनन की कमी है। एफयूडीआर डीएनए प्रतिकृति को रोककर रासायनिक रूप से सी एलिगेंस को निष्फल करने का एक मजबूत तरीका है, इस प्रकार प्रजनन32 को बाधित करता है। यद्यपि कुछ प्रयोगशालाओं के लिए एफयूडीआर निषेधात्मक रूप से महंगा हो सकता है, लेकिन कीड़े को रासायनिक रूप से निष्फल करने के लिए केवल थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, और पाउडर के रूप में इसकी स्थिरता अधिकांश समूहों के लिए इसे संभव बना सकती है। तापमान-संवेदनशील जीएलपी -4 (बीएन 2) उत्परिवर्ती का उपयोग करना निश्चित रूप से सबसे सस्ता विकल्प है, क्योंकि एकमात्र आवश्यकता जानवरों को प्रतिबंधात्मक 25 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित करने के लिए एक इनक्यूबेटर है; हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 25 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि हल्के गर्मी-तनाव33,34 का कारण बन सकती है। विधि के बावजूद, बाँझ जानवरों का उपयोग उम्र से संबंधित परख के लिए आवश्यक उपभोग्य सामग्रियों की लागत को काफी कम कर सकता है।

उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए, मानक जीवनकाल परख पारंपरिक हैं क्योंकि दीर्घायु को बदलने वाले प्रतिमानों का उम्र बढ़ने पर सीधा प्रभाव पड़ता है। हालांकि, स्वास्थ्य और तनाव सहिष्णुता के माप जीव के स्वास्थ्य पर अतिरिक्त जानकारी प्रस्तुत करते हैं। यहां, स्वास्थ्य को मापने के लिए कई तरीकों की पेशकश की जाती है: 1) प्रजनन स्वास्थ्य के उपाय के रूप में फेकंडिटी; 2) विकासात्मक स्वास्थ्य और रखी संतानों की व्यवहार्यता के उपाय के रूप में ब्रूड आकार; और 3) मांसपेशियों के कार्य और गतिशीलता के उपाय के रूप में लोकोमोटरी व्यवहार, जिनमें से दोनों सीधे उम्र बढ़ने के साथ सहसंबद्ध हैं। इसके अतिरिक्त, तनाव सहिष्णुता के परख की पेशकश की जाती है: ईआर तनाव, माइटोकॉन्ड्रियल / ऑक्सीडेटिव तनाव और थर्मल तनाव अस्तित्व के लिए अस्तित्व। दरअसल, ईआर तनाव35,36, माइटोकॉन्ड्रियल तनाव 37, और थर्मल तनाव38 के प्रतिरोध में वृद्धि वाले जानवर जीवनकाल में वृद्धि का प्रदर्शन करते हैं। एलिगेंस को ट्यूनिकामाइसिन में उजागर करके ईआर तनाव लागू किया जाता है, जो एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन को अवरुद्ध करता है और मिसफोल्ड प्रोटीन के संचय का कारण बनता है39. ऑक्सीडेटिव तनाव पैराक्वाट के संपर्क में आने से प्रेरित होता है, जो विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रिया40 में सुपरऑक्साइड गठन को प्रेरित करता है। गर्मी तनाव 34-37डिग्री सेल्सियस 33,41 पर जानवरों के इनक्यूबेशन के माध्यम से लागू किया जाता है। यहां वर्णित सभी परख न्यूनतम उपकरण और धन के साथ किए जा सकते हैं, और विभिन्न समूहों में उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के उपकरण प्रदान कर सकते हैं।

Protocol

1. सी एलिगेंस की वृद्धि और रखरखाव

  1. नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटें डालना
    1. नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) के साथ मानक 2% अगर प्लेटों पर सी एलिगेंस बढ़ाएं जिसमें 1 एमएम सीएसीएल2, 5 μg / एमएल कोलेस्ट्रॉल, 25 एमएम केपीओ4 (पीएच 6.0), 1 एमएम एमजीएसओ4, 0.25% डब्ल्यू / वी पेप्टोन, और 51.3 एमएम एनएसीएल शामिल हैं।
    2. एनजीएम-अगर प्लेटों के 1 एल के लिए, 2.5 ग्राम पेप्टोन, 3.0 ग्राम एनएसीएल, और 20 ग्राम अगर को एक हलचल बार के साथ 1 एल फ्लास्क में मापें।
      नोट: एक विशिष्ट अगर स्रोत को मानकीकृत करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि हमने ब्रांडों के बीच कठोरता में परिवर्तनशीलता देखी है, जो प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकती है। यहां, बैक्टो-आगर का सख्ती से उपयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, अगर को सीधे फ्लास्क में ऑटोक्लेव करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि अगर हीटिंग के बिना पूरी तरह से भंग नहीं होगा, और अगर युक्त समाधान को स्थानांतरित करने से अगर का नुकसान होगा और एकाग्रता में त्रुटियां होंगी।
    3. 970 एमएल तक डीएच2ओ जोड़ें।
      नोट: नसबंदी के बाद तरल योजक के 30 मिलीलीटर अंतिम मात्रा को 1 एल तक लाएगा। हमारे हाथों में, अंतिम मात्रा के 970 एमएल तक पहुंचने के लिए डीएच2ओ के ~ 951 एमएल की आवश्यकता होगी।
    4. कुशल नसबंदी के लिए एक मानक आटोक्लेव या मीडिया अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ का उपयोग करके एनजीएम-अगर समाधान को निष्फल करें।
      नोट: इस बिंदु पर, बाँझ एनजीएम-अगर कमरे के तापमान पर कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि संग्रहीत किया जाता है, तो एनजीएम-अगर को 15-45 एस दालों के साथ माइक्रोवेव में फिर से मिलाया जा सकता है ताकि समाधान को उबलने से रोका जा सके, या गर्म पानी के स्नान में।
    5. समाधान को तब तक हिलाएं जब तक कि यह 60-75 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा न हो जाए। असमान शीतलन को रोकने के लिए ठंडा करते समय सरगर्मी महत्वपूर्ण है, जिससे कुछ अगर जम सकते हैं।
    6. जबकि समाधान ठंडा हो जाता है, 65-70 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान या मनका स्नान को गर्म करें।
    7. एक बार समाधान 60-75 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाने के बाद, तरल योजक जोड़ें: 0.5 एम सीएसीएल2 का 2.0 एमएल, 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल का 1 एमएल, 1 एम केपीओ4 (पीएच 6.0) का 25 एमएल, और 0.5 एम एमजीएसओ4 (सभी अभिकर्मकों के लिए व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें), और पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए समाधान को ~ 5 मिनट के लिए मिश्रण करने की अनुमति दें।
      नोट: दवाओं को यहां प्लेटों में भी शामिल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 100 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन का 1 एमएल और 1 एम आईपीटीजी का 1 एमएल जोड़ें; 2.5 मिलीग्राम / एमएल ट्यूनिकामाइसिन के 10 एमएल जोड़ें; 400 एमएम पैराक्वाट के 10 एमएल जोड़ें)।
    8. प्लेटों में डालते समय एनजीएम-अगर को जमने से रोकने के लिए 65-70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एनजीएम-अगर युक्त फ्लास्क को डुबोएं।
    9. पिपेट प्रत्येक 60 मिमी प्लेट में समाधान के 9-11 मिलीलीटर, या प्रत्येक 100 मिमी प्लेट में समाधान के 20-30 मिलीलीटर।
      नोट: पिपेट में हवा के विस्तार के कारण एनजीएम लीक से बचने के लिए उपलब्ध सबसे छोटी पिपेट मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। पिपेट को पूरी तरह से खाली करने से बचने के लिए प्रत्येक प्लेट में जोड़े जाने की तुलना में 1-2 एमएल अधिक मीडिया को पिपेट करने से बुलबुला गठन को रोकने में मदद मिलेगी। वैकल्पिक रूप से, प्लेटों को बोतल से सीधे प्लेट में हाथ से डाला जा सकता है, लेकिन समान मात्रा वाली प्लेटों को सुनिश्चित करने के लिए पाइपिंग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। समान मात्रा प्लेटें उन तरीकों का उपयोग करते समय समाधानों की समान सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जहां समाधान सीधे प्लेट के शीर्ष पर लागू होते हैं (चरण 1.1.17 देखें)। समान मात्रा प्लेटों में एक समान फोकल विमान को बनाए रखने के लिए आसान माइक्रोस्कोपी की अनुमति देती है।
    10. तापमान बनाए रखने के लिए और एनजीएम-अगर को जमने से रोकने के लिए विंदुक को गर्म समाधान में वापस रखें।
    11. सभी प्लेटों के लिए उपरोक्त दो चरणों को दोहराएं।
    12. एनजीएम-अगर प्लेटों को रात भर जमने दें।
    13. प्लेटों के जमने के बाद, प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने तक स्टोर करें या बैक्टीरिया के साथ प्लेटों को बोने के लिए चरण 1.1.14 पर जाएं। प्लेट की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए नमी बनाए रखने में मदद करने के लिए सीलबंद कंटेनरों में प्लेटों को स्टोर करें।
    14. परिवेश के तापमान (~ 22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 24-48 घंटे के लिए लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) या पसंद के समकक्ष मीडिया में ओपी 50 की संस्कृति बढ़ाएं या एलबी + एंटीबायोटिक दवाओं में एचटी 115 की संस्कृति विकसित करें (एम्पीसिलीन /
      नोट: कमरे के तापमान पर ओपी 50 बढ़ने की सिफारिश की जाती है क्योंकि ओपी 50 की अधिक आक्रामक वृद्धि 37 डिग्री सेल्सियस पर पाई गई है, जो सी एलिगेंस जीवनकाल को प्रभावित करती है। इसके विपरीत, एचटी 115 की धीमी वृद्धि दर है और कम घनी संस्कृतियां बनाती हैं; इस प्रकार, झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एचटी 115 बढ़ने की सिफारिश की जाती है।
    15. एचटी 115 संस्कृति के 100-200 μL की मात्रा को 60 मिमी प्लेट पर, या 100 मिमी प्लेट के लिए 1 एमएल बीज करें।
    16. प्लेटों को एक बेंचटॉप पर रात भर सूखने दें और यदि प्लेटें अभी भी गीली हैं तो एक अतिरिक्त दिन सूखने दें। ~ 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सील कंटेनरों में प्लेटों की दुकान।
    17. वैकल्पिक: रासायनिक रूप से कीड़े को निष्फल करने के लिए सीधे वरीयता प्राप्त एनजीएम-अगर प्लेटों (जैसे, 10 मिलीग्राम / एमएल एफयूडीआर समाधान के 100 μL) पर दवाओं को जोड़ें।
  2. सी एलिगेंस स्टॉक को बनाए रखना
    1. एक वरीयता प्राप्त एनजीएम-अगर प्लेट के नीचे को ठीक से लेबल करें। मानक विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी पर प्रकाश के पारित होने में बाधा को रोकने के लिए प्लेट के तल पर किनारों को लेबल करें।
    2. एक मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सी एलिगेंस पिक पर पसंद के स्कूप बैक्टीरिया।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक गिलास पाश्चर पिपेट के अंत से जुड़े 90%/10% प्लैटिनम/इरिडियम तार से युक्त एक पिक का उपयोग किया गया था।
    3. बैक्टीरिया का उपयोग करके, 10-20 अंडे, एल 1, एल 2, या एल 3 जानवरों को इकट्ठा करें, और उन्हें एक नए लेबल वाले बीज वाले एनजीएम-अगर प्लेट पर स्थानांतरित करें।
      नोट: छोटे जानवरों को इकट्ठा करना सबसे अच्छा है; लेखकों के अनुभव में, मानक जंगली प्रकार के जानवरों के लिए, 10-20 अंडे / युवा जानवर को स्थानांतरित करने से प्लेट भुखमरी के बिना 15 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने की अनुमति मिलेगी। ट्रांसजेनिक या उत्परिवर्ती जानवरों के लिए कम फेकंडिटी के साथ, अधिक जानवरों को प्लेट में ले जाया जाना चाहिए।
    4. जंगली प्रकार के भ्रूणता वाले जानवरों के लिए और 15 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाते हैं, साप्ताहिक स्टॉक बनाए रखने के लिए हर 7 दिनों में चरण 1.2.1-1.2.3 दोहराएं। 20 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए जानवरों के लिए, भुखमरी को रोकने के लिए हर 4-5 दिनों में चरण 1.2.1-1.2.3 दोहराएं।
  3. कीड़े सिंक्रनाइज़ कर रहा है via विरंजन
    नोट: एक पूर्ण, 60 मिमी एनजीएम-अगर प्लेट (उदाहरण के लिए, 15 डिग्री सेल्सियस पर उगाई गई 1 सप्ताह पुरानी स्टॉक प्लेटें) वर्णित अधिकांश मानक परखों के लिए पर्याप्त संख्या में जानवर प्रदान करेगी। आम तौर पर, एक ग्रेविड वयस्क (अंडे से भरा वयस्क) 10-15 अंडे प्रदान करेगा42, और एक पूर्ण, 60 मिमी एनजीएम-अगर प्लेट में 100-200 ग्रेविड वयस्कों से कहीं भी है, जो ~ 1000-2000 अंडे प्रदान करता है।
    1. अधिक जानवरों की आवश्यकता वाले बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए, एक पूर्ण 60 मिमी एनजीएम-अगर को चार से छह बराबर टुकड़ों में काट लें और विस्तार के लिए उन्हें वरीयता प्राप्त 100 मिमी प्लेटों पर काट दें।
      नोट: यहां, चंकिंग कीड़े युक्त एनजीएम-अगर प्लेट के एक टुकड़े को काटने और अगर + कीड़े के पूरे हिस्से को एक नई प्लेट पर ले जाने के लिए संदर्भित करता है, कीड़े-साइड को नई प्लेट पर क्रॉल करने की अनुमति देने के लिए नीचे। संदर्भ के एक फ्रेम के रूप में, जंगली प्रकार के फेकंडिटी वाले जानवर चंकिंग के बाद 2-3 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाने पर एक पूर्ण 100 मिमी प्लेट का उत्पादन करेंगे।
    2. नेमाटोड को इकट्ठा करना शुरू करने के लिए, कीड़े युक्त प्लेटों पर एम 9 समाधान (तालिका 1) की एक छोटी मात्रा डालें, ध्यान रखें कि पेट्री डिश को ओवरफिल न करें। बैक्टीरियल लॉन से कीड़े को ढीला करने के लिए एम 9 समाधान को धीरे-धीरे घुमाएं।
    3. एक सीरोलॉजिकल विंदुक के साथ ग्रेविड वयस्क कीड़े ले लीजिए, विंदुक टिप के साथ अगर छेद नहीं करने के लिए ध्यान रखना।
      नोट: ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट की सिफारिश की जाती है, क्योंकि सी एलिगेंस प्लास्टिक से चिपके रहते हैं। यदि ग्लास पिपेट उपलब्ध नहीं हैं, तो आवश्यकता से बड़ी संख्या में जानवरों के साथ शुरू करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि कुछ प्लास्टिक पिपेट से चिपके रहने के कारण खो जाएंगे।
    4. 1,100 एक्स जी पर 30 एस के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा जानवरों को गोली मारो। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
      नोट: सी एलिगेंस गोली बहुत ढीली है, इसलिए ध्यान रखें कि सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करते समय गोली को हिलाएं या बाधित न करें।
    5. जबकि जानवर सेंट्रीफ्यूजिंग कर रहे हैं, प्रति तनाव 5 मिलीलीटर विरंजन समाधान तैयार करें (नुस्खा विवरण के लिए तालिका 1 देखें); समाधान के 5 एमएल के लिए, 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) के 1.5 एमएल, 5 एम एनएओएच या केओएच के 0.75 एमएलऔर डीएच 2ओ के 2.75 एमएल मिलाएं।
      सावधानी: सोडियम हाइपोक्लोराइट और उच्च सांद्रता हाइड्रॉक्साइड समाधान संक्षारक हैं, और इस प्रकार हैंडलिंग करते समय दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पहनने की सिफारिश की जाती है।
    6. एम 9 मिश्रण में 5 मिलीलीटर विरंजन समाधान जोड़ें।
    7. सभी वयस्क कृमि निकायों को भंग कर दिया गया है और केवल अंडे मिश्रण में छोड़ रहे हैं जब तक हर कुछ मिनट एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कीड़े की जाँच करें। ब्लीचिंग प्रक्रिया को तेज करने के लिए कृमि /ब्लीच मिश्रण को सख्ती से हिलाएं।
      नोट: विस्तारित अवधि के लिए ब्लीच मिश्रण के अंदर अंडे छोड़ने से अंडे को नुकसान होगा और जानवरों की व्यवहार्यता प्रभावित होगी। जंगली प्रकार के जानवरों के लिए, विरंजन में आमतौर पर झटकों के साथ 4-6 मिनट लगते हैं। इस प्रकार, 4 मिनट के निशान से शुरू होने वाले 30 एस अंतराल पर माइक्रोस्कोप के तहत जानवरों की जांच करने की सिफारिश की जाती है।
    8. ब्लीच मिश्रण को 1,100 एक्स जी पर 30 एस के लिए कताई करके अंडे को गोली दें।
      नोट: कुछ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों ट्यूब के अंदर ढाल लाइनों है। इन ट्यूबों के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए उच्च गति (जैसे, 2,000 एक्स जी पर 30 एस) पर अंडे स्पिन करने की सिफारिश की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंडे ट्यूब के नीचे गोली और ढाल लाइनों पर न रहें।
    9. विरंजन समाधान को बाहर निकालें।
      नोट: एक अंडे की गोली एक कृमि गोली की तुलना में कठोर है, लेकिन अभी भी आसानी से बाधित किया जा सकता है। इसलिए, ध्यान रखें कि सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद ट्यूब को हिलाएं नहीं।
    10. 15 एमएल तक एम 9 समाधान जोड़कर अंडे धोएं और ट्यूब को चार या पांच बार उलटकर यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडे एम 9 समाधान में पूरी तरह से बिखरे हुए हैं।
    11. 1,100 एक्स जी पर 30 एस के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा गोली अंडे और एम 9 समाधान की आकांक्षा।
    12. अंडे के मिश्रण से किसी भी ब्लीच को खत्म करने के लिए कुल चार वॉश के लिए उपरोक्त दो चरणों को दोहराएं।
    13. अंतिम धोने के बाद 100 μL से 2 मिलीलीटर M9 समाधान (यानी, प्रक्षालित कीड़े की कुल संख्या के आधार पर) में अंडे को फिर से निलंबित करें। गुच्छों को तोड़ने के लिए अंडे को अच्छी तरह से हिलाएं और सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से निलंबित हो गई है।
    14. वैकल्पिक रूप से, जानवरों को एक तंग अस्थायी सिंक्रनाइज़ेशन के लिए एल 1 गिरफ्तार किया जा सकता है; एल 1 गिरफ्तारी के लिए, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ~ 10 एमएल में अंडे की गोली में एम 9 समाधान जोड़ें। कीड़े को 20 डिग्री सेल्सियस या परिवेश के तापमान पर 24 घंटे तक रोटेटर में स्पिन करने दें। एल 1 जानवरों को आमतौर पर चरण 1.3.16 में वर्णित अंडे के समय की तुलना में वयस्कता तक पहुंचने में आधा दिन कम लगता है।
    15. बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम-प्लेट पर अंडे / एम 9 मिश्रण के 4 μL पाइपिंग द्वारा अंडे की एकाग्रता (या एल 1 एकाग्रता; चरण 1.3.14 देखें) का अनुमान लगाएं। गिनती और गणना करें कि प्रति μL चढ़ाया कितने अंडे मौजूद हैं। सन्निकटन में सुधार करने के लिए गिनती को तीन या चार बार दोहराएं।
      नोट: अंडे की एकाग्रता का अनुमान लगाना यह सुनिश्चित करेगा कि पर्याप्त जानवरों को ओवरप्लेटिंग के बिना प्रयोगों के लिए उपयुक्त नमूना आकार के लिए चढ़ाया जाता है, जो भुखमरी का कारण होगा।
    16. सन्निकटन के आधार पर, पसंद के बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम-अगर प्लेटों पर अंडे की उचित संख्या प्लेट करें। ओपी 50 प्लेटों के लिए, 60 मिमी प्लेट पर अधिकतम 200 जानवरों और 100 मिमी प्लेट पर 1,000 जानवरों को प्लेट करें। एचटी 115 प्लेटों के लिए, 60 मिमी प्लेट पर अधिकतम 150 जानवरों और 100 मिमी प्लेट पर 600 जानवरों को प्लेट करें।
      नोट: ये हमारी प्रयोगशाला स्थितियों के आधार पर अनुमानित संख्याएं हैं, और बैक्टीरिया लॉन की मोटाई के आधार पर संख्याएं बदल सकती हैं। 15 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाने वाले अंडे को दिन 1 वयस्कता तक पहुंचने में ~ 5 दिन लगेंगे (अंडे देने वाले अधिकतम, ग्रेविड वयस्क चरण तक पहुंचने के लिए ~ 140 घंटे)। 20 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाने वाले अंडे को दिन 1 वयस्कता तक पहुंचने में ~ 4 दिन लगेंगे (अंडे देने वाले अधिकतम, ग्रेविड वयस्क चरण तक पहुंचने के लिए ~ 96 घंटे)। 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाने वाले अंडे को दिन 1 वयस्कता तक पहुंचने में ~ 3.5 दिन लगेंगे (अंडे देने वाले अधिकतम, ग्रेविड वयस्क चरण तक पहुंचने के लिए ~ 62 घंटे)।
  4. सी एलिगेंस आबादी को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में अंडा-ले
    1. यदि विरंजन प्रोटोकॉल संभव नहीं हैं (उदाहरण के लिए, कोई अपकेंद्रित्र उपलब्ध नहीं है), सी एलिगेंस की आबादी को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में, एक अंडा-ले प्रक्रिया करें। ध्यान रखें कि यह प्रोटोकॉल अधिक श्रम-गहन है और इसके परिणामस्वरूप जानवरों की छोटी पैदावार होगी।
    2. अंडे देने के लिए, पसंद के बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त मानक एनजीएम-अगर प्लेट पर 8-12 ग्रेविड वयस्कों को रखें और प्लेट पर रखे गए जानवरों की सटीक संख्या का दस्तावेजीकरण करें।
      नोट: अंडे-ले प्रक्रियाओं को उस तापमान पर किया जाना चाहिए जिसका उपयोग प्रयोग के लिए किया जाएगा।
    3. जानवरों को 4-8 घंटे के लिए अंडे देने की अनुमति दें।
      नोट: अवधि जानवरों प्लेट पर छोड़ दिया जाता है जब जरूरत होती है समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कम समय उपलब्ध होने पर बड़ी संख्या में जानवरों को कम अंडा देने की अवधि के लिए प्लेट पर रखा जा सकता है। एलिगेंस आम तौर पर फटने में अंडे देते हैं, जिसका अनुमान जंगली प्रकार के फेकंडिटीवाले जानवरों के लिए लगभग पांच अंडे / ओवरप्लेटिंग जानवरों से बचने के लिए चरण 1.3.16 में सिफारिशों का पालन करें।
    4. प्लेट से सभी वयस्क जानवरों को निकालें।
      नोट: प्लेट पर छोड़े गए किसी भी वयस्क जानवर अंडे देना जारी रखेंगे, जिसके परिणामस्वरूप एक अतुल्यकालिक आबादी होगी।
    5. दिन 1 वयस्कता तक पहुंचने के लिए ~ 5 दिनों के लिए 15 डिग्री सेल्सियस या ~ 4 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर अंडे रखें।

2. सी एलिगेंस में दीर्घायु को मापना

  1. मानक जीवनकाल
    1. पसंद के बैक्टीरिया के 100 μL के साथ प्लेटों को बोने से एनजीएम-अगर प्लेटें तैयार करें। स्थिरता के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिकृतियों में एक ही बैक्टीरिया का उपयोग किया जाता है। चूंकि वयस्कता के अंडे देने के चरणों के दौरान हर दिन कीड़े ले जाया जाता है, इसलिए जीवनकाल की अवधि के लिए एनजीएम-अगर प्लेटों के पांच से सात सेट बीज, और जानवरों को वयस्कता में विकसित करने के लिए प्रति तनाव दो से चार प्लेटें (यानी, यदि जीवनकाल के लिए 15 जानवरों की आठ प्लेटों का उपयोग करते हैं, तो किसी को प्रति स्थिति 40-56 प्लेटों को बीज करने की आवश्यकता होती है)।
    2. प्लेटों को भंडारण से पहले रात भर सूखने दें।
      नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाए, और बैक्टीरिया को मोटी लॉन बनाने से रोकने के लिए रोजाना कोल्ड स्टोरेज से प्लेटों की आवश्यक संख्या को हटा दिया जाए जो चलती / सुनिश्चित करें कि प्लेटों को चढ़ाना कीड़े से पहले गर्म किया जाता है।
    3. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए।
    4. 8-12 प्लेटों पर 10-15 दिन 1 वयस्क जानवरों को स्थानांतरित करें। एक मानक जीवनकाल के लिए, ~ 120 जानवरों के साथ शुरू करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेंसरशिप घटनाओं के बाद नमूना आकार 100 से बहुत नीचे नहीं गिरता है (उदाहरण के लिए, 15 जानवरों की आठ प्लेटें = 120 जानवर; 10 जानवरों की 12 प्लेटें = 120 जानवर)।
      नोट: वर्तमान मामले में, 10-15 जानवर अधिकांश जांचकर्ताओं के लिए एक प्रबंधनीय संख्या हैं, हालांकि 20 जानवरों की छह प्लेटें उपभोग्य सामग्रियों की लागत को कम करने के लिए भी संभव है।
    5. पहले 7-8 दिनों के लिए या जब तक संतान अब दिखाई नहीं देती है, वयस्क जानवरों को हर 1-2 दिनों में अपनी संतान से दूर ले जाएं।
      नोट: सामग्री को बचाने के लिए जानवरों को हर दूसरे दिन ले जाया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि संतान के साथ वयस्क आबादी के संदूषण को रोकने के लिए वयस्क के साथ अंडे / लार्वा जानवरों को स्थानांतरित नहीं किया जाता है। इस अध्ययन में, सबसे सरल तरीका 1-3 दिनों से हर दिन जानवरों को स्थानांतरित करना है जब अंडे देना अपने अधिकतम पर होता है, और फिर 5-8 दिनों के लिए हर दूसरे दिन जानवरों को स्थानांतरित करने के लिए स्विच करें जब अंडे देना न्यूनतम होता है। इस पद्धति के साथ, 1-3 दिनों के दौरान अंडे / लार्वा जानवरों के हस्तांतरण को रोकना आवश्यक नहीं है क्योंकि वयस्कों को हर दिन स्थानांतरित किया जाएगा, और अंडे / लार्वा 1 दिन में वयस्कता में विकसित नहीं हो सकते हैं।
    6. जानवरों ने संतान पैदा करना बंद कर दिया है, हर दूसरे दिन जीवनकाल स्कोर करें जब तक कि सभी जानवरों को मृत या सेंसर के रूप में स्कोर नहीं किया जाता है। भ्रम से बचने और एक ही जानवर को याद करने के लिए प्लेट से सभी मृत या सेंसर किए गए जानवरों को हटा दें।
      नोट: मृत्यु उन जानवरों के रूप में बनाई जाती है जो धीरे-धीरे पिक के साथ छूने पर कोई आंदोलन प्रदर्शित नहीं करते हैं। सेंसरशिप को उन जानवरों के रूप में स्कोर किया जाता है जो बैग किए जाते हैं, वल्वल / आंतों के फलाव का प्रदर्शन करते हैं, या प्लेट के किनारों तक क्रॉल करते हैं जहां वे डेसिकेट करते हैं।
  2. एफयूडीआर का उपयोग करके रासायनिक नसबंदी के साथ जीवनकाल
    1. पसंद के बैक्टीरिया के 100 μL के साथ प्लेटों को बोने से एनजीएम-अगर प्लेटें तैयार करें। स्थिरता के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिकृतियों में एक ही बैक्टीरिया का उपयोग किया जाता है। जीवनकाल प्रयोगों के लिए तनाव प्रति बीज 8-12 प्लेटें, और जानवरों को वयस्कता में विकसित करने के लिए प्रति तनाव दो से चार प्लेटें। प्लेटों को रात भर सूखने दें।
    2. 8-12 प्लेटों के लिए बैक्टीरिया लॉन के बीच में 10 मिलीग्राम / एमएल एफयूडीआर के 100 μL जोड़ें जो जीवनकाल परख के लिए उपयोग किया जाएगा। जानवरों को वयस्कता तक बढ़ने की अनुमति देने के लिए स्टार्टर प्लेटों के रूप में एफयूडीआर के बिना दो से चार प्लेटों को छोड़ना याद रखें। प्लेटों को रात भर सूखने दें।
      सावधानी: एफयूडीआर डीएनए संश्लेषण को अवरुद्ध करता है, और इस प्रकार हैंडलिंग करते समय दस्ताने पहनने की सिफारिश की जाती है।
    3. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए।
      नोट: इन जानवरों को एफयूडीआर के बिना प्लेटों पर उगाया जाना चाहिए, क्योंकि एफयूडीआर जानवरों को गिरफ्तार करने / मरने का कारण होगा।
    4. एफयूडीआर युक्त प्रत्येक 8-12 प्लेटों पर 10-15 दिन 1 वयस्क जानवरों को स्थानांतरित करें। एक मानक जीवनकाल के लिए, ~ 120 जानवरों के साथ शुरू करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेंसरशिप घटनाओं के बाद नमूना आकार 100 से बहुत नीचे नहीं गिरता है (उदाहरण के लिए, 15 जानवरों की आठ प्लेटें = 120 जानवर; 10 जानवरों की 12 प्लेटें = 120 जानवर)।
      नोट: जानवरों को एल 4 चरण में एफयूडीआर पर भी ले जाया जा सकता है यदि यह जरूरी है कि संतान गठन से पूरी तरह से बचा जाए, लेकिन जानवरों को बहुत जल्दी स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इससे जानवरों को वल्वल / आंतों के फलाव के लिए उच्च जोखिम होगा और सेंसरशिप में वृद्धि होगी।
    5. स्कोर जीवनकाल हर दूसरे दिन जब तक सभी जानवरों को मृत या सेंसर के रूप में स्कोर किया गया है। भ्रम से बचने और एक ही जानवर को याद करने के लिए प्लेट से सभी मृत या सेंसर किए गए जानवरों को हटा दें।
      नोट: एफयूडीआर जीवनकाल के लिए, किसी भी संतान को नजरअंदाज किया जा सकता है क्योंकि वे एल 1 चरण में गिरफ्तार होंगे और अंततः मर जाएंगे।
  3. तापमान संवेदनशील बाँझ म्यूटेंट का उपयोग कर जीवनकाल
    1. पसंद के बैक्टीरिया के 100 μL के साथ प्लेटों को बोने से एनजीएम-अगर प्लेटें तैयार करें। स्थिरता के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिकृतियों में एक ही बैक्टीरिया का उपयोग किया जाता है। जीवनकाल प्रयोगों के लिए प्रति तनाव 8-12 प्लेटें बीज, और वयस्कता के लिए जानवरों को विकसित करने के लिए प्रति तनाव 2-4 प्लेटें। प्लेटों को रात भर सूखने दें।
    2. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए। जानवरों को बाँझ बनाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के प्रतिबंधात्मक तापमान पर जानवरों को उगाना याद रखें।
    3. 8-12 प्लेटों पर 10-15 दिन 1 वयस्क जानवरों को स्थानांतरित करें। एक मानक जीवनकाल के लिए, ~ 120 जानवरों के साथ शुरू करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेंसरशिप घटनाओं के बाद नमूना आकार 100 से बहुत नीचे नहीं गिरता है (उदाहरण के लिए, 15 जानवरों की आठ प्लेटें = 120 जानवर; 10 जानवरों की 12 प्लेटें = 120 जानवर)।
    4. स्कोर जीवनकाल हर दूसरे दिन जब तक सभी जानवरों को मृत या सेंसर के रूप में स्कोर किया गया है। भ्रम से बचने और एक ही जानवर को याद करने के लिए प्लेट से सभी मृत या सेंसर किए गए जानवरों को हटा दें।
      नोट: अल्पकालिक उपभेदों से निपटने के दौरान, हर दिन जीवनकाल स्कोर करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि 25 डिग्री सेल्सियस पर जीवनकाल बहुत कम होता है और इस प्रकार गतिशील सीमा सीमित होती है। लेखकों के अनुभव में, जानवरों को दिन 2 के बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर वापस स्थानांतरित किया जा सकता है, और जानवर बाँझ रहेंगे यदि 20 डिग्री सेल्सियस पर जीवनकाल स्कोर करना बेहतर है।

3. सी एलिगेंस में हेल्थस्पैन को मापना

  1. पिटाई के माध्यम से लोकोमोटरी व्यवहार का मापन
    1. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए।
    2. एम 9 समाधान के 10-20 μL पर एक विदारक गुंजाइश के तहत एक एनजीएम-अगर प्लेट पर दिन 1 वयस्क कीड़े की एक छोटी कॉलोनी ले जाएँ। 10-15 जानवरों को गिनती करने के लिए जानवरों की प्रबंधनीय संख्या के रूप में अनुशंसित किया जाता है।
    3. एक समय में एक कीड़े पर ध्यान केंद्रित करते हुए, 15 एस में अवतल से उत्तल गठन के लिए नमूना स्विच की संख्या की गणना करें। एक हाथ काउंटर और एक टाइमर का प्रयोग करें ताकि परख की अवधि के लिए कीड़े पर ध्यान केंद्रित किया जा सके।
      नोट: प्लेट का एक वीडियो अधिक गहन / आसान विश्लेषण के लिए रिकॉर्ड किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मानक माइक्रोस्कोप आईपीस अटैचमेंट अधिकांश स्मार्टफोन और डिजिटल कैमरों ($ 15- $ 30) के लिए उपलब्ध हैं, और ये कम लागत पर वीडियो थ्रैशिंग के लिए एक बढ़िया विकल्प हैं।
    4. तरल में अन्य कीड़े के लिए चरण 3.1.3 दोहराएं, 10-15 कीड़े के लिए कुल गतिशीलता दर का औसत। उच्च नमूना आकार के लिए, चरण 3.1.2-3.1.4 दोहराएँ।
    5. वांछित उम्र के लिए कीड़े की उम्र। चरण 2.1-2.3 में वर्णित जीवनकाल परख के लिए इसी तरह के तरीकों का उपयोग कीड़े से उम्र बढ़ने के लिए किया जा सकता है। वांछित उम्र में थ्रैशिंग परख करने के लिए चरण 3.1.2-3.1.4 दोहराएं।
      नोट: चरण 3.1.2 के लिए एक वैकल्पिक विधि एक प्लेट पर कीड़े के एक समूह पर ~ 30 μL या अधिक M9 समाधान जोड़ने के लिए है। यह कीड़े को मैन्युअल रूप से स्थानांतरित करने से समय बचाएगा, हालांकि यादृच्छिक संभावना के कारण जहां कीड़े एक प्लेट पर हैं, इस बात की कोई गारंटी नहीं है कि कीड़े का एक समूह प्लेट पर एक ही बिंदु पर रहेगा।
  2. सी एलिगेंस में फेकंडिटी (अंडे की गिनती) का मापन
    1. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए। अंडे की गिनती के लिए परख एल 4 चरण में शुरू होती है, जो दिन 1 वयस्कता से ~ 1 दिन पहले होती है (~ 3 दिन 15 डिग्री सेल्सियस पर या ~ 2 दिन एल 1 गिरफ्तारी के बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर)।
    2. पसंद के बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त अलग एनजीएम-अगर प्लेटों पर एल 4 कीड़े को सिंगल आउट करें। यह अनुशंसा की जाती है कि ~ 10-15 जानवरों का उपयोग फेकंडिटी परख के लिए किया जाए।
      नोट: बैक्टीरिया लॉन में अंडे की दृश्यता में सुधार करने के लिए पसंद के बैक्टीरिया को 50% (यानी, संतृप्त संस्कृति नहीं) तक पतला करने की सिफारिश की जाती है।
    3. जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें। सुनिश्चित करें कि प्लेटों का एक नया बीज वाला बैच अगले दिन के लिए तैयार है।
    4. वयस्कता के दिन 1 पर, पसंद के पतला बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त ताजा एनजीएम-अगर प्लेटों पर वयस्क कीड़े स्थानांतरित करें।
      नोट: मोटी बैक्टीरिया लॉन को रोकने के लिए उपयोग किए जाने तक ताजा वरीयता प्राप्त प्लेटों का उपयोग करने या 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को स्टोर करने की सिफारिश की जाती है।
    5. प्रत्येक एनजीएम-अगर प्लेट पर रखे गए अंडों की कुल संख्या की गणना करें।
      नोट: प्लेट को स्कैन करने में सहायता के लिए, एक ग्रिड को प्लेट के ढक्कन पर खींचा जा सकता है और अंडे के लिए बनाई जा रही प्लेट के नीचे रखा जा सकता है। प्लेट को तब ग्रिड लाइनों के साथ स्कैन किया जा सकता है ताकि अभिविन्यास बनाए रखा जा सके क्योंकि प्लेट को स्थानांतरित किया जाता है और किसी भी अंडे के पुनर्गणना को रोका जाता है।
    6. 7-8 दिनों के लिए या जब तक प्लेट पर अंडे दिखाई नहीं देते हैं, तब तक चरण 3.2.4-3.2.5 दोहराएं।
      नोट: 1-3 दिनों के लिए जब अंडे देने की दर अधिक होती है, तो जानवरों को कम से कम हर 12 घंटे में स्थानांतरित करने की सिफारिश की जाती है और दिन में दो बार परख अंडे की गिनती होती है। हालांकि, यह उपभोग्य सामग्रियों के काम और लागत की मात्रा को बढ़ाता है, और इस प्रकार जानवरों और मापों को प्रति दिन एक बार तक सीमित किया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि सभी अंडे और हैच किए गए जानवरों को ठीक से गिना जाए। किसी भी हैच किए गए जानवरों को इस परख के उद्देश्य से अंडे के रूप में गिना जाता है।
  3. सी एलिगेंस संतान के ब्रूड आकार (विकास) का मापन
    1. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए। ब्रूड आकार के लिए परख एल 4 चरण में शुरू होती है, जो दिन 1 वयस्कता से ~ 1 दिन पहले होती है (~ 3 दिन 15 डिग्री सेल्सियस पर या ~ 2 दिन एल 1 गिरफ्तार करने के बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर)।
    2. पसंद के बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त अलग एनजीएम-अगर प्लेटों पर एल 4 कीड़े को सिंगल आउट करें। यह अनुशंसा की जाती है कि ~ 10-15 जानवरों का उपयोग फेकंडिटी परख के लिए किया जाए।
    3. जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें। सुनिश्चित करें कि प्लेटों का एक नया बीज वाला बैच अगले दिन के लिए तैयार है।
    4. वयस्कता के दिन 1 पर, पसंद के बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त ताजा एनजीएम-अगर प्लेटों पर वयस्क कीड़े स्थानांतरित करें।
    5. हर 12-24 घंटे (दिन में 2x या दिन में 1x), 7-8 दिनों के लिए पसंद के बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त ताजा एनजीएम-अगर प्लेटों पर वयस्क कीड़े स्थानांतरित करें या जब तक कि संतान अब दिखाई न दे। अंडे वाली सभी प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    6. चरण 3.3.5 को 7-8 दिनों के लिए दोहराएं या जब तक संतान अब दिखाई नहीं देती है। अंडे वाली सभी प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: संतान प्लेटों को स्कोर करने की आवश्यकता से पहले समय का विस्तार करने के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. कीड़े स्थानांतरित करने के दो दिन बाद, प्लेटों पर विकसित संतानों की गिनती करें। एल 4 चरण में विकासशील कीड़े की गिनती करें (यानी, 20 डिग्री सेल्सियस पर हैच के 2 दिन बाद) या उससे पहले यह सुनिश्चित करने के लिए कि एफ 2 पीढ़ी (यानी, संतान की संतान) परिणामों को भ्रमित नहीं करती है। जीवित सभी कीड़े गिनें।
      1. प्लेट से सभी कीड़े निकालें क्योंकि वे गिने जाते हैं। प्लेटों को फिर से स्कोर करने से पहले अतिरिक्त 1-2 दिनों के लिए बनाए रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि विलंबित हैचिंग / विकास वाले किसी भी जानवर को याद नहीं किया जाता है।
    8. एकत्र किए गए प्रत्येक अंडे-लेट प्लेट के लिए चरण 3.3.7 दोहराएं।
      नोट: ब्रूड आकार परख एक प्रयोग से डेटा के दो सेट एकत्र करके श्रम और उपभोग्य सामग्रियों की लागत को कम करने के लिए अंडे की गिनती परख (चरण 3.2) के साथ संयोजन के रूप में आयोजित किया जा सकता है। यह एक ही जानवरों के भीतर ब्रूड आकार और अंडे की गिनती की सीधी तुलना की भी अनुमति देगा।

4. सी एलिगेंस में तनाव लचीलापन को मापना

  1. ट्यूनिकामाइसिन का उपयोग करके ईआर तनाव संवेदनशीलता का मापन
    1. पसंद के बैक्टीरिया के 100 μL के साथ ट्यूनिकामाइसिन युक्त प्लेटों को बोने से एनजीएम-अगर प्लेटें तैयार करें (चरण 1.1.7, नोट देखें)।
      सावधानी: ट्यूनिकामाइसिन को संभालते समय दस्ताने पहने जाने चाहिए।
    2. स्थिरता के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिकृतियों में एक ही बैक्टीरिया का उपयोग किया जाता है। उत्तरजीविता परख के लिए प्रति तनाव 8-12 ट्यूनिकामाइसिन प्लेटें, और जानवरों को वयस्कता में विकसित करने के लिए प्रति तनाव ट्यूनिकामाइसिन के बिना दो से चार प्लेटें। प्लेटों को रात भर सूखने दें।
    3. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए।
      नोट: जानवरों को वयस्कता के दिन 1 तक ट्यूनिकामाइसिन के बिना प्लेटों पर उगाया जाना चाहिए, क्योंकि जानवर ट्यूनिकामाइसिन पर गिरफ्तार /
    4. 8-12 प्लेटों पर 10-15 दिन 1 वयस्क जानवरों को स्थानांतरित करें। एक मानक अस्तित्व परख के लिए, ~ 120 जानवरों के साथ शुरू करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेंसरशिप घटनाओं के बाद नमूना आकार 100 से बहुत नीचे नहीं गिरता है (उदाहरण के लिए, 15 जानवरों की आठ प्लेटें = 120 जानवर; 10 जानवरों की 12 प्लेटें = 120 जानवर)।
      नोट: एफयूडीआर परख के समान, ट्यूनिकामाइसिन उत्तरजीविता परख जानवरों को स्थानांतरित किए बिना किया जा सकता है, क्योंकि ट्यूनिकामाइसिन एल 1 जानवरों की मृत्यु / गिरफ्तारी का कारण बनता है। हालांकि, डीएमएसओ नियंत्रण करते समय, संतान डीएमएसओ प्लेटों पर विकसित होगी, इसलिए जानवरों को दैनिक रूप से स्थानांतरित करने की आवश्यकता होगी या नसबंदी तकनीक की आवश्यकता होगी (जीवनकाल के लिए धारा 2 में उपयोग किए जाने वाले समान तरीकों का उपयोग जीवित रहने के परख के लिए किया जा सकता है)।
    5. उत्तरजीविता परख जीवनकाल के समान स्कोर किए जाते हैं। भ्रम से बचने और एक ही जानवर को याद करने के लिए प्लेट से सभी मृत या सेंसर किए गए जानवरों को हटा दें।
      नोट: यद्यपि हर दूसरे दिन जानवरों को स्कोर करना संभव है, क्योंकि मृत्यु ट्यूनिकामाइसिन पर तेजी से होती है, इसलिए दैनिक रूप से जीवित रहने की परख स्कोर करने की सिफारिश की जाती है।
  2. पैराक्वाट का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल / ऑक्सीडेटिव तनाव संवेदनशीलता का मापन
    1. पैराक्वाट युक्त प्लेटों को बोने से एनजीएम-अगर प्लेटें तैयार करें (चरण 1.1.7 देखें; नोट) पसंद के बैक्टीरिया के 100 μL के साथ।
      सावधानी: पैराक्वाट को संभालते समय दस्ताने पहने जाने चाहिए क्योंकि यह एक पर्यावरणीय खतरा है। त्यागने की आवश्यकताओं के लिए संस्थान के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा के साथ जांच करें, क्योंकि कई शोध संस्थानों को पर्यावरणीय खतरों के लिए विशिष्ट त्याग निर्देशों की आवश्यकता होगी।
    2. स्थिरता के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिकृतियों में एक ही बैक्टीरिया का उपयोग किया जाता है। उत्तरजीविता परख के लिए प्रति तनाव 8-12 प्लेटें बीज, और जानवरों को वयस्कता में विकसित करने के लिए प्रति तनाव पैराक्वाट के बिना दो से चार प्लेटें। प्लेटों को रात भर सूखने दें।
    3. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए।
      नोट: वयस्कता के दिन 1 तक पैराक्वाट के बिना प्लेटों पर जानवरों को उगाना याद रखें; हालाँकि, नसबंदी तकनीक करना या वयस्कों को संतान से दूर ले जाना आवश्यक है, क्योंकि कुछ जानवर पैराक्वाट प्लेटों पर वयस्कता में विकसित हो सकते हैं (चरण 2.2-2.3 देखें)।
    4. 8-12 प्लेटों पर 10-15 दिन 1 वयस्क जानवरों को स्थानांतरित करें। एक मानक अस्तित्व परख के लिए, ~ 120 जानवरों के साथ शुरू करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना आकार सेंसरशिप घटनाओं के बाद 100 से नीचे बहुत कम नहीं होता है (उदाहरण के लिए, 15 जानवरों की आठ प्लेटें = 120 जानवर; 10 जानवरों की 12 प्लेटें = 120 जानवर)।
    5. उत्तरजीविता परख जीवनकाल के समान स्कोर किए जाते हैं। भ्रम से बचने और एक ही जानवर को याद करने के लिए प्लेट से सभी मृत या सेंसर किए गए जानवरों को हटा दें।
      नोट: यद्यपि हर दूसरे दिन जानवरों को स्कोर करना संभव है, क्योंकि मृत्यु पैराक्वाट पर तेजी से होती है, इसलिए दैनिक रूप से जीवित रहने की परख स्कोर करने की सिफारिश की जाती है। यह विशेष रूप से सच है जब 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए जीएलपी -4 (बीएन 2) जानवरों का उपयोग करते हैं क्योंकि मृत्यु बहुत तेजी से होगी।
  3. ऊंचे तापमान का उपयोग करके गर्मी तनाव संवेदनशीलता (थर्मोटॉलरेंस) का मापन
    1. चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित के रूप में एक मानक विरंजन परख का उपयोग कर सी एलिगेंस की एक सिंक्रनाइज़ आबादी ले लीजिए।
    2. कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटों को रखकर प्लेटों पर जानवरों को स्थानांतरित करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म एनजीएम-अगर प्लेटें।
    3. प्रत्येक चार से छह पूर्व-गर्म प्लेटों पर 10-15 दिन 1 वयस्क जानवरों को स्थानांतरित करें। एक मानक थर्मोटॉलरेंस के लिए, ~ 60 जानवरों से शुरू करें (उदाहरण के लिए, 15 जानवरों की चार प्लेटें = 60 जानवर; 10 जानवरों की छह प्लेटें = 60 जानवर)
    4. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जानवरों प्लेस और हर 2 घंटे मौत के लिए स्कोर। मृत्यु को उन जानवरों के रूप में परिभाषित किया गया है जो धीरे-धीरे पिक के साथ छूने पर कोई आंदोलन प्रदर्शित नहीं करते हैं। भ्रम से बचने और एक ही जानवर को याद करने के लिए प्लेट से सभी मृत या सेंसर किए गए जानवरों को हटा दें।
    5. सुनिश्चित करें कि प्लेटों को न्यूनतम समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से हटा दिया जाता है, क्योंकि स्कोरिंग करते समय लंबी अवधि के लिए परिवेश के तापमान पर छोड़ी जाने वाली प्लेटें थर्मोटॉलरेंस परिणामों को बदल देंगी।
      नोट: स्कोर करने के लिए एक समय में केवल एक तनाव खींचने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि अगर का तापमान एक तनाव स्कोर करने में लगने वाले समय में नाटकीय रूप से नहीं बदलना चाहिए।
    6. औसत थर्मोटॉलरेंस आमतौर पर 7-9 घंटे में पूरा किया जाता है; इसलिए, 7 घंटे, 9 घंटे और 11 घंटे पर एक उचित परख सुनिश्चित करें।
      नोट: जबकि 1-5 घंटे छोड़ा जा सकता है, इनक्यूबेटरों की परिवर्तनशीलता, प्लेटों की मोटाई और प्रत्येक प्रयोगशाला में अन्य भ्रमित कारकों के कारण, यह महत्वपूर्ण है कि समय को प्रत्येक प्रयोगशाला में सावधानीपूर्वक शीर्षक दिया जाए यदि टाइमपॉइंट्स को छोड़ने की योजना बनाई गई है। थर्मोटॉलरेंस पर एक पूर्ण गाइड के लिए संदर्भ 44 देखें।
    7. वैकल्पिक रूप से, 37 डिग्री सेल्सियस के बजाय 34 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोटॉलरेंस परख करें।
      नोट: 34 डिग्री सेल्सियस पर औसत थर्मोटॉलरेंस बहुत बाद में होता है (इस अध्ययन में 10-14 घंटे), जो देर रात में थर्मोटॉलरेंस परख तैयार करने की अनुमति देता है (34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा गया), और स्कोरिंग के लिए अगले दिन जल्दी शुरू करने के लिए। यह एक 37 डिग्री सेल्सियस थर्मोटॉलरेंस परख के लिए आवश्यक ठेठ 12 घंटे की अवधि के बजाय निरंतर स्कोरिंग के ~ 8 घंटे के लिए अनुमति देता है।

Representative Results

एलिगेंस उम्र बढ़ने के अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव हैं क्योंकि उम्र बढ़ने के तंत्र का एक बड़ा बहुमत मनुष्यों के साथ संरक्षित किया जा रहा है। महत्वपूर्ण बात यह है कि उपकरणों और उपभोग्य सामग्रियों के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ रखरखाव और प्रयोग में उनकी लागत बहुत कम है, जिससे वे सीमित धन वाले संस्थानों के लिए एक प्रतिष्ठित मॉडल प्रणाली बन जाते हैं। इसके अलावा, उथले सीखने घटता के साथ सरल परख की एक बहुतायत उन्हें भी कम से कम अनुभव के साथ सबसे कम उम्र के अन्वेषक के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली बनाता है। जीनोम संपादन में आसानी, नाममात्र की लागत पर हजारों उपलब्ध म्यूटेंट और ट्रांसजेनिक जानवरों सहित सी एलिगेंस के शक्तिशाली आनुवंशिकी के साथ संयुक्त ये सभी कारक, और लगभग हर जीन के आनुवंशिक नॉकडाउन के लिए उपलब्ध आरएनएआई पुस्तकालय उन्हें स्नातक संस्थानों के लिए एक आदर्श प्रणाली बनाते हैं। एलिगेंस में उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए सबसे कम लागत वाले तरीकों में से कुछ का सर्वेक्षण किया जाता है, मुख्य रूप से न्यूनतम उपकरण और उपभोग्य लागत के साथ-साथ उथले सीखने के घटता के साथ परख पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। वास्तव में, प्रोटोकॉल और डेटा संग्रह की संपूर्णता जूनियर जांचकर्ताओं द्वारा <5 महीने के शोध अनुभव के साथ लिखी / प्रदर्शन की गई थी, ज्यादातर स्नातक छात्र।

एलिगेंस में दीर्घायु अध्ययन जानवरों के छोटे जीवनकाल के कारण बहुत सरल हैं, 14-20 दिनों तक। महत्वपूर्ण रूप से, जीवनकाल परख अत्यधिक मानकीकृत हैं और केवल एनजीएम-अगर प्लेटों को तैयार करने के लिए एक इनक्यूबेटर, एक मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप, एक मानक कृमि पिक और उपभोग्य सामग्रियों की आवश्यकता होती है। शायद सी एलिगेंस में जीवनकाल माप का सबसे अधिक लागत-निषेधात्मक पहलू उपभोग्य सामग्रियों की आवश्यकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि सी एलिगेंस हेर्मैफ्रोडाइट्स हैं जो आत्म-निषेचित होते हैं; इसलिए, दीर्घायु परख के लिए ट्रैक किए जा रहे वयस्कों को दैनिक संतान से दूर ले जाने की आवश्यकता है। हालांकि, जानवरों को एफयूडीआर को उजागर करके या म्यूटेंट का उपयोग करके निष्फल किया जा सकता है, जैसे कि तापमान-संवेदनशील जर्मलाइन-कम जीएलपी -4 (बीएन 2) उत्परिवर्ती30,31,32 की आवश्यकता वाले उपभोग्य सामग्रियों की मात्रा को कम करने के लिए निषेधात्मक 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है। यहां, जीवनकाल परख एफयूडीआर के साथ या जीएलपी -4 (बीएन 2) जर्मलाइन-कम म्यूटेंट के साथ किया गया था, जो गैर-बाँझ जानवरों पर किए गए मानक जीवनकाल के समान परिणाम दिखाते हैं। जबकि जंगली प्रकार के जीवनकाल एफयूडीआर45 के प्रभाव याजीवनकाल 2 पर 25 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि के कारण समान नहीं हैं, अल्पकालिक एचएसएफ -1 नॉकडाउन जानवर मज़बूती से सभी स्थितियों (चित्रा 1) के लिए जीवनकाल में महत्वपूर्ण कमी दिखाता है। एचएसएफ -1 हीट-शॉक फैक्टर -1 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर को एन्कोड करता है, जो थर्मल तनाव प्रतिक्रिया के विनियमन में शामिल है, और इसके नॉकडाउन के परिणामस्वरूप जीवनकाल38,46 में महत्वपूर्ण कमी आती है।

जबकि उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान में विचार करने के लिए दीर्घायु एक महत्वपूर्ण कारक है, अक्सर, दीर्घायु बढ़े हुए स्वास्थ्य के साथ सहसंबंधित नहीं होती है, यहां तक कि सी। इस प्रकार, एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हम प्रजनन स्वास्थ्य, लोकोमोटरी व्यवहार और तनाव लचीलापन सहित जीव स्वास्थ्य को मापने के कई तरीकों की पेशकश करते हैं। प्रजनन स्वास्थ्य को दो तरीकों में से एक में मापा जा सकता है। सबसे पहले, अंडे की गिनती का माप एक एकल स्व-निषेचन हेर्मैप्रोडाइट द्वारा कितने अंडे दिए जाते हैं, इसका सीधा माप देगा। हालांकि, चूंकि जानवर शुक्राणु की तुलना में अधिक ओओसाइट्स का उत्पादन करते हैं, इसलिए कुछ अनिषेचित अंडे जो कभी भी व्यवहार्य संतान का उत्पादन नहीं करेंगे, उन्हें भीरखा जाता है। इसलिए, एक जानवर की वास्तविक प्रजनन क्षमता की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए, ब्रूड आकार के माप एक उपाय प्रदान करते हैं कि कितने व्यवहार्य संतानों का उत्पादन होता है। अक्सर, तनाव लचीलापन में वृद्धि वास्तव में प्रजनन क्षमता को कम कर सकती है, संभवतः प्रजनन49 पर कथित तनाव के अंतर्निहित प्रभाव के कारण। इसी तरह, जंगली प्रकार के नियंत्रण (चित्रा 2 ए, बी) की तुलना में एचएसएफ -1 ओवरएक्सप्रेशन जानवरों में रखे गए अंडे और ब्रूड आकार दोनों की संख्या में महत्वपूर्ण कमी पाई जाती है। वास्तव में, कुछ एचएसएफ -1 ओवरएक्सप्रेशन जानवर पूर्ण बाँझपन का प्रदर्शन करते हैं, जो सबूत प्रदान करते हैं कि प्रजनन स्वास्थ्य को दीर्घायु के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध किया जा सकता है।

जबकि जर्मलाइन स्वास्थ्य, कार्यात्मक अर्धसूत्रीविभाजन और प्रजनन क्षमता को समझने के लिए प्रजनन स्वास्थ्य महत्वपूर्ण है, सामान्य तौर पर, दीर्घायु और ब्रूड आकार50 के बीच कोई सीधा संबंध नहीं है। इस प्रकार, एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, लोकोमोटरी व्यवहार को उम्र बढ़ने के दौरान सी एलिगेंस हेल्थस्पैन परख के लिए सोने के मानक विधि के रूप में पेश किया जाताहै 51. लोकोमोटरी व्यवहार को मापने के कई तरीके हैं, लेकिन अधिकांश तरीकों के लिए परिष्कृत कैमरों, ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर या महंगे रसायनों की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, थ्रैशिंग परख को मानक सी एलिगेंस लैब से लैस होने से परे लगभग कोई उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है: एनजीएम-अगर प्लेटें बनाने के लिए विदारक माइक्रोस्कोप, वर्म पिक, पिपेट और उपभोग्य सामग्रियां। पिटाई दर उम्र बढ़ने के दौरान हेल्थस्पैन को मापने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करती है, जैसा कि युवा जानवरों (चित्रा 2 सी) की तुलना में पुराने जानवरों में पिटाई में महत्वपूर्ण कमी से मापा जाता है।

अंत में, तनाव परख के लिए अस्तित्व लचीलापन का एक अतिरिक्त शारीरिक माप है। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान तनाव प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने की क्षमता आम तौर पर कम हो जाती है, जिससे जानवर कम लचीला और तनाव के प्रति अधिक संवेदनशील हो जाते हैं। इस प्रकार, तनाव लचीलापन का उपयोग जीव स्वास्थ्य के लिए एक विश्वसनीय प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है। यहां, ट्यूनिकामाइसिन एक्सपोजर के जवाब में 1) ईआर तनाव के प्रति संवेदनशीलता का सर्वेक्षण करने के लिए तरीकों की पेशकश की जाती है, एक रासायनिक एजेंट जो एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन को अवरुद्ध करता है और ईआर में मिसफोल्ड प्रोटीन के संचय के परिणामस्वरूप होता है; ऑक्सीडेटिव तनाव पैराक्वाट के संपर्क में आने के माध्यम से, एक रासायनिक एजेंट जो माइटोकॉन्ड्रिया में सुपरऑक्साइड गठन को प्रेरित करता है; और 3) ऊंचे तापमान के संपर्क में आने के माध्यम से थर्मल तनाव। ट्यूनिकामाइसिन और पैराक्वाट परख के लिए, दवा को प्लेट उत्पादन के दौरान एनजीएम-अगर प्लेट में शामिल किया जाता है। ट्यूनिकामाइसिन की उच्च सांद्रता के लिए, संतान आम तौर पर विकसित नहीं होती है, और इस प्रकार नसबंदी तकनीकों का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं होती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ट्यूनिकामाइसिन की अंतिम एकाग्रता के रूप में 25 एनजी / μL की सिफारिश करता है, लेकिन सीमित धन वाले लोगों के लिए, 10 एनजी / μL भी अस्तित्व (चित्रा 3 ए) में महत्वपूर्ण कमी दिखाता है। दोनों सांद्रता संतान विकास को सीमित करती हैं, और इस प्रकार नसबंदी विधियों की आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि डीएमएसओ नियंत्रण को नसबंदी तकनीक या नई प्लेटों पर जानवरों के आंदोलन की आवश्यकता होगी। ऐसा इसलिए है क्योंकि ट्यूनिकामाइसिन विषाक्तता संतान के विकास को रोकती है, लेकिन डीएमएसओ वस्तुतः नॉनटॉक्सिक है, जो ट्यूनिकामाइसिन पर उगाए जाने पर संतान को पूरी तरह से विकसित करने की अनुमति देता है।

पैराक्वाट परख के लिए, या तो नसबंदी तकनीक या जानवरों के आंदोलन की आवश्यकता होती है क्योंकि पैराक्वाट उपचार संतान को वयस्कता में विकसित होने से नहीं रोकता है। पैराक्वाट (4 एमएम) के उच्च स्तर जीवनकाल को काफी कम करते हैं, जबकि पैराक्वाट (0.25 एमएम) के निम्न स्तर एक हार्मेटिक प्रभाव (चित्रा 3 बी) के कारण जीवनकाल बढ़ाते हैं, जो पहले प्रकाशितपरिणामों 52 के अनुरूप है। अंत में, थर्मोटॉलरेंस परख को केवल एक इनक्यूबेटर की आवश्यकता होती है जो 30-37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच सकता है, और कोई अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है। एचएसएफ -1 की अधिकता 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3 सी) पर थर्मोटॉलरेंस को बढ़ाती है जैसा कि पहले प्रकाशित53 था। हालांकि, जैसा कि दूसरों ने पहले और वर्तमान डेटा से दिखाया है, थर्मोटॉलरेंस परख के साथ प्रमुख समस्या उनकी परिवर्तनशीलता है। कई कारक थर्मोटॉलरेंस परख के भीतर परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकते हैं, जिसमें इनक्यूबेटरों के बीच अंतर और जानवरों को प्रत्येक घंटे थर्मोटॉलरेंस स्कोर करते समय इनक्यूबेटर के बाहर बिताए जाने वाले समय शामिल हैं। थर्मोटॉलरेंस के संपूर्ण दिशानिर्देश के लिए, संदर्भ 41 देखें।

Figure 1
चित्रा 1: नसबंदी के साथ और बिना जीवनकाल माप की तुलना( ए) 20 डिग्री सेल्सियस पर खाली वेक्टर (ईवी) या एचएसएफ -1 आरएनएआई बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम-अगर प्लेटों पर उगाए गए जंगली प्रकार के एन 2 नेमाटोड के जीवनकाल। जानवरों को वयस्कता के 1, 3, 5 और 7 दिनों में संतान से दूर ले जाया गया था। (बी) 20 डिग्री सेल्सियस पर खाली वेक्टर (ईवी) या एचएसएफ -1 आरएनएआई बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम-अगर-एफयूडीआर प्लेटों पर उगाए गए जंगली प्रकार के एन 2 नेमाटोड के जीवनकाल। जानवरों को मानक ईवी या एचएसएफ -1 आरएनएआई प्लेटों पर वयस्कता के लिए उगाया गया था, और फिर वयस्कता के दिन 1 पर एफयूडीआर प्लेटों में ले जाया गया था। (सी) 25 डिग्री सेल्सियस पर खाली वेक्टर (ईवी) या एचएसएफ -1 आरएनएआई के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम-अगर प्लेटों पर उगाए गए जीएलपी -4 (बीएन 2) उत्परिवर्ती जानवरों के जीवनकाल। सभी स्थितियों के लिए, जानवरों को हर 2 दिनों में मृत्यु के लिए स्कोर किया गया था जब तक कि सभी जानवरों को मृत या सेंसर के रूप में दर्ज नहीं किया गया था। बैगिंग, फलाव, या योनि के विस्फोट वाले जानवर, या जो प्लेटों के किनारों को क्रॉल करते थे और डिसिकेटेड होते थे, उन्हें सेंसर किया गया था। सभी आँकड़े लॉग-रैंक मेंटल-कॉक्स परीक्षण का उपयोग करके किए गए थे और तालिका 2 में पाए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अंडे की गिनती, ब्रूड आकार, और स्वास्थ्य के माप के रूप में पिटाई. (ए) थ्रैशिंग परख जीएलपी -4 (बीएन 2) उत्परिवर्ती जानवरों पर की गई थी, जो एनजीएम-अगर प्लेटों पर उगाए गए थे, जो दिन 1 (नीला), दिन 4 (लाल), और दिन 9 (हरे) जानवरों पर 25 डिग्री सेल्सियस पर खाली वेक्टर के साथ वरीयता प्राप्त थे। एनजीएम-अगर प्लेट पर एम 9 समाधान में रखे गए जानवरों में पिटाई की गई थी, एक मानक विदारक गुंजाइश के आईपीस पर घुड़सवार एक मानक स्मार्टफोन कैमरे का उपयोग करके वीडियो रिकॉर्ड किया गया था, और सटीकता के लिए धीमी गति से स्कोर किया गया था। एन = प्रति स्थिति 15 जानवर। (बी) अंडे की गिनती जंगली प्रकार एन 2 (नीला) और सुर -5 पी :: एचएसएफ -1 (लाल) जानवरों में मापा गया था। जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया और ताजा प्लेटों पर ले जाया गया, और अंडे हर 12 घंटे में गिने गए। दिए गए अंडों की कुल संख्या को अभिव्यक्त किया गया था। एन = वाइल्डटाइप के लिए 7 जानवर और सुर -5 पी के लिए 9 जानवर:: एचएसएफ -1। (सी) ब्रूड परख को (बी) के समान जानवरों पर मापा गया था जहां अंडे को हैचिंग की अनुमति देने के लिए 2 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था, और सभी हैच किए गए अंडे गिने गए थे। = पी < 0.001 की गणना गैर-पैरामीट्रिक मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके की जाती है। प्रत्येक बिंदु एक एकल जानवर का प्रतिनिधित्व करता है, और रेखाएं माध्यिका और इंटरक्वार्टाइल रेंज का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: जीव स्वास्थ्य के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में तनाव लचीलापन( ए) 20 डिग्री सेल्सियस पर खाली वेक्टर आरएनएआई बैक्टीरिया पर उगाए गए एन 2 जानवरों की उत्तरजीविता परख। जानवरों को वयस्कता के दिन 1% डीएमएसओ, 10 एनजी / μL ट्यूनिकामाइसिन (टीएम), या 25 एनजी / μL टीएम युक्त प्लेटों में ले जाया गया था। (बी) 20 डिग्री सेल्सियस पर खाली वेक्टर आरएनएआई बैक्टीरिया पर उगाए गए एन 2 जानवरों की उत्तरजीविता परख। जानवरों को पानी, 0.25 एमएम पैराक्वाट (पीक्यू), या 4 एमएम पीक्यू युक्त प्लेटों पर हैच से उगाया गया था। ए-बी के लिए, जानवरों को हर 2 दिनों में मृत्यु के लिए स्कोर किया गया था जब तक कि सभी जानवरों को मृत या सेंसर के रूप में दर्ज नहीं किया गया था। बैगिंग, फलाव, या योनि के विस्फोट वाले जानवर, या जो प्लेटों के किनारों को क्रॉल करते थे और डिसिकेटेड होते थे, उन्हें सेंसर किया गया था। सभी आँकड़े लॉग-रैंक मेंटल-कॉक्स परीक्षण (तालिका 2) का उपयोग करके किए गए थे। (सी) जंगली प्रकार के एन 2 जानवरों के लिए सभी 37 डिग्री सेल्सियस थर्मोटॉलरेंस परखों का पूल डेटा बनाम एचएसएफ -1 (सुर -5 पी: : एचएसएफ -1) का ओवरएक्सप्रेशन। डेटा को समय पर जीवित प्रतिशत के रूप में दर्शाया जाता है = थर्मोटॉलरेंस परख के 9 घंटे, प्रत्येक पंक्ति उसी दिन किए गए मिलान किए गए प्रयोग का प्रतिनिधित्व करती है। जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस पर खाली वेक्टर आरएनएआई बैक्टीरिया पर उगाया गया था और परख के लिए वयस्कता के दिन 1 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर ले जाया गया था। एन = प्रतिकृति प्रति तनाव 60 जानवर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नुस्खा
ब्लीच समाधान 1.8% (वी / वी) सोडियम हाइपोक्लोराइट, 0.375 एम केओएच
कार्बेनिसिलिन एमएल स्टॉक समाधान (1000x) पानी में। लंबी अवधि के भंडारण के लिए 6 महीने या -20 डिग्री सेल्सियस तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
एफयूडीआर पानी में 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
आईपीटीजी पानी में 1 एम समाधान।
लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) इस प्रोटोकॉल में, वाणिज्यिक एलबी का उपयोग किया गया था (सामग्री की तालिका देखें), लेकिन बैक्टो-ट्रिप्टोन, खमीर निकालने और एनएसीएल का उपयोग करके सभी मानक एलबी घर-निर्मित व्यंजन पर्याप्त हैं।
एम 9 समाधान 22 एमएम केएच2पीओ4 मोनोबेसिक, 42.3 एमएम एनए2एचपीओ4, 85.6 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम एमजीएसओ4
सूत्रकृमि विकास मीडिया (एनजीएम) एमएल कोलेस्ट्रॉल,25 एमएम केपीओ4 पीएच 6.0, 1 एमएम एमजीएसओ4, 2% (डब्ल्यू / वी) अगर, 0.25% (डब्ल्यू / वी) बैक्टो-पेप्टोन, 51.3 एमएम एनएसीएल
एनजीएम आरएनएआई प्लेटें एमएल कोलेस्ट्रॉल,25 एमएम केपीओ4 पीएच 6.0, 1 एमएम एमजीएसओ4, 2% (डब्ल्यू / वी) अगर, 0.25% (डब्ल्यू / वी) बैक्टो-पेप्टोन, 51.3 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम आईपीटीजी, 100 μg / एमएल कार्बेनिसिलिन / एम्पीसिलिन। अप करने के लिए 3 महीने के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
एनजीएम आरएनएआई डीएमएसओ एमएल कोलेस्ट्रॉल,25 एमएम केपीओ4 पीएच 6.0, 1 एमएम एमजीएसओ4, 2% (डब्ल्यू / वी) अगर, 0.25% (डब्ल्यू / वी) बैक्टो-पेप्टोन, 51.3 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम आईपीटीजी, 100 μg / एमएल कार्बेनिसिलिन / 1% डीएमएसओ
(ट्यूनिकामाइसिन के लिए नियंत्रण)
एनजीएम आरएनएआई टीएम एमएल कोलेस्ट्रॉल,25 एमएम केपीओ4 पीएच 6.0, 1 एमएम एमजीएसओ4, 2% (डब्ल्यू / वी) अगर, 0.25% (डब्ल्यू / वी) बैक्टो-पेप्टोन, 51.3 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम आईपीटीजी, 100 μg / एमएल कार्बेनिसिलिन / 1% डीएमएसओ, 25 एनजी /
पैराक्वाट पानी में 400 एमएम घोल - ताजा तैयार किया जाना चाहिए
टेट्रासाइक्लिन एमएल स्टॉक समाधान (500x) 100% इथेनॉल में। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
ट्यूनिकामाइसिन 100% डीएमएसओ में 2.5 मिलीग्राम / दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह एक 100x समाधान है (25 एनजी / μL काम समाधान)

तालिका 1. प्रोटोकॉल के लिए अभिकर्मकों और मीडिया के लिए व्यंजनों।

इसी चित्रा पैनल तनाव, उपचार औसत जीवनकाल # मृत्यु/# कुल पी-वैल्यू
(लॉग-रैंक)
1ए एन 2, वेक्टर आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस 17 74/120 --
एन 2, एचएसएफ -1 आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस 11 65/120 <0.001
1 बी एन 2, वेक्टर आरएनएआई, एफयूडीआर, 20 डिग्री सेल्सियस 19 120/120 --
एन 2, एचएसएफ -1 आरएनएआई, एफयूडीआर, 20 डिग्री सेल्सियस 11 116/120 <0.001
1सी एन 2, जीएलपी -4 (बीएन 2), वेक्टर आरएनएआई, 25 डिग्री सेल्सियस 13 115/121 --
एन 2, जीएलपी -4 (बीएन 2), एचएसएफ -1 आरएनएआई, 25 डिग्री सेल्सियस 4 120/120 < 0.001
2ए एन 2, वेक्टर आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस, 1% डीएमएसओ 19 85/120 --
एन 2, वेक्टर आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस, 10 एनजी / 15 109/120 <0.001
एन 2, वेक्टर आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस, 25 एनजी / 12 117/120 <0.001
2 बी एन 2, वेक्टर आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस 19 84/120 --
एन 2, वेक्टर आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस, 0.25 एमएम पैराक्वाट 24 91/120 <0.001
एन 2, वेक्टर आरएनएआई, 20 डिग्री सेल्सियस, 4 एमएम पैराक्वाट 6 50/120 <0.001

तालिका 2. जीवनकाल और तनाव लचीलापन के लिए आँकड़े।

Discussion

जीवनकाल, जिसे जीवन की अवधि के रूप में परिभाषित किया गया है, अधिकांश जीवों में एक स्पष्ट द्विआधारी घटना है-या तो एक जीव जीवित है या नहीं। हालांकि, दीर्घायु हमेशा एक जीव के स्वास्थ्य से संबंधित नहीं होती है। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल हार्मेसिस मॉडल जहां माइटोकॉन्ड्रियल तनाव के संपर्क में नाटकीय रूप से जीवनकाल बढ़ता है, आम तौर पर सबसे लंबे समय तक रहने वाले जानवरों में से कुछ होते हैं, फिर भी अवरुद्ध विकास और चयापचय समारोह37,54 में कमी का प्रदर्शन करते हैं। इसी तरह, अति सक्रिय एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनाव प्रतिक्रियाओं वाले जानवर भी कुछ व्यवहार और फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं जिन्हें नाटकीय रूप से बेहतर प्रोटीन होमियोस्टेसिस और जीवनकाल36,49 होने के बावजूद स्वास्थ्य में कमी के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। अंत में, एचएसएफ -1 फ़ंक्शन55 में वृद्धि, एक्सबीपी -1 फ़ंक्शन56 में वृद्धि, और परिवर्तित फॉक्सओ सिग्नलिंग57 सहित मॉडल जीवों में कई दीर्घायु प्रतिमान सभी कैंसर के जोखिम में वृद्धि के साथ सहसंबद्ध हैं, और यह अपरिहार्य है कि विस्तारित जीवनकाल फायदेमंद नहीं है यदि कोई जीव कैंसर और अन्य स्वास्थ्य विकृतियों के साथ निरंतर संघर्ष में है। इसलिए, उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान में दीर्घायु एक स्टैंडअलोन माप नहीं हो सकता है।

इस प्रकार, उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान में हेल्थस्पैन की अवधारणा एक बढ़ता हुआ क्षेत्र रहा है। हेल्थस्पैन, शिथिल रूप से जीवन की अवधि के रूप में परिभाषित किया गया है कि कोई स्वस्थ है, दीर्घायु की तुलना में पता लगाना अधिक कठिन है। हालांकि, दीर्घायु के विपरीत, "स्वास्थ्य" की अवधारणा जटिल है, क्योंकि ऑर्गेनिस्मल स्वास्थ्य के लिए कई अलग-अलग रीडआउट हैं: ऑर्गेनिस्मल स्तर पर, मांसपेशी कार्य / ताकत, न्यूरोनल / संज्ञानात्मक कार्य, प्रजनन स्वास्थ्य, आदि हैं; सेलुलर स्तर पर प्रोटीन होमियोस्टेसिस, लिपिड होमोस्टैसिस, ग्लूकोज होमियोस्टेसिस, चयापचय आदि होते हैं। 2014 में, उम्र बढ़ने वाले जीवविज्ञानियों ने निश्चित रूप से संरचित परिभाषा के साथ उम्र बढ़ने के जैविक हॉलमार्क की विशेषता बताई है कि यह कुछ ऐसा होना चाहिए जो उम्र बढ़ने के दौरान स्वाभाविक रूप से टूट जाता है और प्रयोगात्मक रूप से बदल दिया जा सकता है जैसे कि प्रयोगात्मक उत्तेजना को उम्र बढ़ने में तेजी आनी चाहिए और प्रयोगात्मक हस्तक्षेप को उम्र बढ़ने को धीमा करना चाहिए। उम्र बढ़ने के इन नौ हॉलमार्क में जीनोमिक अस्थिरता, टेलोमेर एट्रिशन, एपिजेनेटिक परिवर्तन, प्रोटीन होमोस्टैसिस (प्रोटियोस्टेसिस) का नुकसान, स्टेम सेल थकावट, परिवर्तित इंटरसेल्युलर सिग्नलिंग, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, विनियमित पोषक तत्व संवेदन और सेलुलर सेनेसेंस58 शामिल हैं। तब से, कई अध्ययनों का तर्क है कि अन्य कारकों को शामिल किया जाना चाहिए, जिसमें बाह्य प्रोटीन और प्रणालीगत शरीर विज्ञान जैसे प्रतिरक्षा और सूजन59 शामिल हैं। आखिरकार, हेल्थस्पैन की जटिल परिभाषा यह अनिवार्य करती है कि ऑर्गेनिस्मल हेल्थ को कई अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके मापा जाए।

इसलिए, इस पांडुलिपि में, नेमाटोड मॉडल का उपयोग करके हेल्थस्पैन के विभिन्न पहलुओं को मापने के लिए कई तरीके प्रस्तुत किए गए हैं, सी। हम थ्रैशिंग परख, अंडे की गिनती और ब्रूड आकार का उपयोग करके प्रजनन स्वास्थ्य, और तनाव के प्रति संवेदनशीलता का उपयोग करके लोकोमोटरी व्यवहार परख करते हैं। दरअसल, लोकोमोटरी व्यवहार स्वास्थ्य को मापने के लिए एक स्वर्ण-मानक विधि है, क्योंकि जीव उम्र बढ़ने के दौरान गतिशीलता और आंदोलन के महत्वपूर्ण नुकसान का प्रदर्शन करते हैं51. लोकोमोटरी व्यवहार के नुकसान को उम्र बढ़ने के कई हॉलमार्क के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, क्योंकि सी एलिगेंस में मांसपेशियों का कार्य उचित प्रोटियोस्टेसिस60, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन61 और न्यूरॉन-मांसपेशी सिग्नलिंग62 पर निर्भर है। जबकि यह पांडुलिपि लोकोमोटरी व्यवहार के एक माप पर केंद्रित है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कई अन्य तरीके मौजूद हैं, जिनमें ठोस अगर प्लेट पर जानवरों की गतिशीलता,51 को छूने की प्रतिक्रिया और केमोटैक्सिस परख63 शामिल हैं। हालांकि, इन विधियों को आम तौर पर अधिक परिष्कृत रिकॉर्डिंग उपकरणों, वर्म-ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर के उपयोग, या महंगे, खतरनाक या वाष्पशील रसायनों के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिनमें से सभी कुछ शोध सेटिंग्स में निषेधात्मक हो सकते हैं।

इसके अलावा, अंडे की गिनती और ब्रूड आकार के लिए परख प्रजनन स्वास्थ्य को मापने की एक विधि के रूप में और वयस्क कीड़े में कोशिका विभाजन को मापने के लिए सबसे सरल विधि के रूप में प्रस्तुत की जाती है, क्योंकि वयस्क कीड़े पोस्ट-माइटोटिक होते हैं और केवल रोगाणु कोशिकाएं और भ्रूण वयस्क कृमि64 के भीतर कोशिका विभाजन से गुजरते हैं। कोशिका विभाजन के उपाय के रूप में, प्रजनन स्वास्थ्य सेलुलर सेनेसेंस और स्टेम सेल थकावट की उम्र बढ़ने की पहचान के लिए प्रासंगिक हो सकता है। प्रजनन स्वास्थ्य कई कारकों से प्रभावित हो सकता है, जिसमें रोगजनक संक्रमण65 या तनाव49 के संपर्क में आना शामिल है, हालांकि प्रजनन स्वास्थ्य और दीर्घायु के बीच कोई सीधा संबंध नहीं है। वास्तव में, कुछ लंबे समय तक रहने वाले जानवर ब्रूड आकार49 में महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित करते हैं, और यह भी संभव है कि दीर्घायु और ब्रूड आकार50 के बीच एक व्युत्क्रम सहसंबंध मौजूद हो। एलिगेंस के लिए विशिष्ट घटना नहीं है, क्योंकि दीर्घायु पर प्रजनन के हानिकारक प्रभाव लंबे समय से मनुष्यों66, साथी कुत्तों67 और चूहों68 में देखे गए हैं। फिर भी, हम चेतावनी के साथ प्रजनन स्वास्थ्य को मापने के लिए एक विश्वसनीय और कम लागत वाली विधि के रूप में अंडे की गिनती और ब्रूड आकार प्रदान करते हैं कि प्रजनन स्वास्थ्य दीर्घायु या स्वास्थ्य के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकता है।

अंत में, उत्तरजीविता परख को जीव स्वास्थ्य के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में पेश किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाएं, जिसमें थर्मल तनाव69 और ईआर तनाव35 की प्रतिक्रिया शामिल है, उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान तेजी से गिरावट आती है और प्रोटियोस्टेसिस70,71 की उम्र बढ़ने की पहचान के लिए प्रत्यक्ष प्रासंगिकता है। इसके विपरीत, हाइपरएक्टिवेटिंग तनाव प्रतिक्रियाएं35,37,38 तनाव के लचीलेपन को बढ़ावा देकर जीवनकाल में काफी वृद्धि कर सकती हैं। हालांकि यह अध्ययन सबसे सरल और सबसे कम लागत वाले तरीकों पर केंद्रित है, थर्मोटॉलरेंस41 और ऑक्सीडेटिव तनाव66 के लिए तनाव लचीलापन परख के लिए बड़ी संख्या में वैकल्पिक तरीके मौजूद हैं, प्रत्येक को उपकरण और उपभोग्य सामग्रियों के एक अलग सेट की आवश्यकता होती है। तनाव के लिए सरल जोखिम अध्ययन से परे, उपकरणों तक पहुंच के आधार पर अन्य शारीरिक तरीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और सेलुलर श्वसन73 की निगरानी कर सकता है; फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप तनाव प्रतिक्रिया सक्रियण20 के लिए ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाताओं के माप की अनुमति देगा; और उच्च-रिज़ॉल्यूशन यौगिक या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया 74, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम 75,76 और एक्टिन साइटोस्केलेटन77 के लिए फ्लोरोसेंट जांच के साथ ऑर्गेनेल आकृति विज्ञान को मापने के लिए किया जा सकता है।

दीर्घायु के माप के लिए एक अंतिम चेतावनी कहानी के रूप में, जबकि कीड़े को निष्फल करने के लिए रासायनिक और आनुवंशिक तरीकों को लागत को काफी कम करने की पेशकश की जाती है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि दोनों सीधे जीवनकाल को प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एफयूडीआर के संपर्क में पहले जीवनकाल और थर्मोटॉलरेंस45 दोनों को प्रभावित करने की सूचना दी गई है। और जबकि जीएलपी -4 (बीएन 2) उत्परिवर्ती का जीवनकाल पर कोई सीधा प्रभाव नहीं पड़ता है, 25 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि एक हल्की गर्मी-तनाव33,34 है और इस प्रकार जीवनकाल2 को प्रभावित कर सकती है। एलिगेंस को निष्फल करने के लिए अन्य तरीके मौजूद हैं, जिनमें ऑक्सिन-मध्यस्थता बाँझपन78 या वैकल्पिक तापमान-संवेदनशील शुक्राणु-कमी वाले म्यूटेंट79 शामिल हैं। हालांकि, सभी तरीकों में कुछ चेतावनी हैं, और प्रत्येक प्रयोगशाला की वैज्ञानिक आवश्यकताओं के लिए कम से कम हानिकारक परख का उपयोग करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। दीर्घायु अध्ययन की एक अंतिम सीमा संभावित परिवर्तनशीलता है जो कम नमूना आकार के कारण या केवल अन्वेषक द्वारा एक उद्देश्य त्रुटि के कारण हो सकती है। इसे दरकिनार किया जा सकता है क्योंकि नई प्रौद्योगिकियां स्वचालित जीवनकाल प्रौद्योगिकियों80 में पैदा होती हैं, लेकिन फिर से ये प्रणालियां महंगी हैं और कुछ इंजीनियरिंग और कम्प्यूटेशनल उपकरण और कौशल की आवश्यकता होती है। आखिरकार, यहां प्रदान की गई विधियों का संग्रह उपकरणों का एक विश्वसनीय सेट है जिसे लगभग किसी भी संस्थान में जल्दी से अनुकूलित और सीखा जा सकता है और उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान के लिए एक ठोस आधार प्रदान किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

जीजी टी 32 एजी 052374 द्वारा समर्थित है और आरएचएस को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग से आर 00 एजी 065200 द्वारा समर्थित है। हम उपभेदों के लिए सीजीसी (एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम पी 40 ओडी 010440 द्वारा वित्त पोषित) का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

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आनुवंशिकी अंक 183 सी एलिगेंस तनाव उम्र बढ़ने प्रोटीन प्रतिक्रिया एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम माइटोकॉन्ड्रिया गर्मी-सदमे प्रतिक्रिया
<em>कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस</em> में जीवनकाल और हेल्थस्पैन को मापने के लिए कम लागत वाले तरीकों का सर्वेक्षण करना
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Castro Torres, T., Moaddeli, D.,… More

Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).

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