Utvikling av knock-out muskelcellelinjer ved hjelp av lentivirusmediert CRISPR / Cas9 genredigering

Summary

Protokollen beskriver hvordan du genererer knock-out myoblasts ved hjelp av CRISPR / Cas9, fra utformingen av guide-RNAer til cellulær kloning og karakterisering av knock-out klonene.

Abstract

En viktig anvendelse av grupperte regulatoriske interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas 9 er utviklingen av knock-out cellelinjer, spesielt for å studere funksjonen til nye gener / proteiner forbundet med en sykdom, identifisert under den genetiske diagnosen. For utvikling av slike cellelinjer må to store problemer løsnes: innsetting av CRISPR-verktøyene (Cas9 og guiden RNA) med høy effektivitet i de valgte cellene, og begrensning av Cas9-aktiviteten til den spesifikke slettingen av det valgte genet. Protokollen som er beskrevet her, er dedikert til innsetting av CRISPR-verktøyene i vanskelige å transfektceller, for eksempel muskelceller. Denne protokollen er basert på bruk av lentivirus, produsert med plasmider offentlig tilgjengelig, som alle kloningstrinnene er beskrevet for å målrette mot et gen av interesse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har blitt utført ved hjelp av en tilpasning av et tidligere beskrevet system kalt KamiCas9, der transduksjonen av cellene med et lentivirus som koder en guide RNA rettet mot Cas9 tillater progressiv avskaffelse av Cas9-uttrykk. Denne protokollen har blitt brukt på utviklingen av en RYR1-knock out menneskelig muskelcellelinje, som har blitt ytterligere karakterisert på protein- og funksjonsnivå, for å bekrefte utslag av denne viktige kalsiumkanalen involvert i muskelintracellulær kalsiumfrigjøring og i eksitasjons-sammentrekningskobling. Prosedyren beskrevet her kan lett brukes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige å transfektceller og produsere verdifulle verktøy for å studere disse genene i menneskelige celler.

Introduction

Med fremdriften av gensekvensering og identifisering av mutasjoner i gener av ukjente funksjoner i et bestemt vev, utgjør utviklingen av relevante cellulære modeller for å forstå funksjonen til et nytt målgen og bekrefte dets involvering i de relaterte patofysiologiske mekanismene et viktig verktøy. I tillegg er disse modellene av stor betydning for fremtidig terapeutisk utvikling ^1,2, og utgjør et interessant alternativ til utvikling av knock-out dyremodeller i rett tråd med de internasjonale anbefalingene for reduksjon i bruk av dyr i eksperimentering. Genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de kraftigste verktøyene som for tiden er tilgjengelige, noe som har gjort det mulig å utvikle mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de mest brukte bruksområdene til CRISPR/Cas9³. Suksessen med genredigering er avhengig av muligheten til å introdusere CRISPR-verktøyene (guiden RNAer og kjernen Cas9) i målcellemodellen, noe som kan være en utfordring i mange vanskelig å transfektceller, for eksempel muskelceller⁴. Denne utfordringen kan overvinnes ved bruk av virus, vanligvis lentivirus, som har den store fordelen å transdusere effektivt mange celletyper og levere transgene. Men den største ulempen er integrasjonen av transgene i vertscellegenomet, noe som fører til potensiell endring av gener lokalisert på integrasjonsstedet og til det permanente uttrykket av transgene, som i tilfelle av kjernen Cas9 ville føre til skadelige konsekvenser⁵. En smart løsning er foreslått av Merienne og kolleger⁶, som består av introduksjon i cellene i en guide-RNA rettet mot Selve Cas9-genet, noe som fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning av denne strategien presenteres her som en brukervennlig og allsidig protokoll som gjør det mulig å slå ut praktisk talt ethvert gen i celler som er vanskelige å transfekter.

Målet med protokollen som presenteres her er å indusere inaktivering av et gen av interesse for udødelige muskelceller. Det kan brukes til å slå ut ethvert gen av interesse, i forskjellige typer udødelige celler. Protokollen som er beskrevet her inneholder trinn for å designe guiden RNAer og deres kloning i lentivirale plasmider, for å produsere CRISPR-verktøyene i lentivirale vektorer, for å transdusere cellene med de forskjellige lentivirusene, og å klone cellene for å produsere en homogen redigert cellelinje.

Ved hjelp av denne protokollen er udødeliggjorte humane skjelettmuskulaturceller utviklet med sletting av type 1 ryanodinreseptoren (RyR1), en viktig kalsiumkanal involvert i intracellulær kalsiumfrigjøring og muskelkontraksjon⁷. Utslag (KO) av genet er bekreftet på proteinnivå ved hjelp av vestlig blot, og på funksjonelt nivå ved hjelp av kalsiumavbildning.

Protocol

Muskelbiopsier ble hentet fra Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-nettverket EuroBioBank, Paris, Frankrike) i samsvar med europeiske anbefalinger og fransk lovgivning. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle individer. Udødelige myoblaster ble vennlig produsert av Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrike), og protokollene ble godkjent av Myology Institute ethic committee (MESRI, n AC-2019-3502). 1. CRISPR guide design Identifi…

Representative Results

Denne protokollen ble brukt på udødeliggjorte myoblaster fra et sunt emne15 (såkalte HM-celler, for menneskelige myoblaster), der RyR1 tidligere har blitt karakterisert16, for å slå ut RYR1-genet som koder RyR1-proteinet. Utformingen av guidene RNA ble laget for å slette sekvensen som omfatter en del av exon 101 og intron 101 av genet. Sletting av deler av exon 101 forutsettes å føre til forstyrrelser i leserammen. I tillegg koder exon 101 poren av proteine…

Discussion

Et viktig skritt på vei til karakterisering av gener av ukjent funksjon involvert i patologier er utviklingen av relevante cellulære modeller for å studere funksjonen til disse genene. Bruken av genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og utviklingen av knock-out modeller som presenteres her er blant de mest brukte applikasjonene. I denne sammenhengen foreslår vi her en allsidig protokoll for å utvikle en menneskelig cellelinje knock-out i ethvert gen av interesse, slik at …

Materials

Anti-CACNA1S antibody	Sigma-Aldrich	HPA048892	Primary antibody
Blp I	NE BioLabs	R0585S	Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Takara	631312	Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG	GeneTex	GTX221666	HRP secondary antibody
Fluo-4 direct	Molecular Probes	F10472	Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#2118	Primary antibody
HindIII	Fermentas	ER0501	Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC	ThermoFisher Scientific	F532L	Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody	DHSB	MF20	Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF 740424	Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	DNA purification
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	Chemically competent cells
Plasmid #87904	Addgene	87904	Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919	Addgene	87919	Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260	Addgene	12260	Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454	Addgene	8454	Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody	Invitrogene	R96025	Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	Chemically competent cells
Xma I	NE BioLabs	R0180S	Restriction enzyme