Summary

Utvikling av knock-out muskelcellelinjer ved hjelp av lentivirusmediert CRISPR / Cas9 genredigering

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

Protokollen beskriver hvordan du genererer knock-out myoblasts ved hjelp av CRISPR / Cas9, fra utformingen av guide-RNAer til cellulær kloning og karakterisering av knock-out klonene.

Abstract

En viktig anvendelse av grupperte regulatoriske interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas 9 er utviklingen av knock-out cellelinjer, spesielt for å studere funksjonen til nye gener / proteiner forbundet med en sykdom, identifisert under den genetiske diagnosen. For utvikling av slike cellelinjer må to store problemer løsnes: innsetting av CRISPR-verktøyene (Cas9 og guiden RNA) med høy effektivitet i de valgte cellene, og begrensning av Cas9-aktiviteten til den spesifikke slettingen av det valgte genet. Protokollen som er beskrevet her, er dedikert til innsetting av CRISPR-verktøyene i vanskelige å transfektceller, for eksempel muskelceller. Denne protokollen er basert på bruk av lentivirus, produsert med plasmider offentlig tilgjengelig, som alle kloningstrinnene er beskrevet for å målrette mot et gen av interesse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har blitt utført ved hjelp av en tilpasning av et tidligere beskrevet system kalt KamiCas9, der transduksjonen av cellene med et lentivirus som koder en guide RNA rettet mot Cas9 tillater progressiv avskaffelse av Cas9-uttrykk. Denne protokollen har blitt brukt på utviklingen av en RYR1-knock out menneskelig muskelcellelinje, som har blitt ytterligere karakterisert på protein- og funksjonsnivå, for å bekrefte utslag av denne viktige kalsiumkanalen involvert i muskelintracellulær kalsiumfrigjøring og i eksitasjons-sammentrekningskobling. Prosedyren beskrevet her kan lett brukes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige å transfektceller og produsere verdifulle verktøy for å studere disse genene i menneskelige celler.

Introduction

Med fremdriften av gensekvensering og identifisering av mutasjoner i gener av ukjente funksjoner i et bestemt vev, utgjør utviklingen av relevante cellulære modeller for å forstå funksjonen til et nytt målgen og bekrefte dets involvering i de relaterte patofysiologiske mekanismene et viktig verktøy. I tillegg er disse modellene av stor betydning for fremtidig terapeutisk utvikling 1,2, og utgjør et interessant alternativ til utvikling av knock-out dyremodeller i rett tråd med de internasjonale anbefalingene for reduksjon i bruk av dyr i eksperimentering. Genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de kraftigste verktøyene som for tiden er tilgjengelige, noe som har gjort det mulig å utvikle mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de mest brukte bruksområdene til CRISPR/Cas93. Suksessen med genredigering er avhengig av muligheten til å introdusere CRISPR-verktøyene (guiden RNAer og kjernen Cas9) i målcellemodellen, noe som kan være en utfordring i mange vanskelig å transfektceller, for eksempel muskelceller4. Denne utfordringen kan overvinnes ved bruk av virus, vanligvis lentivirus, som har den store fordelen å transdusere effektivt mange celletyper og levere transgene. Men den største ulempen er integrasjonen av transgene i vertscellegenomet, noe som fører til potensiell endring av gener lokalisert på integrasjonsstedet og til det permanente uttrykket av transgene, som i tilfelle av kjernen Cas9 ville føre til skadelige konsekvenser5. En smart løsning er foreslått av Merienne og kolleger6, som består av introduksjon i cellene i en guide-RNA rettet mot Selve Cas9-genet, noe som fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning av denne strategien presenteres her som en brukervennlig og allsidig protokoll som gjør det mulig å slå ut praktisk talt ethvert gen i celler som er vanskelige å transfekter.

Målet med protokollen som presenteres her er å indusere inaktivering av et gen av interesse for udødelige muskelceller. Det kan brukes til å slå ut ethvert gen av interesse, i forskjellige typer udødelige celler. Protokollen som er beskrevet her inneholder trinn for å designe guiden RNAer og deres kloning i lentivirale plasmider, for å produsere CRISPR-verktøyene i lentivirale vektorer, for å transdusere cellene med de forskjellige lentivirusene, og å klone cellene for å produsere en homogen redigert cellelinje.

Ved hjelp av denne protokollen er udødeliggjorte humane skjelettmuskulaturceller utviklet med sletting av type 1 ryanodinreseptoren (RyR1), en viktig kalsiumkanal involvert i intracellulær kalsiumfrigjøring og muskelkontraksjon7. Utslag (KO) av genet er bekreftet på proteinnivå ved hjelp av vestlig blot, og på funksjonelt nivå ved hjelp av kalsiumavbildning.

Protocol

Muskelbiopsier ble hentet fra Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-nettverket EuroBioBank, Paris, Frankrike) i samsvar med europeiske anbefalinger og fransk lovgivning. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle individer. Udødelige myoblaster ble vennlig produsert av Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrike), og protokollene ble godkjent av Myology Institute ethic committee (MESRI, n AC-2019-3502). 1. CRISPR guide design Identifi…

Representative Results

Denne protokollen ble brukt på udødeliggjorte myoblaster fra et sunt emne15 (såkalte HM-celler, for menneskelige myoblaster), der RyR1 tidligere har blitt karakterisert16, for å slå ut RYR1-genet som koder RyR1-proteinet. Utformingen av guidene RNA ble laget for å slette sekvensen som omfatter en del av exon 101 og intron 101 av genet. Sletting av deler av exon 101 forutsettes å føre til forstyrrelser i leserammen. I tillegg koder exon 101 poren av proteine…

Discussion

Et viktig skritt på vei til karakterisering av gener av ukjent funksjon involvert i patologier er utviklingen av relevante cellulære modeller for å studere funksjonen til disse genene. Bruken av genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og utviklingen av knock-out modeller som presenteres her er blant de mest brukte applikasjonene. I denne sammenhengen foreslår vi her en allsidig protokoll for å utvikle en menneskelig cellelinje knock-out i ethvert gen av interesse, slik at …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) og fra Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Materials

Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).

Play Video

Cite This Article
Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

View Video