Protokollen beskriver hvordan du genererer knock-out myoblasts ved hjelp av CRISPR / Cas9, fra utformingen av guide-RNAer til cellulær kloning og karakterisering av knock-out klonene.
En viktig anvendelse av grupperte regulatoriske interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas 9 er utviklingen av knock-out cellelinjer, spesielt for å studere funksjonen til nye gener / proteiner forbundet med en sykdom, identifisert under den genetiske diagnosen. For utvikling av slike cellelinjer må to store problemer løsnes: innsetting av CRISPR-verktøyene (Cas9 og guiden RNA) med høy effektivitet i de valgte cellene, og begrensning av Cas9-aktiviteten til den spesifikke slettingen av det valgte genet. Protokollen som er beskrevet her, er dedikert til innsetting av CRISPR-verktøyene i vanskelige å transfektceller, for eksempel muskelceller. Denne protokollen er basert på bruk av lentivirus, produsert med plasmider offentlig tilgjengelig, som alle kloningstrinnene er beskrevet for å målrette mot et gen av interesse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har blitt utført ved hjelp av en tilpasning av et tidligere beskrevet system kalt KamiCas9, der transduksjonen av cellene med et lentivirus som koder en guide RNA rettet mot Cas9 tillater progressiv avskaffelse av Cas9-uttrykk. Denne protokollen har blitt brukt på utviklingen av en RYR1-knock out menneskelig muskelcellelinje, som har blitt ytterligere karakterisert på protein- og funksjonsnivå, for å bekrefte utslag av denne viktige kalsiumkanalen involvert i muskelintracellulær kalsiumfrigjøring og i eksitasjons-sammentrekningskobling. Prosedyren beskrevet her kan lett brukes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige å transfektceller og produsere verdifulle verktøy for å studere disse genene i menneskelige celler.
Med fremdriften av gensekvensering og identifisering av mutasjoner i gener av ukjente funksjoner i et bestemt vev, utgjør utviklingen av relevante cellulære modeller for å forstå funksjonen til et nytt målgen og bekrefte dets involvering i de relaterte patofysiologiske mekanismene et viktig verktøy. I tillegg er disse modellene av stor betydning for fremtidig terapeutisk utvikling 1,2, og utgjør et interessant alternativ til utvikling av knock-out dyremodeller i rett tråd med de internasjonale anbefalingene for reduksjon i bruk av dyr i eksperimentering. Genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de kraftigste verktøyene som for tiden er tilgjengelige, noe som har gjort det mulig å utvikle mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de mest brukte bruksområdene til CRISPR/Cas93. Suksessen med genredigering er avhengig av muligheten til å introdusere CRISPR-verktøyene (guiden RNAer og kjernen Cas9) i målcellemodellen, noe som kan være en utfordring i mange vanskelig å transfektceller, for eksempel muskelceller4. Denne utfordringen kan overvinnes ved bruk av virus, vanligvis lentivirus, som har den store fordelen å transdusere effektivt mange celletyper og levere transgene. Men den største ulempen er integrasjonen av transgene i vertscellegenomet, noe som fører til potensiell endring av gener lokalisert på integrasjonsstedet og til det permanente uttrykket av transgene, som i tilfelle av kjernen Cas9 ville føre til skadelige konsekvenser5. En smart løsning er foreslått av Merienne og kolleger6, som består av introduksjon i cellene i en guide-RNA rettet mot Selve Cas9-genet, noe som fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning av denne strategien presenteres her som en brukervennlig og allsidig protokoll som gjør det mulig å slå ut praktisk talt ethvert gen i celler som er vanskelige å transfekter.
Målet med protokollen som presenteres her er å indusere inaktivering av et gen av interesse for udødelige muskelceller. Det kan brukes til å slå ut ethvert gen av interesse, i forskjellige typer udødelige celler. Protokollen som er beskrevet her inneholder trinn for å designe guiden RNAer og deres kloning i lentivirale plasmider, for å produsere CRISPR-verktøyene i lentivirale vektorer, for å transdusere cellene med de forskjellige lentivirusene, og å klone cellene for å produsere en homogen redigert cellelinje.
Ved hjelp av denne protokollen er udødeliggjorte humane skjelettmuskulaturceller utviklet med sletting av type 1 ryanodinreseptoren (RyR1), en viktig kalsiumkanal involvert i intracellulær kalsiumfrigjøring og muskelkontraksjon7. Utslag (KO) av genet er bekreftet på proteinnivå ved hjelp av vestlig blot, og på funksjonelt nivå ved hjelp av kalsiumavbildning.
Et viktig skritt på vei til karakterisering av gener av ukjent funksjon involvert i patologier er utviklingen av relevante cellulære modeller for å studere funksjonen til disse genene. Bruken av genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og utviklingen av knock-out modeller som presenteres her er blant de mest brukte applikasjonene. I denne sammenhengen foreslår vi her en allsidig protokoll for å utvikle en menneskelig cellelinje knock-out i ethvert gen av interesse, slik at …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) og fra Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |