Desarrollo de líneas celulares musculares knock-out utilizando la edición de genes CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus
Summary
El protocolo describe cómo generar mioblastos knock-out utilizando CRISPR/Cas9, desde el diseño de arneses guía hasta la clonación celular y caracterización de los clones knock-out.
Abstract
Una aplicación importante de las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas reguladoras agrupadas (CRISPR)/Cas 9 es el desarrollo de líneas celulares knock-out, específicamente para estudiar la función de nuevos genes/proteínas asociados con una enfermedad, identificados durante el diagnóstico genético. Para el desarrollo de tales líneas celulares, dos cuestiones principales deben desenredarse: la inserción de las herramientas CRISPR (el Cas9 y el ARN guía) con alta eficiencia en las células elegidas, y la restricción de la actividad cas9 a la deleción específica del gen elegido. El protocolo aquí descrito está dedicado a la inserción de las herramientas CRISPR en células difíciles de transfectar, como las células musculares. Este protocolo se basa en el uso de lentivirus, producidos con plásmidos disponibles públicamente, para los cuales se describen todos los pasos de clonación para dirigirse a un gen de interés. El control de la actividad de Cas9 se ha realizado mediante una adaptación de un sistema previamente descrito llamado KamiCas9, en el que la transducción de las células con un lentivirus que codifica un ARN guía dirigido al Cas9 permite la abolición progresiva de la expresión de Cas9. Este protocolo se ha aplicado al desarrollo de una línea celular muscular humana RYR1-knock out, que se ha caracterizado aún más a nivel proteico y funcional, para confirmar el knockout de este importante canal de calcio implicado en la liberación de calcio intracelular muscular y en el acoplamiento excitación-contracción. El procedimiento descrito aquí se puede aplicar fácilmente a otros genes en las células musculares o en otras células difíciles de transfectar y producir herramientas valiosas para estudiar estos genes en las células humanas.
Introduction
Con el progreso de la secuenciación de genes y la identificación de mutaciones en genes de funciones desconocidas en un tejido específico, el desarrollo de modelos celulares relevantes para comprender la función de un nuevo gen objetivo y confirmar su participación en los mecanismos fisiopatológicos relacionados constituye una herramienta esencial. Además, estos modelos son de gran importancia para futuros desarrollos terapéuticos 1,2, y constituyen una alternativa interesante al desarrollo de modelos animales knock-out en línea recta con las recomendaciones internacionales para la reducción del uso de animales en experimentación. La edición de genes utilizando CRISPR / Cas9 se encuentra entre las herramientas más poderosas actualmente disponibles, lo que ha permitido el desarrollo de muchos modelos knock-out / knock-in, y la validación de genes dirigidos utilizando CRISPR / Cas9 se encuentra entre las aplicaciones más utilizadas de CRISPR / Cas93. El éxito de la edición de genes se basa en la capacidad de introducir las herramientas CRISPR (la guía de ARN y la nucleasa Cas9) en el modelo de célula objetivo, lo que puede ser un desafío en muchas células difíciles de transfectar, como las células musculares4. Este desafío se puede superar con el uso de virus, generalmente lentivirus, que tiene la gran ventaja de transducir eficientemente muchos tipos de células y entregar su transgén. Pero su mayor inconveniente es la integración del transgén en el genoma de la célula huésped, lo que lleva a una posible alteración de los genes localizados en el sitio de integración y a la expresión permanente del transgén, lo que en el caso de la nucleasa Cas9 tendría consecuencias perjudiciales5. Merienne y sus colegas6 han propuesto una solución inteligente, que consiste en la introducción en las células de un ARN guía dirigido al propio gen Cas9, lo que lleva a la inactivación de Cas9. Una adaptación de esta estrategia se presenta aquí como un protocolo fácil de usar y versátil que permite eliminar prácticamente cualquier gen en células difíciles de transfectar.
El objetivo del protocolo aquí presentado es inducir la inactivación de un gen de interés en células musculares inmortalizadas. Se puede utilizar para eliminar cualquier gen de interés, en diferentes tipos de células inmortalizadas. El protocolo aquí descrito contiene pasos para diseñar los ARN guía y su clonación en plásmidos lentivirales, para producir las herramientas CRISPR en vectores lentivirales, para transducir las células con los diferentes lentivirus y para clonar las células para producir una línea celular editada homogénea.
Usando este protocolo, se han desarrollado células musculares esqueléticas humanas inmortalizadas con la deleción del receptor de rianodina tipo 1 (RyR1), un canal de calcio esencial involucrado en la liberación intracelular de calcio y la contracción muscular7. El knock-out (KO) del gen se ha confirmado a nivel de proteína usando Western blot, y a nivel funcional usando imágenes de calcio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un paso importante en el camino hacia la caracterización de genes de función desconocida implicados en patologías es el desarrollo de modelos celulares relevantes para estudiar la función de estos genes. El uso de la edición de genes utilizando CRISPR / Cas9 es un campo de investigación en crecimiento exponencial, y el desarrollo de modelos knock-out como se presenta aquí se encuentra entre sus aplicaciones más utilizadas. En este contexto, proponemos aquí un protocolo versátil para desarrollar un knock-out de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) y de Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
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