Summary

Разработка нокаутирующих мышечных клеточных линий с использованием лентивирусно-опосредованного редактирования генов CRISPR/Cas9

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

Протокол описывает, как генерировать нокаутирующие миобласты с помощью CRISPR/Cas9, начиная от проектирования направляющих РНК до клеточного клонирования и характеристики нокаутирующих клонов.

Abstract

Одним из важных применений кластерных регуляторных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas 9 является разработка нокаутирующих клеточных линий, в частности, для изучения функции новых генов/белков, связанных с заболеванием, выявленных в ходе генетической диагностики. Для развития таких клеточных линий необходимо распутать две основные проблемы: вставка инструментов CRISPR (Cas9 и направляющая РНК) с высокой эффективностью в выбранные клетки и ограничение активности Cas9 специфической делецией выбранного гена. Протокол, описанный здесь, посвящен вставке инструментов CRISPR в трудно трансфектируемые клетки, такие как мышечные клетки. Этот протокол основан на использовании лентивирусов, продуцируемых с плазмидами, общедоступными, для которых все этапы клонирования описаны для нацеливания на интересующий ген. Контроль активности Cas9 был выполнен с использованием адаптации ранее описанной системы под названием KamiCas9, в которой трансдукция клеток лентивирусом, кодирующим направляющую РНК, нацеленную на Cas9, позволяет прогрессировать отмену экспрессии Cas9. Этот протокол был применен к разработке RYR1-нокаутирующей линии мышечных клеток человека, которая была дополнительно охарактеризована на белковом и функциональном уровне, чтобы подтвердить нокаут этого важного кальциевого канала, участвующего в внутриклеточном высвобождении кальция мышц и в связи возбуждение-сокращение. Процедура, описанная здесь, может быть легко применена к другим генам в мышечных клетках или в других трудно трансфектируемых клетках и производить ценные инструменты для изучения этих генов в клетках человека.

Introduction

С прогрессом секвенирования генов и идентификацией мутаций в генах неизвестных функций в конкретной ткани разработка соответствующих клеточных моделей для понимания функции нового гена-мишени и подтверждения его участия в связанных патофизиологических механизмах представляет собой важный инструмент. Кроме того, эти модели имеют большое значение для будущих терапевтических разработок 1,2 и представляют собой интересную альтернативу разработке нокаутированных моделей животных в прямой линии с международными рекомендациями по сокращению использования животных в экспериментах. Редактирование генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из самых мощных инструментов, доступных в настоящее время, что позволило разработать множество нокаут-моделей, а целевая проверка генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из наиболее широко используемых применений CRISPR / Cas93. Успех редактирования генов зависит от способности вводить инструменты CRISPR (направляющие РНК и нуклеазу Cas9) в модель клеток-мишеней, что может быть проблемой во многих труднопереводимых клетках, таких как мышечные клетки4. Эта проблема может быть преодолена с помощью вируса, обычно лентивируса, который имеет большое преимущество для эффективного преобразования многих типов клеток и доставки их трансгена. Но его основным недостатком является интеграция трансгена в геном клетки-хозяина, что приводит к потенциальному изменению генов, локализованных в месте интеграции, и к постоянной экспрессии трансгена, что в случае нуклеазы Cas9 приведет к разрушительным последствиям5. Умный раствор был предложен Мерьенн и его коллегами6, который состоит из введения в клетки направляющей РНК, нацеленной на сам ген Cas9, что приводит к инактивации Cas9. Адаптация этой стратегии представлена здесь в виде удобного и универсального протокола, позволяющего нокаутировать практически любой ген в труднотрансфектируемых клетках.

Целью представленного здесь протокола является индуцирование инактивации гена, представляющего интерес, в увековеченных мышечных клетках. Его можно использовать для нокаутирования любого гена, представляющего интерес, в различных типах увековеченных клеток. Протокол, описанный здесь, содержит шаги по разработке направляющих РНК и их клонированию в лентивирусные плазмиды, для производства инструментов CRISPR в лентивирусных векторах, для трансдукции клеток с различными лентивирусами и для клонирования клеток для получения однородной отредактированной клеточной линии.

Используя этот протокол, были разработаны увековеченные клетки скелетных мышц человека с делецией рецептора рианодина типа 1 (RyR1), важного кальциевого канала, участвующего во внутриклеточном высвобождении кальция и сокращении мышц7. Нокаут (KO) гена был подтвержден на уровне белка с использованием вестерн-блоттинга и на функциональном уровне с использованием кальциевой визуализации.

Protocol

Биопсии мышц были получены из Банка тканей для исследований (Myobank, партнер в сети ЕС EuroBioBank, Париж, Франция) в соответствии с европейскими рекомендациями и французским законодательством. Письменное информированное согласие было получено от всех лиц. Увековеченные миобласты были любезн?…

Representative Results

Этот протокол был применен к увековеченным миобластам от здорового субъекта15 (так называемые клетки HM, для миобластов человека), в которых RyR1 ранее был охарактеризован16, чтобы выбить ген RYR1 , кодирующий белок RyR1. Конструкция направляющей РНК была сделана д…

Discussion

Важным шагом на пути к характеристике генов неизвестной функции, участвующих в патологиях, является разработка соответствующих клеточных моделей для изучения функции этих генов. Использование редактирования генов с использованием CRISPR / Cas9 является экспоненциально растущей областью …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась за счет грантов Французской ассоциации по борьбе с миопатиями (AFM-Téléthon) и Овернь-Роны Альпы Режион (AURA).

Materials

Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).

Play Video

Cite This Article
Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

View Video