Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus

Summary

O protocolo descreve como gerar myoblasts knock-out usando CRISPR/Cas9, desde o design de guide-RNAs até a clonagem celular e caracterização dos clones knock-out.

Abstract

Uma importante aplicação de repetições palindômicas interespaçadas interespaçadas (CRISPR)/Cas 9 é o desenvolvimento de linhas celulares knock-out, especificamente para estudar a função de novos genes/proteínas associados a uma doença, identificada durante o diagnóstico genético. Para o desenvolvimento dessas linhas celulares, duas questões principais devem ser desemaranhadas: inserção das ferramentas CRISPR (o Cas9 e o guia RNA) com alta eficiência nas células escolhidas, e restrição da atividade Cas9 à exclusão específica do gene escolhido. O protocolo descrito aqui é dedicado à inserção das ferramentas CRISPR em células difíceis de transfeito, como células musculares. Este protocolo baseia-se no uso de lentivírus, produzidos com plasmídeos disponíveis publicamente, para os quais todas as etapas de clonagem são descritas para atingir um gene de interesse. O controle da atividade cas9 tem sido realizado usando uma adaptação de um sistema descrito anteriormente chamado KamiCas9, no qual a transdução das células com um lentivírus codificando um guia de RNA visando o Cas9 permite a abolição progressiva da expressão Cas9. Este protocolo tem sido aplicado ao desenvolvimento de uma linha de células musculares humanas RYR1-knock out, que tem sido ainda caracterizada no nível proteico e funcional, para confirmar o nocaute deste importante canal de cálcio envolvido na liberação de cálcio intracelular muscular e no acoplamento excitação-contração. O procedimento descrito aqui pode ser facilmente aplicado a outros genes em células musculares ou em outras células difíceis de transfeito e produzir ferramentas valiosas para estudar esses genes em células humanas.

Introduction

Com o progresso do sequenciamento genético e a identificação de mutações em genes de funções desconhecidas em um tecido específico, o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para entender a função de um novo gene alvo e confirmar seu envolvimento nos mecanismos fisiodicos relacionados constitui uma ferramenta essencial. Além disso, esses modelos são de grande importância para futuros desenvolvimentos terapêuticos ^1,2, constituindo uma alternativa interessante para o desenvolvimento de modelos animais nocautes em linha reta com as recomendações internacionais para redução do uso de animais na experimentação. A edição de genes usando CRISPR/Cas9 está entre as ferramentas mais poderosas disponíveis atualmente, o que permitiu o desenvolvimento de muitos modelos knock-out/knock-in, e a validação de genes direcionada usando CRISPR/Cas9 está entre as aplicações mais utilizadas do CRISPR/Cas9³. O sucesso da edição de genes baseia-se na capacidade de introduzir as ferramentas CRISPR (o guia RNAs e o nuclease Cas9) no modelo de célula alvo, o que pode ser um desafio em muitas células difíceis de transfectar, como as células musculares⁴. Esse desafio pode ser superado com o uso do vírus, geralmente o lentivírus, que tem a grande vantagem de transduzir eficientemente muitos tipos de células e entregar seu transgene. Mas sua maior desvantagem é a integração do transgene no genoma da célula hospedeira, levando a uma possível alteração de genes localizados no local de integração e à expressão permanente do transgene, o que no caso do nuclease Cas9 resultaria em consequências prejudiciais⁵. Uma solução inteligente foi proposta por Merienne e seus colegas⁶, que consiste em introdução nas células de um guia-RNA visando o próprio gene Cas9, levando à inativação cas9. Uma adaptação dessa estratégia é apresentada aqui como um protocolo fácil de usar e versátil, permitindo eliminar praticamente qualquer gene em células difíceis de transfetar.

O objetivo do protocolo aqui apresentado é induzir a inativação de um gene de interesse em células musculares imortalizadas. Pode ser usado para eliminar qualquer gene de interesse.em diferentes tipos de células imortalizadas. O protocolo descrito aqui contém etapas para projetar os RNAs guia e sua clonagem em plasmídeos lentiviral, para produzir as ferramentas CRISPR em vetores lentivirais, para transdutar as células com os diferentes lentivírus, e para clonar as células para produzir uma linha celular homogênea editada.

Usando este protocolo, células musculares esqueléticas humanas imortalizadas foram desenvolvidas com a exclusão do receptor ryanodine tipo 1 (RyR1), um canal essencial de cálcio envolvido na liberação intracelular de cálcio e contração muscular⁷. O knock-out (KO) do gene foi confirmado no nível de proteína usando a mancha ocidental, e no nível funcional usando imagens de cálcio.

Protocol

As biópsias musculares foram obtidas do Banco de Tecidos para Pesquisa (Myobank, um parceiro da rede europeia EuroBioBank, Paris, França) de acordo com as recomendações europeias e a legislação francesa. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos. Myoblasts imortalizados foram gentilmente produzidos pelo Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, França), e os protocolos foram aprovados pelo comitê de ética do Myology Institute (MESRI, n AC-2019-3502). <strong…

Representative Results

Este protocolo foi aplicado a míbios imortalizados de um sujeito saudável15 (as chamadas células HM, para míbios humanos), em que o RyR1 foi anteriormente caracterizado16, a fim de derrubar o gene RYR1 codificando a proteína RyR1. O design dos guias RNA foi feito para excluir a sequência que abrange parte do exon 101 e intron 101 do gene. A exclusão de parte do exon 101 está prevista para resultar em interrupção do quadro de leitura. Além disso, o exon 1…

Discussion

Um grande passo no caminho para a caracterização de genes de função desconhecida envolvidos em patologias é o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para estudar a função desses genes. O uso da edição de genes usando CRISPR/Cas9 é um campo de pesquisa em crescimento exponencial, e o desenvolvimento de modelos de knock-out como apresentado aqui está entre suas aplicações mais utilizadas. Nesse contexto, propomos aqui um protocolo versátil para desenvolver uma linha celular humana em qualquer gene de…

Materials

Anti-CACNA1S antibody	Sigma-Aldrich	HPA048892	Primary antibody
Blp I	NE BioLabs	R0585S	Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Takara	631312	Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG	GeneTex	GTX221666	HRP secondary antibody
Fluo-4 direct	Molecular Probes	F10472	Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#2118	Primary antibody
HindIII	Fermentas	ER0501	Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC	ThermoFisher Scientific	F532L	Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody	DHSB	MF20	Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF 740424	Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	DNA purification
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	Chemically competent cells
Plasmid #87904	Addgene	87904	Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919	Addgene	87919	Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260	Addgene	12260	Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454	Addgene	8454	Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody	Invitrogene	R96025	Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	Chemically competent cells
Xma I	NE BioLabs	R0180S	Restriction enzyme