Protokollet beskriver hur man genererar knock-out myoblaster med CRISPR / Cas9, från utformningen av guide-RNA till cellulär kloning och karakterisering av knock-out-klonerna.
En viktig tillämpning av clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 är utvecklingen av knock-out cellinjer, specifikt för att studera funktionen hos nya gener/proteiner associerade med en sjukdom, identifierade under den genetiska diagnosen. För utvecklingen av sådana cellinjer måste två huvudfrågor lösas upp: införande av CRISPR-verktygen (Cas9 och guide-RNA) med hög effektivitet i de valda cellerna och begränsning av Cas9-aktiviteten till den specifika raderingen av den valda genen. Protokollet som beskrivs här är dedikerat till införandet av CRISPR-verktygen i svårtransfekterade celler, såsom muskelceller. Detta protokoll är baserat på användningen av lentivirus, framställda med plasmider allmänt tillgängliga, för vilka alla kloningssteg beskrivs för att rikta in sig på en gen av intresse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har utförts med hjälp av en anpassning av ett tidigare beskrivet system som kallas KamiCas9, där transduktionen av cellerna med ett lentivirus som kodar för ett guide-RNA riktat mot Cas9 möjliggör gradvis avskaffande av Cas9-uttryck. Detta protokoll har tillämpats på utvecklingen av en RYR1-knock out human muskelcelllinje, som har karakteriserats ytterligare på protein- och funktionsnivå, för att bekräfta knockouten av denna viktiga kalciumkanal som är involverad i muskel intracellulär kalciumfrisättning och i excitation-kontraktionskoppling. Förfarandet som beskrivs här kan enkelt tillämpas på andra gener i muskelceller eller i andra svårtransfekterade celler och producera värdefulla verktyg för att studera dessa gener i mänskliga celler.
Med utvecklingen av gensekvensering och identifiering av mutationer i gener med okända funktioner i en specifik vävnad utgör utvecklingen av relevanta cellulära modeller för att förstå funktionen hos en ny målgen och bekräfta dess engagemang i de relaterade patofysiologiska mekanismerna ett viktigt verktyg. Dessutom är dessa modeller av stor betydelse för den framtida terapeutiska utvecklingen 1,2 och utgör ett intressant alternativ till utvecklingen av knock-out djurmodeller i rak linje med de internationella rekommendationerna för minskad användning av djur i försök. Genredigering med CRISPR/Cas9 är bland de mest kraftfulla verktygen som för närvarande finns tillgängliga, vilket har möjliggjort utvecklingen av många knock-out/knock-in-modeller, och riktad genvalidering med CRISPR/Cas9 är bland de mest använda applikationerna av CRISPR/Cas93. Framgången för genredigering är beroende av förmågan att introducera CRISPR-verktygen (guiden RNA och nukleas cas9) i målcellsmodellen, vilket kan vara en utmaning i många svårtransfekterade celler, såsom muskelceller4. Denna utmaning kan övervinnas med användning av virus, vanligtvis lentivirus, som har den stora fördelen att effektivt transducera många celltyper och leverera sin transgen. Men dess största nackdel är integrationen av transgenen i värdcellgenomet, vilket leder till potentiell förändring av gener lokaliserade på integrationsstället och till det permanenta uttrycket av transgenen, vilket i fallet med nukleas cas9 skulle resultera i skadliga konsekvenser5. En smart lösning har föreslagits av Merienne ochkollegorna 6, som består av introduktion i cellerna av ett guide-RNA riktat mot själva Cas9-genen, vilket leder till Cas9-inaktivering. En anpassning av denna strategi presenteras här som ett användarvänligt och mångsidigt protokoll som gör det möjligt att slå ut praktiskt taget vilken gen som helst i svårtransfekterade celler.
Målet med protokollet som presenteras här är att inducera inaktiveringen av en gen av intresse för odödliga muskelceller. Det kan användas för att slå ut alla gener av intresse, i olika typer av odödliga celler. Protokollet som beskrivs här innehåller steg för att designa guiden RNA och deras kloning till lentivirala plasmider, för att producera CRISPR-verktygen i lentivirala vektorer, för att transducera cellerna med de olika lentivirusen och för att klona cellerna för att producera en homogen redigerad cellinje.
Med hjälp av detta protokoll har odödliga mänskliga skelettmuskelceller utvecklats med radering av typ 1 ryanodinreceptorn (RyR1), en viktig kalciumkanal som är involverad i intracellulär kalciumfrisättning och muskelkontraktion7. Knock-out (KO) av genen har bekräftats på proteinnivå med western blot och på funktionsnivå med kalciumavbildning.
Ett viktigt steg på vägen mot karakterisering av gener med okänd funktion som är involverade i patologier är utvecklingen av relevanta cellulära modeller för att studera funktionen hos dessa gener. Användningen av genredigering med CRISPR/Cas9 är ett exponentiellt växande forskningsfält, och utvecklingen av knock-out-modeller som presenteras här är bland de mest använda applikationerna. I detta sammanhang föreslår vi här ett mångsidigt protokoll för att utveckla en mänsklig cellinje knock-out i vilken…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av bidrag från Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) och från Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |