Summary
פרוטוקול זה מתאר סדרה של שיטות לסינתזה של אבני הבניין של המיקרוג'ל עבור פיגומים של חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים, אשר יכולים לשמש למגוון יישומי רפואה רגנרטיבית.
Abstract
פלטפורמת פיגום החלקיקים החישוליים המיקרו-נקבוביים (MAP) היא תת-קבוצה של הידרוג'לים גרעיניים. הוא מורכב מזחלת הניתנת להזרקה של מיקרוג'לים שיכולים ליצור פיגום יציב מבחינה מבנית עם נקבוביות בקנה מידה תאי באתרו לאחר שלב הצלבה כימי משני מבוסס אור (כלומר, חישול). פיגום MAP הראה הצלחה במגוון יישומים של רפואה רגנרטיבית, כולל ריפוי פצעים עוריים, הגדלת קפלים קוליים ואספקת תאי גזע. מאמר זה מתאר את השיטות לסינתזה ואפיון של מיקרו-ג'לים פולי(אתילן גליקול) (PEG) כאבני הבניין ליצירת פיגום MAP. שיטות אלה כוללות סינתזה של מקרומר חישול מותאם אישית (MethMAL), קביעת קינטיקה של ג'לציה מבשרת מיקרוג'ל, ייצור התקנים מיקרופלואידיים, ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-ג'לים, טיהור מיקרוג'ל ואפיון פיגומים בסיסי, כולל גודל מיקרו-ג'ל וחישול פיגומים. באופן ספציפי, השיטות המיקרופלואידיות בעלות התפוקה הגבוהה המתוארות כאן יכולות לייצר כמויות גדולות של מיקרו-ג'לים שניתן להשתמש בהם ליצירת פיגומי MAP לכל יישום רצוי, במיוחד בתחום הרפואה הרגנרטיבית.
Introduction
פלטפורמת פיגום MAP היא חומר ביולוגי הניתן להזרקה המורכב כולו ממיקרו-חלקיקי הידרוג'ל (מיקרו-ג'לים) המספקים מיקרופורוזיות בקנה מידה תאי כאשר הם מחוברים זה לזה, מה שמאפשר נדידת תאים בלתי תלויה בפירוק ושילוב רקמות בתפזורת1. בשל יכולתה להשתלב במהירות עם רקמת המארח ואימונוגניות נמוכה מטבעה, פלטפורמת הפיגומים MAP הוכיחה ישימות פרה-קלינית למגוון רחב של טיפולים ברפואה רגנרטיבית 2,3,4,5,6,7,8,9,10, כולל האצת ריפוי פצעים עוריים 1,3 ,11, רה-וסקולריזציה של חלל שבץ מוחי7, אספקת תאי גזע מזנכימליים2, ומתן תפזורת רקמות לטיפול באי ספיקה גלוטית6. כמו כן, הוכח כי MAP מעביר השפעות אנטי-דלקתיות לרקמות המארחות באמצעות גיוס מקרופאגים M23, וניתן אפילו לכוונן אותו כדי לקדם תגובה חיסונית של Th2 "תיקון רקמות"8. תכונות חיוביות אלה של פלטפורמת פיגום MAP מאפשרות להרחיב אותה למגוון רחב של יישומים קליניים.
שיטות שפורסמו בעבר ליצירת מיקרו-ג'לים להיווצרות פיגומי MAP כללו טיפה-מיקרופלואידיקהממוקדת זרימה 1,4,7,9, אלקטרוספריי 5,12, וסיבוב תקורה עם תחליב אצווה 6,10. השיטה המיקרופלואידית הטיפתית יכולה לייצר חלקיקים בעלי חד-פיזור גבוה, אך משתמשת בקצבי זרימה איטיים מאוד המייצרים תפוקות נמוכות של חלקיקים (μL/h). לחלופין, שיטות האלקטרו-ריספריי ותחליב האצווה יכולות לייצר נפח גבוה של חלקיקים, אך עם ריבוי חלקיקים גבוה. פרוטוקול זה משתמש בשיטה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה כדי לייצר מיקרו-ג'לים עם אוכלוסייה חד-ממדית, בהתבסס על עבודה של de Rutte et al13. שיטה זו משתמשת בטכניקות ליתוגרפיה רכות כדי ליצור התקן מיקרופלואידי פולידימתילסילוקסן (PDMS) ממסכת פוטו, אשר לאחר מכן מחוברת לשקופית זכוכית. תכנון המכשיר מסתמך על תחליב שלב כדי ליצור נפח גבוה של חלקיקי מיקרוג'ל (מ"ל/שעה). monodispersity שניתן להשיג בשיטה זו מספקת שליטה מעולה על נקבוביות בהשוואה לטכניקות אחרות, שכן microgels monodisperse יכול ליצור פיגומים עם גדלים נקבוביות אחידים יותר2.
השיטות לסינתזה ולאפיון של המיקרו-ג'לים הבודדים שיכולים לשמש כאבני בניין עבור פיגומי MAP מתוארות בכתב יד זה, במיוחד במונחים של יצירת מיקרו-ג'לים המורכבים מעמוד שדרה PEG עם קבוצת maleimide (MAL), אשר משתתפת בקלות בתוספת יעילה מסוג מייקל עם קרוסלינקרים פונקציונליים של תיול עבור ג'לציה של מיקרוג'ל. כדי לנתק ג'לציה של מיקרוג'ל מחישול פיגומים של MAP, כתב יד זה מתאר גם כיצד לסנתז מקרומר חישול מותאם אישיתשפורסם ב-14 שנים, MethMAL, שהוא מקרומר PEG בעל 4 זרועות מתקרילאמיד הטרופונקציונאלי. הקבוצות הפונקציונליות של מתקרילאמיד משתתפות בקלות בפוטופולימריזציה של רדיקלים חופשיים (לחישול מיקרוג'ל), תוך שהן נשארות אינרטיות יחסית לתנאים המקדמים תוספת מסוג מייקל עבור הקבוצות הפונקציונליות MAL.
בנוסף, כתב יד זה מתווה את הפרוטוקולים ליצירת התקנים מיקרופלואידיים PDMS, קביעת קינטיקה של ג'לציה של מיקרוג'ל ואפיון גודל המיקרוג'ל. החלק האחרון של כתב היד מפרט חישול פיגומי MAP, כלומר כאשר המיקרו-ג'לים מועברים באתרם לפיגום בתפזורת באמצעות שלב הצלבה משני, יזום, שמחבר באופן קוולנטי בין פני השטח של המיקרו-ג'לים. חשוב לציין כי ישנן שיטות חישול אחרות שניתן ליישם במערכות פיגומים MAP שאינן מסתמכות על כימיה מבוססת אור, כגון חישול בתיווך אנזים, כפי שתואר קודםלכן 1. באופן כללי, ניתן להשתמש בשיטות אלה ישירות או להשתמש בהן עם כימיה שונה של נוסחת הידרוג'ל (למשל, על בסיס חומצה היאלורונית) כדי ליצור פיגומי MAP לכל יישום.
Protocol
1. MethMAL חישול סינתזת מקרומרים
הערה: פרוטוקול זה מיועד במיוחד לשינוי 1 גרם של PEG-maleimide, אך ניתן לשנות את קנה המידה שלו כדי ליצור אצוות גדולות יותר.
- הוסיפו 1 גרם של 20 kDa PEG-maleimide ב-4 זרועות ל-10 מ"ל של מי מלח 1x עם אגירת פוספטים (PBS, pH 7.4) בכוס זכוכית קטנה עם מוט ערבוב. ערבבו את התמיסה ב-300 סל"ד עד שה-PEG מומס לחלוטין (~30 דקות).
- יש להוסיף 14.65 מ"ג של 2-אמינו-אתנול (0.67:1 thiol [SH] ליחס טוחן של maleimide [MAL]) לתגובה תוך ערבוב ב-300 סל"ד.
הערה: קבוצות התיול על 2-אמינואתנתיול יתווספו לכשלוש זרועות של PEG-MAL באמצעות תוספת מסוג מייקל, וישאירו את קבוצות הקצה של האמין.- שים לב לחישוב הדוגמה הבאה עבור כמות של 2-aminoethanethiol להוסיף:
הערה: כדי להימנע ממדידת כמות קטנה מאוד, יש להמיס 100 מ"ג של 2-אמינו-אתנול ב-1 מ"ל של PBS 1x (pH 7.4) ולהוסיף 146.5 מיקרו-ליטר של תמיסה זו לתגובה.
- שים לב לחישוב הדוגמה הבאה עבור כמות של 2-aminoethanethiol להוסיף:
- יש להמתין שעה ו-10 דקות לאחר שלב 1.2., ולאחר מכן לערבב 160.1 מ"ג של 4-(4,6-דימתוקסי-1,3,5-טריאזין-2-yl)-4-מתילמורפוליניום כלוריד (DMTMM, יחס טוחן 12:1 ל-PEG) ו-32.77 μL של חומצה מתקרילית (יחס טוחן 8:1 ל-PEG) ב-5 מ"ל של PBS אחד (pH 7.4) בכוס זכוכית חדשה ולהגיב במשך 50 דקות עם ערבוב ב-300 סל"ד.
הערה: בשלב זה, החומצה המתקרילית מגיבה עם DMTMM ליצירת אסטר תגובתי מאוד שניתן להצמיד לאחר מכן לקבוצות האמין הזמינות על ה-PEG.- שים לב לחישוב הדוגמה הבאה לחישוב כמות DMTMM להוספה:
- שים לב לחישוב הדוגמה הבאה לחישוב כמות החומצה המתקרילית להוספה:
- שים לב לחישוב הדוגמה הבאה לחישוב כמות DMTMM להוספה:
- הוסיפו את תמיסת החומצה המתקרילית/DMTMM לכוס עם תמיסת 20 kDa PEG-MAL/2-אמינו-אתיאתיול.
- הוסיפו לכוס 53.56 μL של טריאתילאמין (יחס טוחן 1:1 לחומצה מתקרילית) ואפשרו להגיב במשך הלילה תוך ערבוב ב-300 סל"ד. מכסים את הכוס בנייר כסף כדי למנוע כניסת אבק ומזהמים אחרים לכוס.
- שים לב לחישוב הדוגמה הבאה עבור כמות triethylamine להוסיף:
- שים לב לחישוב הדוגמה הבאה עבור כמות triethylamine להוסיף:
- מעבירים את התגובה לצינורות דיאליזה מעור נחש (חתך משקל מולקולרי: 3,500 Da).
- הניחו את צינורות הדיאליזה בכוס גדולה עם 1 M NaCl במים שעברו דה-יוניזציה (DI) (הנפח אמור לכסות את הצינורות לחלוטין) למשך 3 ימים עם ערבוב ב-300 סל"ד. יש להחליף את תמיסת 1 M NaCl פעמיים ביום ובסך הכל בשש כביסות.
- יש לחייג במשך 6 שעות במים DI. החליפו את מי ה-DI בכל שעה ובסך הכל שש כביסות.
- מעבירים את התגובה לצינור חרוטי של 50 מ"ל וקופאים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
- Lyophilize את הצינור לפחות 72 שעות בטמפרטורת התחלה של −70 °C ורמפת טמפרטורה של 0 °C / min עד 0 ° C.
- הכן את הדגימה ל-H-NMR אחדעל ידי המסת 25 מ"ג של MethMAL ב-700 μL של כלורופורם-d והעברה לצינור NMR.
- רכוש את ספקטרום H-NMR 1.
הערה: הספקטרה בפרוטוקול זה נרכשה באמצעות ספקטרומטר של 500 מגה-הרץ עם הפרמטרים הבאים: רוחב טאטוא = 6,467.3 הרץ, השהיית זמן = 13.1 שניות, זמן רכישה = 5.1 שניות, זמן פולס = 5.1 μs ומספר סריקות = 8. - לצורך ניתוח, שלב את שיא המאלימיד כהפניה (~6.76 ppm) ולאחר מכן שלב את שתי פסגות המתקרילאמיד (~5.35 ppm ו- 5.6 ppm). חלק את היחס בין אזורי השיא של מתקרילאמיד בשטח הכולל של כל שלוש הפסגות כדי לקבל את אחוז הזרועות שהשתנו עם מתקרילאמיד.
הערה: שינוי מקובל הוא החלפה של קבוצה פונקציונלית של 67%-75% מתקרילאמיד. דוגמה לספקטרום 1H-NMR עבור MethMAL מוצגת באיור 1.- השתמש במשוואה (1) כמידת משוואת ההחלפה:
(1)
- השתמש במשוואה (1) כמידת משוואת ההחלפה:
(1)
איור 1: מבנה כימי וספקטרום H-NMR אחדשל MethMAL. (A) מבנה כימי: המאקרומר לחישול MethMAL מורכב מפולי(אתילן גליקול) בעל 4 זרועות של 20 kDa המעובד עם שלוש זרועות מתקרילאמיד. (B) מבנה זה מייצר פסגות ב-5.36 ppm (3) ו-5.76 ppm (2) שאינן קיימות בספקטרום PEG-MAL, וזרוע מלימית אחת, המייצרת שיא של 6.71 ppm (1). הממס, כלורופורם, יצר שיא של 7.26 ppm, ומים שיוריים בדגימה זו יצרו שיא של 2.2 ppm (מסומן על ספקטרה). בספקטרום MethMAL, לפסגת המאלימיד היה שטח משולב של 0.27, וסכום אזורי פסגות המתקרילאמיד היה 0.73 (0.37 + 0.36). השינוי באחוז המתקרילאמיד היה 73% (0.73/(0.27 + 0.73)). נתון זה לקוח מתוך Pfaff et al.14. זכויות יוצרים (2021) האגודה האמריקאית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
2. קינטיקה של ג'לציה מבשרת מיקרוג'ל
הערה: ניתן לשנות את זמן הג'לציה על ידי התאמת ה- pH של המאגר המשמש להמסת רכיבי מבשר הג'ל. עבור הידרוג'לים מסוג PEG-maleimide, pH חומצי יותר מתאים בדרך כלל לזמן ג'לציה איטי יותר מכיוון שריכוז התיולאט יורד ב-pH15 נמוך יותר.
- קבעו מראש את הריכוזים הרצויים של פולימר, קרוסלינקר ורכיבים מקדמי ג'ל אחרים (כלומר, פפטידים, גליקוזאמינוגליקנים). ממיסים את ה-PEG-MAL, RGD וה-MethMAL (עמוד השדרה של ה-PEG) ב-10x PBS (pH 1.5) ואת ה-MMP-2 crosslinker ב-PBS אחד (pH 7.4).
הערה: בפרוטוקול זה, תמיסת מבשר הג'ל היא נוסחהשפורסמה 3, המורכבת מ-45.88 מ"ג/מ"ל PEG-MAL בעל 4 זרועות (10 kDa), 0.82 מ"ג/מ"ל RGD, 8.06 מ"ג/מ"ל MethMAL ו-4.62 מ"ג/מ"ל MMP-2 קרוסלינקר (crosslinker מתכלה אנזימטית). - הכן מד ויסקומטר, או מכשיר שווה ערך, לניטור מודולי אחסון ואובדן באמצעות גודל מרווח של 0.4 מ"מ, מתח גזירה של 1.0, תדר של 1.0 הרץ ומשך של 10,800 שניות.
- חברו גיאומטריה של רוטור לוח 35 מ"מ (P35/Ti). השתמש בתא לחות או בספוג לח סביב הגיאומטריה כדי לשמור על סביבה לחה.
- ערבבו את עמוד השדרה של PEG ואת ה-MMP-crosslinker ביחס נפחי של 1:1.
- פיפטה 400 μL של תמיסת מבשר הג'ל על מרכז שלב הצמיגות.
- מורידים באיטיות את הגיאומטריה על הבמה עד שהיא מגיעה לגודל המרווח שנקבע מראש של 0.4 מ"מ ומתחילים מיד לנטר מודולי אחסון (G') ואובדן (G'') למשך עד 6 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: ג'לציה נחשבת כמתחילה כאשר מודולוס האחסון הופך להיות גדול יותר ממודולוס ההפסד, וג'לציה נחשבת לשלמה כאשר מודולוס האחסון משתנה. עקומת קינטיקה מייצגת של ג'לציה מוצגת באיור 2.
איור 2: עקומה מייצגת של קינטיקה של ג'לציה של תמיסת מבשר ג'ל MAP (pH 4.5) הנקבעת על-ידי מד צמיגות. הג'לציה מתחילה בעלייה המהירה במודולוס האחסון (G'), והג'לציה מסתיימת כאשר עקומת G' מתפוגגת. G'' מציין את מודולוס ההפסד. נתון זה לקוח מתוך Pruett et al.3. זכויות יוצרים (2021) Wiley-VCH GmBH. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
3. ייצור מכשירים מיקרופלואידיים
הערה: פרוטוקול זה מתאר ייצור מכשירים של תכנון מכשיר תחליב צעדים מיקרופלואידי שהותאם מ-de Rutte et al.13, שניתן לראות באיור 3A. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש עם כל עיצוב מכשיר כי הוא חרוט לתוך רקיק SU-8. מומלץ לבצע מיקור חוץ של ייצור ראשי פרוסות הסיליקון SU-8, אלא אם כן מתקני החדר הנקי המתאימים זמינים לייצור.
- צור את ההתקן המיקרופלואידי הראשון מסוג פולידימתילסילוקסן (PDMS) ממסכת פוטו-מסכת פרוסות SU-8.
- הכן ~ 200 גרם של PDMS על ידי ערבוב הבסיס וחומר הריפוי ביחס של 10:1 w/w (ראה טבלת החומרים).
- מניחים את פרוסת ה-SU-8 בצלחת תרבית (מדביקים את שולי הוופל לצלחת), כשהעיצוב המיקרופלואידי פונה כלפי מעלה.
- יוצקים PDMS לתוך המנה כדי ליצור שכבה בעובי 1-1.5 ס"מ מעל הוופל. מניחים את התבשיל מתחת לוואקום כדי להסיר בועות.
- תנו ל-PDMS להירפא עד להתמצקות (24 שעות בטמפרטורת החדר או ~2 שעות ב-60 מעלות צלזיוס).
- לאחר שה- PDMS נרפא, השתמש בזהירות בסכין גילוח או באזמל כדי לחתוך מלבן דרך ה- PDMS, כך שיש שוליים של 0.5-1 ס"מ סביב העיצוב על הוופל.
הערה: אין להפעיל לחץ רב מדי ולהיות עדינים מאוד כדי למנוע נזק (למשל, פיצוח, גירוד) של הוופל. - תוחבים מרית לתוך אחד החתכים ומחליקים אותה לאורך החתכים כדי להפריד את ה-PDMS מהרקיק.
הערה: כאשר ה-PDMS נפרד מהרקיק, בועת אוויר תתחיל להיווצר מתחת ל-PDMS (עיין באיור 3B). - השתמשו במרית כדי להרים בעדינות את המלבן של PDMS מתוך המנה.
הערה: המרווח שנוצר ב- PDMS מעל הוופל יהיה התבנית עבור התקנים microfluidic.
- צור התקנים מיקרופלואידיים PDMS הבאים ממסכת הצילום של פרוסת SU-8.
- הכן ~ 15-20 גרם של PDMS לכל תבנית על ידי ערבוב הבסיס וחומר ריפוי ביחס של 10:1.
- יוצקים PDMS לתוך המרווח המלבני בתבנית כדי ליצור שכבה של 5 מ"מ של PDMS מעל הוופל. שים את התבנית תחת ואקום כדי להסיר את כל הבועות.
- תנו ל-PDMS לרפא עד להתמצקות מלאה (24 שעות בטמפרטורת החדר או שעתיים ב-60 מעלות צלזיוס).
- לאחר שה-PDMS נרפא, השתמש בסכין גילוח או באזמל כדי לחתוך את ה-PDMS סביב קצוות המלבן.
הערה: אין להשתמש בלחץ רב מדי ולהיות עדינים מאוד כדי למנוע נזק (כלומר, פיצוח) של הוופל. - תוחבים מרית לתוך אחד החתכים ומחליקים אותה לאורך החתכים כדי להפריד את ה-PDMS מהרקיק.
הערה: כאשר ה-PDMS נפרד מהרקיק, בועת אוויר תתחיל להיווצר מתחת ל-PDMS. - השתמשו בניקוב ביופסיה בקוטר 1.5 מ"מ כדי ליצור חורים דרך מלבן ה-PDMS בשני הכניסות והשקעים (ראו איור 3B).
- אם ישנם מספר התקנים על פרוסה אחת, השתמש במרית או בסכין גילוח כדי להבקיע קלות את ה- PDMS בין כל מכשיר, ולאחר מכן קפל בעדינות את ה- PDMS לאורך הקווים המנוקדים, כך שה- PDMS ייפרד בצורה נקייה מאוד בפני עצמה.
- אחסן את התקני PDMS במיכל ללא אבק.
- חבר את ההתקנים המיקרופלואידיים של PDMS לשקופיות זכוכית.
- הכן שקופית זכוכית אחת לכל התקן מיקרופלואידי PDMS. השתמשו בנייר דבק, באוויר מסונן או בשטיפות איזופרופיל אלכוהול (IPA) כדי להסיר אבק מהמגלשה. ודא שהשקופיות יבשות לחלוטין לפני שתעבור לשלב הבא.
- הניחו שקופית זכוכית והתקן PDMS, בצד העיצוב כלפי מעלה, אחד ליד השני על מגש פלסטיק קטן (מכסה צלחת 96 טוב עובד טוב בשביל זה) והניחו אותו במנקה פלזמה. סגרו את הדלת ואת שסתום זרימת האוויר והפעילו את משאבת הוואקום. תן לו לפעול במשך 30 שניות לפחות, ולאחר מכן כבה אותו.
- חבר את צינור הגז של מיכל החמצן לשסתום זרימת האוויר. תן לתא הפלזמה להתמלא בחמצן במשך 30 שניות, ולאחר מכן כבה את החמצן וסגור את שסתום זרימת האוויר.
- הפעל את משאבת הוואקום והגדר את רמת גלי הרדיו (RF) לגבוהה. המתינו עד שהתא יהפוך לצבע סגול-ורוד (ראו איור 3B). אפשר ל-30 שניות לעבור.
- כאשר הטיימר כבה, כבה את הפלזמה ואת ואקום. לאחר מכן, פתח באיטיות את שסתום זרימת האוויר כדי לשחרר את הוואקום. הסר את המגש ממנקה הפלזמה.
- הפוך בעדינות את התקן PDMS על שקופית הזכוכית כדי לחבר אותם. כאשר מתרחשת הדבקה, שימו לב להבדל הקל בשקיפות של ה-PDMS.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לאחסן את המכשירים המודבקים בטמפרטורה של 60°C עד מיד לפני השימוש.
- טיפול פני השטח בהתקנים המיקרופלואידיים PDMS
- הכינו את הטיפול על פני השטח על ידי דילול PFOCTS (טריכלורו(1H,1H,2H,2H-פרפלואורוקטיל)סילאן) בשמן נובק (1:50). השתמש 1 מ"ל עבור 3-4 מכשירים. מעבירים את הנפח למזרק של 1 מ"ל ומחברים מחט של 25 גרם.
הערה: המחטים המשמשות בפרוטוקול זה משופעות, לכן היזהרו בעת הטיפול בחדות. ניתן להשתמש במחטים קהות גם אם רוצים. - חותכים חתיכת צינורות טייגון באורך 10-12 ס"מ לכל מכשיר שיטופל.
- חותכים חתיכת צינורות PEEK, ~ 7 ס"מ אורך. הכנס כמה מילימטרים של צינורות PEEK לקצה של צינורות טייגון, כפי שמוצג באיור 4A, כדי לעזור למנוע מהמחט לנקב את פתחי צינורות טייגון.
- הוציאו את המכשירים מהתא המחומם והכניסו את הקצה שאינו מציץ של צינורות טייגון לתוך חור הכניסה המיימי.
- החדירו את המחט של מזרק הטיפול במשטח לתוך צינורות ה-PEEK וכסו את חור היציאה של תא השמן (ראו איור 3B).
- הזריקו את הטיפול למכשיר באיטיות וודאו שהוא ממלא את המכשיר, ללא בועות. המתן עד שהתאים המימיים יתמלאו תחילה, לאחר מכן הערוצים הקטנים יותר, ולאחר מכן תא השמן. הסר את צינורות טייגון מהמכשיר. לאחר מילוי המכשיר, תנו לו לנוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מלאו מזרק של 5 מ"ל בשמן בלבד (ללא סילאן) וחברו מחט של 25 גרם.
- שאפו את טיפול פני השטח אל מחוץ למכשיר דרך הכניסות והשקעים. הכנס צינורות טייגון לתוך המפרצון המיימי, הכנס את המזרק עם שמן לתוך צינורות PEEK, ושטוף כל מכשיר עם שמן. שאפו את השמן מתוך המכשיר.
- חזור על שטיפת השמן פי 2 יותר. הסר את צינורות טייגון.
הערה: ההתקן מוכן לשימוש.
- הכינו את הטיפול על פני השטח על ידי דילול PFOCTS (טריכלורו(1H,1H,2H,2H-פרפלואורוקטיל)סילאן) בשמן נובק (1:50). השתמש 1 מ"ל עבור 3-4 מכשירים. מעבירים את הנפח למזרק של 1 מ"ל ומחברים מחט של 25 גרם.
איור 3: התקן PDMS מיקרופלואידי. (A) שרטוט תכנון בסיוע מחשב (AutoCAD) של תכנון התקנים מיקרופלואידיים. היווצרות טיפות מיקרוג'ל מתרחשת בתעלות משני צדי תעלת השמן, כפי שניתן לראות בהתפרצות המוגדלת. (B) סקירה כללית של ייצור התקני PDMS. קיצור: PDMS = פולידימתילסילוקסן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
4. ייצור מיקרופלואידי של מיקרוג'לים
- קבעו מראש את הריכוזים הרצויים של פולימר, קרוסלינקר ורכיבים מקדמי ג'ל אחרים (כלומר, פפטידים, גליקוזאמינוגליקנים). ממיסים את ה-PEG-MAL, RGD וה-MethMAL (עמוד השדרה של ה-PEG) ב-10x PBS (pH 1.5) ואת ה-MMP-2 crosslinker יחד עם 5 μM של ביוטין-מלימיד ב-1x PBS (pH 7.4).
הערה: בפרוטוקול זה, תמיסת מבשר הג'ל היא נוסחהשפורסמה 3 המורכבת מ-45.88 מ"ג/מ"ל PEG-MAL בעל 4 זרועות (10 kDa), 0.82 מ"ג/מ"ל RGD, 8.06 מ"ג/מ"ל MethMAL ו-4.62 מ"ג/מ"ל MMP-2 קרוסלינקר (crosslinker מתכלה מבחינה אנזימטית). השיטות המתוארות להלן יניבו ~ 3 מ"ל של מיקרוג'לים. - הכן 6 מ"ל של תמיסה פעילי שטח על ידי דילול המניה 5% FluoroSurfactant לפחות 1% בשמן Novec. הוסף פתרון זה מזרק 10 מ"ל.
הערה: חומרים פעילי שטח מופלרים אינם ניתנים להסרה עם מים, מה שמאפשר להסיר אותם בקלות במהלך מעבר הג'ל לשלב מימי במהלך שטיפת PBS בשלב הטיהור. - חותכים שלוש חתיכות של צינורות טייגון באורך מתאים לגובה משאבת המזרק.
- חותכים שתי חתיכות של צינורות PEEK, ~ 1 אינץ 'אורך. הכנס כמה מילימטרים של צינורות PEEK לקצה של שתי חתיכות של צינורות טייגון, כפי שמוצג באיור 4A, כדי לעזור למנוע מהמחט לנקב את פתחי צינורות טייגון.
- הכנס את הקצה שאינו PEEK של צינורות Tygon לתוך הכניסות של התקנים microfluidic. הכנס את החלק הנותר של צינורות טייגון (ללא צינורות PEEK בקצה) לשקע המכשיר המיקרופלואידי, כפי שמוצג באיור 4C.
- הוסיפו לפחות 3 מ"ל שמן למזרק פלסטיק של 5 מ"ל והצמידו אותו למחט של 25 גרם. הכנס בזהירות את המחט לתוך צינורות PEEK על אחד הפתחים Tygon. שטפו בעדינות את הצינורות והמכשיר בשמן. לאסוף את השמן מן השקע בצינור חרוטי. חזרו על שטיפת השמן בכניסת טייגון השנייה.
- הגדר את משאבות המזרק לקצבי הזרימה הרצויים.
הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-3 מ"ל/שעה עבור קצב הזרימה המימית וב-6 מ"ל/שעה עבור קצב זרימת השמן. ייתכן שיהיה צורך להשתמש בשתי משאבות מזרק נפרדות. - חברו את המזרק המכיל את החומר פעילי השטח לכניסת השמן באמצעות מחט של 25 גרם (ראו איור 4A) ופזרו בעדינות מספיק שמן כדי להכין את הצינורות ואת תעלת השמן של המכשיר המיקרופלואידי.
- לאחר הגדרת המכשיר וכניסת השמן, הוסיפו 0.5 מ"ל שמן למזרק חדש של 5 מ"ל, שיכיל את מבשר הג'ל. מטרת כמות קטנה זו של שמן היא לעזור לשטוף את התמיסה המבשרת דרך המכשיר המיקרופואידי לקראת סוף הריצה.
- בצינור חרוטי, לשלב 1.5 מ"ל של תמיסת עמוד השדרה PEG ו 1.5 מ"ל של תמיסת crosslinker. מערבולת במשך 30 שניות ולהעביר במהירות את הפתרון מבשר ג'ל משולב למזרק 5 מ"ל.
- חבר את המזרק עם תמיסת מבשר הג'ל לכניסה המימית באמצעות מחט 25 גרם. פזרו בעדינות מספיק תמיסה כדי להכין את הצינורות ואת הערוץ המיימי.
- הידקו את המזרקים למשאבות המזרקים המתאימות ולחצו על המזרקים (ראו איור 4B). ודא שיש נוזל זורם הן בתעלות המימיות והן בתעלות השמן.
הערה: מומלץ להשתמש במיקרוסקופ כדי להמחיש היווצרות מיקרוג'ל בתוך התקן PDMS. - חפשו חלקיקים בגודל אחיד מהתעלות (ראו איור 4D). לאסוף את microgels מן השקע בצינור חרוטי.
איור 4: מערך מיקרופלואידי. (A) תיאור השיטה לחיבור צינורות PEEK (למעלה) וצינורות טייגון למחט 25 G על מזרק (למטה). (B) מערך מיקרופלואידי עם משאבות מזרק, צינורות, מכשיר ומיקרוסקופ. (C) תמונה של מערך התקנים מיקרופלואידיים, עם שני פתחים (מימיים ושמן) ושקע אחד. (D) סכמטי של ההתקן המיקרופלואידי ותמונת שדה בהיר מייצגת של היווצרות מיקרוג'ל צפויה מהתעלות בהתקן תחליב צעד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
5. טיהור ועיקור של מיקרוג'לים
- לאחר השלמת הג'לציה (נקבעת כזמן לאחסון רמת מודולוס באפיון קינטיקה של ג'לציה), השתמשו בפיפטה כדי להסיר בזהירות את שלב השמן מתחתית הצינור (ראו איור 5). הפקידו זאת במיכל פסולת מתאים לפסולת פלואור.
הערה: ניתן להאיץ את זמן הג'לציה על ידי הוספת בסיס מסיס אורגני לצינור האיסוף (למשל, טריאתילאמין), אך חשוב לציין כי תוספת של בסיס חזק עלולה לבצע הידרוליזה של כל מלימידים שלא הופעלו. אם רוצים לתפקד מיקרו-ג'לים באמצעות עודף מלימידים לאחר ג'לציה, דלגו על תוספת של טריאתילאמין. - הוסיפו עוד שמן לצינור איסוף המיקרוג'ל ביחס של 1:1. מערבבים על ידי היפוך עדין של צינור האיסוף. אל תערבבו.
- תנו לצינור האיסוף להתיישב למשך ~ 5 דקות כדי לאפשר לפאזות להיפרד. חפשו את שלב השמן בתחתית ואת הפאזה המימית (המיקרו-ג'לים) בחלק העליון (ראו איור 5).
- חזור על שטיפת השמן לפחות פי 2 יותר.
- הוסיפו עוד שמן ביחס של 1:1 עם הג'ל והוסיפו PBS אחד ביחס של 4:1 PBS לג'ל. הפוך כדי לערבב מספר פעמים. כדי להפריד את השכבות, צנטריפוגה את הצינור ב ~ 2,000 x גרם עבור ~ 30 שניות. חפשו את שלב השמן בתחתית הצינור, ג'ל באמצע ו-PBS למעלה (ראו איור 5).
- מוציאים את שלב השמן עם פיפטה ומשליכים למיכל פסולת.
הערה: אל תסיר את PBS. השתמש בצינור חרוטי גדול יותר כדי להמשיך לשטוף אם צינור האיסוף המקורי היה 15 מ"ל. - שמן חוזר ו-PBS שוטף פי 2 יותר. חפשו את הג'ל כדי לעבור מאטום לשקוף עד הכביסה הסופית, כפי שמוצג באיור 5, מה שמצביע על כך שהחומר פעילי השטח הוסר והג'ל נמצא בשלב PBS.
- הסר את כל השמן. אין להסיר PBS מהצינור החרוטי.
- במכסה אדים כימי, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף הקסנים לצינור בנפח שווה ל- PBS. מערבבים את הצינור החרוטי במשך 30 שניות או עד לערבב היטב. צנטריפוגה ב 4,696 x גרם במשך 5 דקות.
- לאחר ההפרדה, חפשו הקסנים בשכבה העליונה, PBS באמצע וג'ל בתחתית (ראו איור 5). מוציאים את שכבת ההקסאן ומשליכים אותה למיכל לפסולת אורגנית. שאפו את ה-PBS.
- יש לחזור על הקסאן ושטיפת PBS לפחות פי 2 יותר או עד שהג'ל נראה כמעט שקוף (ראו איור 5). שטפו את הג'ל עם PBS פי 1 יותר כדי שכל ההקסנים הנותרים יוסרו. צנטריפוגה ב 4,696 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את שכבת ה-PBS. היזהר לא להפריע כדור ג'ל.
- כדי לכסות, או להרוות, כל maleimides unacted במיקרוג'לים, להכין תמיסה 100 mM של N-אצטיל-L-ציסטאין ב 1x PBS ולהוסיף פתרון זה לג'ל. יש להניח על מסובב צינורות בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה, ולאחר מכן לשטוף שטיפות רבות עם PBS כדי להסיר N-אצטיל-L-ציסטאין ללא תגובה.
- לאחסון לטווח ארוך (עד שנה), יש להשעות את המיקרוג'לים ב-70% IPA ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לסייע במניעת צמיחת חיידקים על המיקרו-ג'לים.
- כדי לעקר את המיקרו-ג'לים, יש להוסיף לג'ל 70% IPA ביחס של 4:1 v/v במכסה מנוע בטיחות ביולוגית. מערבבים את הצינור במשך 30 שניות, ואז צנטריפוגה ב 4,696 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את ה-IPA מכדור הג'ל במכסה מנוע בטיחותי. בצע פי 2 יותר שטיפות IPA ולאחר מכן 3x כביסות עם PBS סטרילי אחד.
הערה: יש להסיר את כל ה-IPA לפני השימוש בג'ל עם תאים או בעלי חיים.
איור 5: סקירה כללית של הליך טיהור המיקרוג'ל. קיצורים: PBS = מלח עם מאגר פוספטים; IPA = אלכוהול איזופרופיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
6. אפיון גודל מיקרוג'ל
הערה: מומלץ לאפשר לחלקיקי מיקרוג'ל להתאזן ב-PBS 1x למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להתנפח לקוטר הסופי שלהם לפני גודלם.
- חלקיקי ג'ל תמונה.
- סובבו את ג'ל ה-MAP ב-4,696 × גרם למשך 5 דקות ושאפו את הסופר-נטנט.
- באמצעות פיפטה תזוזה חיובית, הסר 5 μL של מיקרוג'לים מכדור הג'ל ודלל ב 1 מ"ל של PBS בצינור microcentrifuge (1:200 דילול). התאם דילול זה לפי הצורך.
הערה: במהלך הניסוח של תמיסת מבשר הג'ל, ניתן להוסיף 5 μM של ביוטין-מלימיד ולהשתמש בו כחלופה לסימון מיקרו-ג'לים עם פלואורופור. במקרה זה, ניתן להוסיף סטרפטאבידין-פלואורופור בדילול של 1:300 (ממלאי של 1 מ"ג/מ"ל). אפשר דגירה עם סטרפטווידין לפחות 15 דקות לפני ההדמיה. - באמצעות פיפטה תזוזה חיובית, להעביר 100 μL של microgels מדולל לבארות של צלחת ברורה 96 באר.
- השתמש במיקרוסקופ שדה רחב או קונפוקלי כדי לדמיין את המיקרו-ג'לים עם מטרה של פי 10. לרכוש תמונות של microgels לניתוח.
- ראו איור 6 עבור תמונות קונפוקליות מייצגות של מיקרו-ג'לים.
- גודל חלקיקים עם ImageJ
- פתח את קובצי התמונה מהמיקרוסקופ ב- ImageJ.
- בחר נתח | קבעו קנה מידה וקבעו את קנה המידה של התמונה בהתאם למטרת המיקרוסקופ.
- בחר תמונה | סוג | 8 סיביות.
- בחר תמונה | התאמת | סף ולאחר מכן בחר באפשרות הסף האוטומטי "Otsu" מהתיבה הנפתחת.
- לחץ על נתח | קבעו מידות ובחרו בקוטר של Feret והגבל לסף.
- לחץ על נתח | נתחו חלקיקים והזינו את טווח גודל השטח (בפיקסל^2) הצפוי למיקרו-ג'לים (כדי למנוע ניתוח של פסולת קטנה). שנה את המעגליות ל- 0.75-1.00 ובחר הצג | קווי מתאר. בדוק את תוצאות התצוגה ואל תכלול בקצוות.
הערה: מסנן צורת המעגליות אינו כולל מיקרו-ג'לים בגבול התמונה שעלולים להניב מדידת קוטר לא מדויקת. - הפעל את מודול ניתוח החלקיקים .
- המתן לפלט, שהוא הקוטר של ה-Feret של כל חלקיק, וייצא את התוצאות הללו לגיליון אלקטרוני.
- בפרוטוקול זה, חשב את מדד הפולידיספרסיות (PDI) כדי לקבוע את ההטרוגניות בגודל המיקרוג'ל. נתחו לפחות 100 מיקרו-ג'לים כדי להגדיר אוכלוסייה: טווח PDI של 1.00-1.05 מגדיר אוכלוסייה חד-ממדית, ו-PDI גדול מ-1.05 מגדיר אוכלוסייה רב-ממדית. השתמש במשוואה (2), במשוואה (3) ובמשוואה (4) כדי לחשב את ה- PDI, כמתואר להלן.
(2)
(3)
(4)
(2)
(3)
(4)
איור 6: תמונות מייצגות של מיקרו-ג'לים. (A) תמונה קונפוקלית פלואורסצנטית של אוכלוסיית מיקרוג'ל A, (B) תמונה של מיקרו-ג'לים סף, ו-(C) קווי מתאר של חלקיקים לאחר ניתוח ImageJ. (D) תמונה קונפוקלית פלואורסצנטית של אוכלוסיית מיקרוג'ל B ו-(E) מועברת תמונת אור של מיקרו-ג'לים (מיקרו-ג'לים הם כמעט שקופים). (ו) תיאור התוצאות המייצגות מניתוח ImageJ המתואר בפרוטוקול זה. לשתי אוכלוסיות המיקרו-ג'ל יש PDIs חד-ממדיים יחסית. שתי אוכלוסיות המיקרו-ג'ל סונתזו עם קצב זרימה מימי של 3 מ"ל/שעה וקצב זרימת שמן של 6 מ"ל/שעה. עם זאת, ההבדל בגודל המיקרוג'ל נובע מהבדלים בגודל הצעד של המכשיר המיקרופלואידי. לדוגמה, אוכלוסיית מיקרוג'ל A סונתזה עם מכשיר מיקרופלואידי בגודל שלב תעלה של 11 מיקרומטר, ואוכלוסיית מיקרוג'ל B סונתזה במכשיר בגודל צעד של 40 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: PDI = אינדקס פולידיספרסיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
7. חישול חלקיק מיקרו-נקבובי (MAP) חישול פיגומים
- צור תמיסת מלאי של 2 mM ליתיום פניל-2,4,6-טרימתילבנזואיל-פוספינאט (LAP) ב-PBS אחד (pH 7.4).
- דלל את תמיסת מלאי ה-LAP ל-0.2 mM בנפח של 1x PBS השווה לנפח הג'ל. אם אתם משתמשים בפוטו-אינטואיטור LAP למחקרי תאים או למחקרים בבעלי חיים, הקפידו לעקר את התמיסה לפני השימוש.
- סובבו את ג'ל ה-MAP ב-4,696 × גרם למשך 5 דקות ושאפו את הסופר-נטנט.
- באמצעות פיפטה עקירה חיובית, להעביר את הנפח הרצוי של ג'ל לתוך צינור microcentrifuge.
- יש להוסיף לג'ל 0.2 mM LAP ביחס נפחי של 1:1 (ריכוז ההקפה הסופי הוא 0.1 mM).
- מערבבים את התערובת ודוגרים לפחות 15 דקות בחושך.
- צנטריפוגה את התערובת ב 18,000 × גרם במשך 5 דקות כדי לזרוק את הג'ל.
- הסר בזהירות את הסופרנטנט מכדור הג'ל.
- העבר את ג'ל MAP למיקום היעד עם פיפטה תזוזה חיובית.
- יש למרוח אור ממוקד (365 ננומטר, 8.66mW/cm2) על הדגימה במשך 113 שניות כדי להעלים את הפיגום.
הערה: זמן החישול של 113 שניות עבר אופטימיזציה כפי שפורסם בעבר עבור ריכוז LAP של 0.1 mM14, אך ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה נוספת עבור ריכוזי פוטו-יניטיטורים שונים.
איור 7: חישול פיגומי MAP. (A) סכמת חישול פיגומי MAP. כאשר הם נחשפים לפוטו-אינטואיטור ולאור, הקבוצות הפונקציונליות של מתקרילאמיד על המאקרומר MethMAL עוברות תגובת פוטופולימריזציה בלחיצה, שמחברת את פני השטח של המיקרו-ג'לים זה לזה. (B) תיאור של עיבוד תלת-ממדי (Imaris) של תמונת מיקרוסקופ דו-פוטונית של מיקרו-ג'לים של MAP (ירוק) מחושלים יחד בצורת פאק תלת-ממדי, עם דקסטרן (אדום) בנקבוביות. (C) תיאור של עיבוד תלת-ממדי (Imaris) של תמונה ממיקרוסקופ דו-פוטוני המציגה את הנקבוביות של פיגום MAP שהוחדר עם דקסטרן פלואורסצנטי של 70 kDa (אדום). סרגלי קנה מידה = (B) 100 μm, (C) 70 μm. קיצורים: MAP = חלקיק חישול מיקרו-נקבובי; MethMAL = מקרומר חישול מותאם אישית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Representative Results
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את כל השלבים הדרושים לסינתזה של אבני בניין של מיקרוג'ל לשימוש בפיגום MAP. המאקרומר לחישול MethMAL הוא סלקטיבי ויעיל ביותר ותואם לעמודי שדרה פולימריים מרובים14. חשוב שלפחות 67%-75% מ-20 kDa PEG-maleimide ישונו עם קבוצות פונקציונליות של מתקרילאמיד כדי להבטיח יעילות חישול גבוהה. ניתן לקבוע בקלות רבה ביותר את אחוזי השינוי על-ידי ניתוח פסגות ספקטרום H-NMR 1, כפי שניתן לראות באיור 1. קינטיקה של ג'לציה, הנקבעת על ידי ויסקומטר, היא מדד חשוב שיש לקחת בחשבון עבור כל נוסחת ג'ל. פרוטוקול זה משתמש בתמיסת מבשר ג'ל המורכבת מעמוד שדרה PEG עם קבוצת MAL, אשר מגיבה ביעילות עם קרוסלינקרים פונקציונליים של תיול עבור ג'לציה של מיקרוג'ל. עם זאת, ניתן להשתמש בכימיה הידרו-ג'ל רבות כדי לייצר מיקרו-ג'לים באמצעות השיטה המיקרופלואידית בעלת התפוקה הגבוהה המתוארת כאן. הזמן לתחילת הג'לציה יספק תובנה לגבי משך יצירת המיקרוג'ל המיקרופלואידי. מומלץ לבחור pH מבשר ג'ל שיכול ליזום ג'לציה בין 30 דקות (איור 2) לשעתיים.
אם זמן הג'לציה מהיר מדי, תמיסת מבשר הג'ל תתחיל להתפלמר בתוך המכשיר המיקרופלואידי ולסתום את הערוצים. בנוסף, חשוב לציין כי שינוי ריכוזי ליגנד thiolated (למשל, RGD) עשוי להיות בעל השפעה על היווצרות הרשת במהלך ג'לציה וייתכן שיהיה צורך לקחת בחשבון על ידי התאמת הפורמולציה. שלבי הייצור של המכשיר המיקרופלואידי יכולים להיות מייגעים, אך תוצאות מייצגות של מכשיר מלוכד בהצלחה מוצגות באיור 3. פרוטוקול זה משתמש בהתקן מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה, מקבילי, תחליב שלבים, שהותאם מתכנון על ידי de Rutte et al.13, וייצור פרוסות הסיליקון הועבר למיקור חוץ לחברת טכנולוגיה מיקרופלואידית. עם זאת, ניתן להשתמש בשלבים המתוארים בפרוטוקול זה עם כל עיצוב מכשיר החרוט על מסכת פוטו-מסכת פוטו-מסכת פרוסות סיליקון SU-8. חשוב לציין כי יש לייעל את גודל הצעד של התעלות על מסכת הצילום במהלך ייצור המכשיר, שכן הוא ישפיע על גודל חלקיקי המיקרוג'ל.
יש למטב את קצבי הזרימה עבור הדור המיקרופלואידי של המיקרו-ג'לים עבור כל פורמולציה של ג'ל בהתבסס על גורמים כגון זמן הג'לציה, גודל החלקיקים הרצוי ותכנון המכשיר המיקרופלואידי. אם משתמשים בהתקן בעל תפוקה גבוהה, קצבי הזרימה של הפאזה המימית יכולים להגיע עד 5 מ"ל/שעה. איור 4B מציג את ההגדרה עבור התקנים בעלי תפוקה גבוהה המשמשים בפרוטוקול זה. אם המכשיר פועל כראוי, תצורת המיקרוג'ל אמורה להיראות דומה לזו המוצגת באיור 4D. לפני הטיהור, המיקרוג'לים יהיו אטומים. לאחר השלמת שטיפת השמן, ה-PBS וההקסאן השונים, הג'ל צריך להיראות צלול כמו התמונה המייצגת באיור 5. אם משלבים פלואורופור במיקרו-ג'לים, המוצר המטוהר עשוי להיות בעל גוון צבעוני קל, אך עדיין צריך להיות קרוב לשקוף. לאחר טיהור ונפיחות, המיקרו-ג'לים צריכים להיות אחידים מאוד בגודלם ולהיות בעלי PDI בין 1.00 ל-1.05, כפי שמוצג באיור 6. ניתן להשתמש בפוטו-אינטטורים שונים לפוטו-אניה של פיגומי MAP. אם משתמשים באלטרנטיבה ל-LAP, המתוארת כאן, יש לקבוע את קינטיקה החישול כפי שתואר קודם לכן14. בנוסף, ניתן להשתמש במקורות אור שונים לצורך פוטואניה, כל עוד מקור האור מתכתב עם הפוטו-איניטיטור. יש להקפיד על כיול ומיקוד מקור האור. ייתכן שיהיה צורך למטב את זמן החישול ואת עוצמת האור בהתבסס על נוסחת ג'ל וריכוז פוטו-איניטיטור. שיטת החישול המתוארת בפרוטוקול זה יכולה לשמש למחקרי in vitro ו- in vivo. לאחר החישול, המיקרו-ג'לים ייצרו פיגום נקבובי שניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים (איור 7B-C).
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטות לסינתזה ואפיון של מיקרוג'לים, המשמשים כאבני הבניין של פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP). פרוטוקול זה משתמש בגישה מיקרופלואידית בתפוקה גבוהה כדי ליצור כמויות גדולות של מיקרו-ג'לים אחידים, שלא ניתן להשיגם בשיטות אחרות כגון מיקרופלואידיקה ממוקדת זרימה 1,4,7,9 (חד-תפרחת גבוהה, תפוקה נמוכה), תחליב אצווה 6,10 ואלקטרו-ריסוס 5,12 (מונודיספרספריות נמוכה, תשואה גבוהה). בשיטות המתוארות כאן, ניתן ליצור מיקרו-ג'לים חד-ממדיים לשימוש בפיגומי MAP שיכולים לשמש למגוון יישומים של רפואה רגנרטיבית (למשל, מסירת תאים, ריפוי פצעים).
שלב קריטי של פרוטוקול זה הוא יצירת התקנים מיקרופלואידיים PDMS. אם המכשירים אינם מיוצרים כראוי, זה יכול להיות השפעות שליליות במורד הזרם על היווצרות microgel ו monodispersity. חשוב למנוע הכנסת חפצים (כלומר, בועות, אבק) ל-PDMS לפני שהוא נרפא, שכן הדבר עלול לסתום את התעלות ולהשפיע באופן משמעותי על היווצרות המיקרוג'ל. כדי למתן זאת ככל האפשר, יש להשתמש בנייר דבק כדי להסיר אבק, לאחסן את המכשירים במיכל ללא אבק, ולעבוד במכסה מנוע ללא אבק, במידת האפשר. מומלץ גם לאחסן את המכשירים ב 60 מעלות צלזיוס לקבלת התוצאות הטובות ביותר עם הטיפול במשטח.
כאשר שופכים את מכשירי PDMS, חשוב לשמור על עובי אחיד כי הוא בערך שווה או פחות מאורך אגרוף הביופסיה. אם המכשיר עבה מדי, אגרוף הביופסיה לא יוכל לחדור עד הסוף. כמו כן, חשוב מאוד לא לקרוע את הכניסות/שקעים של מכשיר ה-PDMS בזמן הניקוב עם ניקוב הביופסיה ו/או הכנסת צינורות. קרע בהתקן PDMS יגרום לדליפה מהפתחים/שקעים, מה שעלול לגרום לאובדן התמיסה המבשרת של הג'ל. אם יש דליפה בהתקן PDMS, הפתרון הטוב ביותר הוא להחליף אותו במכשיר חדש במהירות האפשרית.
כאשר מטפלים בפלזמה במכשיר, השימוש בחמצן טהור ובטיפול בפלזמה במשך 30 שניות הניב את התוצאות הטובות ביותר להדבקת PDMS למגלשת הזכוכית. אם המכשיר אינו נקשר כראוי (כלומר, עדיין ניתן להרים את ה- PDMS ממגלשת הזכוכית לאחר טיפול בפלזמה), יש לבדוק שוב כי מטפל הפלזמה פועל כראוי וכי המכשיר והשקופיות נוקו ביסודיות. כמו כן, חשוב להשתמש בטיפול הנכון במשטח סילאן, ולקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לטפל במכשירי PDMS ישירות לפני השימוש. ניתן להשתמש גם בשיטות אחרות של טיפול פני השטח, כגון תצהיר אדים כימיים.
צעד מכריע נוסף הוא שימוש נכון בהתקנים המיקרופלואידיים של PDMS ליצירת מיקרוג'ל. מומלץ להשתמש ביחס קצב זרימה של לפחות 2:1 (פרוטוקול זה משתמש בקצב זרימת שמן של 6 מ"ל/שעה ובקצב זרימה מימי של 3 מ"ל/שעה), אך ניתן לכוונן זאת כדי להשיג את גודל המיקרוג'ל הרצוי. ה- pH של תמיסת מבשר המיקרוג'ל הוא גם מדד חשוב לאופטימיזציה כדי למנוע סתימה של המכשיר. תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) מאיצה את היווצרות התיולאט בכימיה של תוספות מסוג מייקל, וריכוזי ה-PBS המשמשים בפרוטוקול זה מניבים את התוצאות הטובות ביותר עבור ג'לציה של מיקרו-ג'ל בהתקנים המיקרופלואידיים. ברגע שמשאבות המזרק מתחילות, ייתכן שיש כמה בועות בתעלות microfluidic, אבל זה צריך שיווי משקל לאחר כמה דקות. מומלץ לעקוב אחר היווצרות מיקרוג'ל באמצעות מיקרוסקופ. אם הזרימה לא נראית דומה לזו ו/או שיש כמה ערוצים שמייצרים חלקיקים גדולים, סביר להניח שזה נובע מבעיות בשלב הטיפול במשטח. הפתרון הטוב ביותר הוא להחליף את המכשיר באחד שעבר טיפול טרי על פני השטח.
אם נראה שהמיקרו-ג'לים מתלכדכים, ייתכן שהסיבה לכך היא ריכוז לא מספיק של FluoroSurfactant. הפתרון המומלץ הוא להגדיל את ה-wt% של חומר פעילי השטח בשלב השמן. עם זאת, מגבלה אחת לשימוש בריכוזים גבוהים של חומרים פעילי שטח היא שזה יכול להיות קשה יותר להסיר אותו במהלך שלב הטיהור. מומלץ להשתמש במכשירים מיקרופלואידיים פעם אחת בלבד, אך ניתן לעשות שימוש חוזר במכשירים אם שוטפים אותם בשמן נובק מיד לאחר השימוש כדי להסיר כל תמיסה מימית שעלולה לסתום את המכשיר ולסתום את הערוצים. בעוד שהתקן מיקרופלואידי אחד יכול לייצר נפח תפוקה גבוה של מיקרו-ג'לים (מ"ל/שעה), ניתן להגדיל את קצב הייצור הזה על ידי שימוש במספר התקנים מיקרופלואידיים במקביל.
שלב החישול של מכלול פיגומים MAP מסתמך על שימוש בפוטו-אינטליטור המופעל על ידי אור של פילמור רדיקלי, וניתן לבחור את הפוטו-אינטליטור על סמך היישום הרצוי. לדוגמה, לפוטו-איניטיטור LAP יש זמני חישול מהירים (<30 שניות) בעת שימוש באור UV בגל ארוך, בעל השפעה מינימלית על כדאיות התא במבחנה14. עם זאת, אורך גל זה נספג מאוד על ידי רקמה16 וייתכן שאין לו יעילות חישול גבוהה כמו in vitro.
Eosin Y הוא פוטו-איניטיטור נוסף המופעל על ידי אורכי גל נראים לעין (505 ננומטר) ויש לו חדירה עמוקה יותר לרקמה, מה שמשפר את היכולת של פיגום MAP להיות חישול מתחת לרקמה. עם זאת, זמני החשיפה הארוכים לאור הדרושים לחישול Eosin Y עשויים להאריך את חשיפת התאים לרדיקלים חופשיים ולהשפיע על הכדאיות של התאים במבחנה14. שימוש בשיטות אלה ליצירת תפוקה גבוהה של אבני בניין מיקרוג'ל אחידות במיוחד יאיץ את המחקר הממוקד בפיגומים של MAP ויקדם את הידע בתחום החומרים הנקבוביים הניתנים להזרקה לרפואה רגנרטיבית.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לג'ו דה רוטה ולמעבדת די קרלו באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס, על עזרתם בתכנון המכשיר המיקרופלואידי המקורי שממנו פותח המכשיר המדווח, כמו גם על הדרכתם המוקדמת בייצור ופתרון בעיות במכשירי PDMS. סכמות איורים נוצרו עם Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148 (2020).
- de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
- Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).
